周湘琳 王冬含 施根根 趙良功 封士蘭*

1.蘭州大學(xué)藥學(xué)院，甘肅 蘭州 730000

2.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000

骨質(zhì)疏松癥是一種由多種原因引發(fā)的骨骼退化性疾病，以骨微觀結(jié)構(gòu)退化、骨脆性增加為特色[1]。該病在西醫(yī)治療方面主要用藥有鈣劑、雌激素、降鈣素、氟制劑等，均具有很大的不良反應(yīng)或療效不顯著等問題[2]。隨著研究不斷地深入，在治療骨質(zhì)疏松方面中醫(yī)藥展現(xiàn)出一定的臨床價(jià)值，并且能夠有效避免西藥所產(chǎn)生的一系列不良反應(yīng)[3]。補(bǔ)腎健骨方是由從事中藥及骨質(zhì)疏松研究的權(quán)威專家擬得的經(jīng)驗(yàn)方，在長期臨床實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)具有療效確定、安全性好的特點(diǎn)。筆者前期的研究結(jié)果表明[4]，補(bǔ)腎健骨方能顯著提高骨質(zhì)疏松模型大鼠的骨密度，增強(qiáng)骨質(zhì)疏松大鼠的骨斷裂點(diǎn)的最大載荷和彈性模量。因此本實(shí)驗(yàn)以大鼠顱骨成骨細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞為研究對象，檢測補(bǔ)腎健骨方對其增殖和成骨分化、礦化的影響，從細(xì)胞水平探討補(bǔ)腎健骨方治療骨質(zhì)疏松癥的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物：3月齡 SD 雌性大鼠，體質(zhì)量180～220 g；2月齡 SD 雄性大鼠，體質(zhì)量 120～170 g；出生48 h 以內(nèi)SD 大鼠乳鼠，體質(zhì)量 25～30 g；動物許可證號 SCXK(甘)2013-0002，均由蘭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。

1.1.2試劑：胎牛血清(上海翊圣生物科技有限公司，批號：20190502)；DMEM 高糖培養(yǎng)基(批號：B4296)、DMEM/F12(批號：B5172)培養(yǎng)基均購自Hyclone公司；地塞米松(批號：A5903-16)、抗壞血酸(批號：A3033-27)、β-甘油磷酸鈉(批號：A5719-52)均購自索萊寶公司；ALP 試劑盒(批號：20180614)購自南京建成生物工程研究所；CD45、CD29、CD44 抗體(賽默飛世爾科技中國有限公司，批號：4226388，1937542，1974258)兔抗小鼠Ⅰ型膠原和山羊抗兔IgG-cy3抗體(武漢博斯特生物工程有限公司，批號：D397，B332)。

1.1.3儀器：Vaioskan Flash 多功能酶標(biāo)儀(美國賽默飛世爾公司)；Attune Nxt 流式細(xì)胞儀(賽默飛世爾科技中國有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1大鼠實(shí)驗(yàn)分組及補(bǔ)腎健骨方含藥血清的制備[5]：3月齡雌性SD大鼠30只，隨機(jī)分成無藥血清對照組、補(bǔ)腎健骨方含藥血清組、陽性藥含藥血清組，每組10只。補(bǔ)腎健骨方依據(jù)處方量(紅芪∶熟地∶女貞子∶枸杞∶懷牛膝=2∶1∶1∶1∶1)稱取藥材，用10倍量的水煎煮3次，前兩次每次1.5 h，第3次1 h，合并3次濾液濃縮至浸膏。陽性藥對照組給予戊酸雌二醇，以0.2 mg/(kg·d)的劑量每日灌胃。補(bǔ)腎健骨方給藥劑量按照體表面積的方法折算人體等效計(jì)量，以9 g/kg生藥計(jì)算用藥量，連續(xù)灌胃 7 d，每日灌胃 2 次，于末次給藥后2 h，經(jīng)眼眶靜脈叢采血。所得血液靜置1 h 后，3 000 r/min離心10 min，分離上層血清。為了減輕大鼠的個(gè)體差異，同組動物血清合并。56 ℃ 水浴 30 min滅活補(bǔ)體，0.22 μm微孔濾膜除菌，分裝，-20 ℃儲存?zhèn)溆?。傳統(tǒng)誘導(dǎo)組給予細(xì)胞的藥物為普通胎牛血清。

1.2.2ROBs細(xì)胞的分離培養(yǎng)與鑒定[6]：10只SD大鼠乳鼠，無菌分離顱骨。PBS漂洗顱骨2遍，用剪刀將其剪碎為1～2 mm3。將含有碎骨片的培養(yǎng)瓶中加入0.25%胰蛋白酶2 mL，恒溫震蕩10 min于37 ℃水浴鍋中，棄去消化液，共重復(fù)2次。加入1 mg/mL Ⅱ型膠原酶2 mL，恒溫震蕩消化15 min于37 ℃水浴鍋中，共重復(fù)6次，合并最后4次的上清液。將上清液通過200目細(xì)胞篩過濾并加入含有10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，吹打均勻。利用免疫組織化學(xué)技術(shù)對分離的成骨細(xì)胞進(jìn)行鑒定。

1.2.3rBMSCs分離培養(yǎng)與鑒定：5只Wistar雄性大鼠被脫頸處死，無菌環(huán)境中剔出股骨和脛骨，兩端骨骺被剪去，用針頭從一側(cè)切口向髓腔內(nèi)滴注DMEM/F12培養(yǎng)液，當(dāng)骨髓腔變?yōu)橥该鲃t為沖洗干凈，合并沖出液，反復(fù)吹打以致細(xì)胞團(tuán)塊被打散[7]。200目的濾網(wǎng)反復(fù)過濾用來得到單細(xì)胞懸液，細(xì)胞密度調(diào)整至1.0×107個(gè)/mL。選取rBMSC細(xì)胞表面標(biāo)志物CD29、CD44、CD45進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析，對rBMSC進(jìn)行鑒定。

1.2.4細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)：細(xì)胞以1×104細(xì)胞/孔接種于96孔板中。12 h后更換含不同濃度含藥血清(5%、10%、15%、20%、25%)、空白對照大鼠血清以及陽性對照含藥血清、胎牛血清的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h，棄培養(yǎng)液，PBS洗2次。利用MTT法測試ROBs和rBMSCs增殖率。增殖率=A加藥/A對照。

1.2.5細(xì)胞分化實(shí)驗(yàn)：24孔板中接種原代細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞長至90%后，普通培養(yǎng)基更換為誘導(dǎo)成骨培養(yǎng)基(含有抗壞血酸50 mg/L，地塞米松 1×10-8mol/L和10 mmol/L β-甘油磷酸鈉)[8]，藥物分組同上，誘導(dǎo)培養(yǎng)3、6、9 d后采用ALP試劑盒測定兩種細(xì)胞的ALP活力。

1.2.6細(xì)胞礦化實(shí)驗(yàn)：12孔板中接種原代細(xì)胞，細(xì)胞長滿后給予成骨培養(yǎng)基誘導(dǎo)，成骨性誘導(dǎo)分化 14 d后進(jìn)行茜素紅染色。拍照記錄結(jié)果，Image-Pro Plus 6.0 軟件處理圖片。

2 結(jié)果

2.1 補(bǔ)腎健骨方含藥血清對ROBs的作用

2.1.1ROBs的鑒定：ALP染色結(jié)果表明，成骨細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)的細(xì)胞質(zhì)中存在淺棕色堿性磷酸酶顆粒，如圖1A所示。茜素紅染色顯示，該細(xì)胞經(jīng)成骨誘導(dǎo)后會產(chǎn)生橘紅色或橙紅色的礦化結(jié)節(jié)，如圖1B所示。I型膠原免疫熒光染色結(jié)果表明，紅色熒光存在于細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞核為藍(lán)色熒光，如圖1C、1D所示。

圖1 ROBs ALP、鈣化結(jié)節(jié)、I型膠原免疫熒光染色(×300)Fig.1 Immunofluorescence staining was used to detect ALP, calcified nodules, and type I collagen(×300)

2.1.2補(bǔ)腎健骨方含藥血清對ROBs增殖的影響：從圖2可以看出，給藥24、48、72 h后，不同濃度含藥血清對ROBs 均沒有細(xì)胞毒性作用，且隨著含藥血清濃度的增加，ROBs的增殖率也在逐漸增加。尤其當(dāng)含藥血清濃度為20%時(shí)，補(bǔ)腎健骨含藥血清極大地促進(jìn)了ROBs的增殖。但是當(dāng)濃度增加到25%時(shí)，ROBs的增殖率表現(xiàn)出一個(gè)下降的趨勢。

圖2 不同濃度補(bǔ)腎健骨含藥血清對ROBs增殖的影響Fig.2 Effect of different concentrations of nourishing kidney and strong bone recipe-containing serum on the proliferation of ROBs n=6)

2.1.3補(bǔ)腎健骨方含藥血清對ROBs ALP活性的影響：成骨細(xì)胞表型分化包括兩個(gè)階段，即骨形成過程的早期階段和后期階段。分化的早期特征包括ALP和膠原蛋白的相對表達(dá)。從圖3中可以看出，給藥3、6、9 d后，各濃度含藥血清均能夠提高ROBs ALP 活性，并顯著高于無藥血清組和傳統(tǒng)誘導(dǎo)組(P<0.05)，其最佳濃度為20%。

圖3 不同濃度補(bǔ)腎健骨含藥血清對ROBs ALP活性的影響Fig.3 Effect of different concentrations of nourishing kidney and strong bone recipe-containing serum on ALP activity of ROBs

2.1.4補(bǔ)腎健骨方含藥血清對ROBs鈣化結(jié)節(jié)形成的影響：細(xì)胞內(nèi)所含鈣鹽能夠被茜素紅所識別，給藥后ROBs產(chǎn)生的鈣化結(jié)節(jié)的數(shù)量和面積均極顯著高于無藥血清組和傳統(tǒng)誘導(dǎo)組，20%的濃度對ROBs的鈣化結(jié)節(jié)形成促進(jìn)作用最強(qiáng)。見圖4。

圖4 不同濃度補(bǔ)腎健骨含藥血清對ROBs鈣化結(jié)節(jié)形成的影響Fig.4 Effect of different concentrations of nourishing kidney and strong bone recipe-containing serum on calcified nodules activity of ROBs

2.2 補(bǔ)腎健骨方含藥血清對rBMSCs的作用

2.2.1rBMSCs的鑒定：流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示，rBMSCs經(jīng)培養(yǎng)后能夠均一表達(dá)CD29、CD44，陽性率分別為99.52%、99.31%；而CD45的陽性率為0.113%。見圖5。

圖5 rBMSCs表面標(biāo)志物CD29、CD44、CD45的表達(dá)Fig.5 Expression of surface markers CD29, CD44, and CD45 in rBMSCs

2.2.2補(bǔ)腎健骨方含藥血清對rBMSCs增殖的影響：給藥 24、48、72 h后，不同濃度的補(bǔ)腎健骨含藥血清對rBMSCs沒有細(xì)胞毒性作用。補(bǔ)腎健骨含藥血清濃度在10%時(shí)促進(jìn)rBMSCs的增殖效果是最顯著的。濃度繼續(xù)增加，增殖率呈現(xiàn)出下降趨勢，說明對于rBMSCs，10%含藥血清為最佳給藥濃度。見圖6。

圖6 不同濃度補(bǔ)腎健骨含藥血清對rBMSCs增殖的影響Fig.6 Effect of different concentrations of nourishing kidney and strong bone recipe-containing serum on the proliferation of rBMSCs

2.2.3補(bǔ)腎健骨方含藥血清對rBMSCs ALP活性的影響：rBMSCs經(jīng)成骨性誘導(dǎo)3 d后，僅5%和10%含藥血清組的ALP活性顯著高于相應(yīng)的無藥血清組和傳統(tǒng)對照組，其中10%含藥血清組的ALP活性最高。給藥6 d后，除25%含藥血清組外，其余各組的ALP活性均顯著高于相應(yīng)的無藥血清組。給藥9 d后，不同濃度的含藥血清均能提高rBMSCs ALP活性，并顯著高于無藥血清組和傳統(tǒng)誘導(dǎo)組，其中以10%含藥血清為最佳濃度。見圖7。

圖7 不同濃度補(bǔ)腎健骨含藥血清對rBMSCs ALP活性的影響Fig.7 Effect of different concentrations of nourishing kidney and strong bone recipe-containing serum on ALP activity of rBMSCs

2.2.4補(bǔ)腎健骨方含藥血清對rBMSCs鈣化結(jié)節(jié)形成的影響：給藥14 d后的鈣化結(jié)節(jié)染色結(jié)果與ALP活性檢測結(jié)果具有相似的趨勢。rBMSCs被不同濃度含藥血清作用后，其產(chǎn)生的鈣化結(jié)節(jié)的數(shù)量和面積均極顯著高于無藥血清組和傳統(tǒng)誘導(dǎo)組，10%含藥血清組對rBMSCs的鈣化結(jié)節(jié)形成促進(jìn)作用最強(qiáng)。見圖8。

圖8 不同濃度補(bǔ)腎健骨含藥血清對rBMSCs鈣化結(jié)節(jié)形成的影響Fig.8 Effect of different concentrations of nourishing kidney and strong bone recipe-containing serum on calcified nodules activity of rBMSCs

3 討論

中醫(yī)將絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥主要病因歸屬于骨痿、腰痛、骨痹等證[9]。補(bǔ)腎健骨方是由長期從事中藥及骨質(zhì)疏松研究的權(quán)威專家基于中醫(yī)理論擬得的經(jīng)驗(yàn)方，由紅芪、熟地、女貞子、枸杞、懷牛膝組成，具有滋補(bǔ)肝腎、補(bǔ)腎壯骨、益精填髓之功效，標(biāo)本兼顧[10]，能有效緩解骨質(zhì)疏松癥狀，已在臨床上被廣泛應(yīng)用。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，20%的補(bǔ)腎健骨方含藥血清更利于ROBs的生長增殖、分化礦化，10%的補(bǔ)腎健骨方含藥血清最利于rBMSCs生長增殖、分化礦化。本研究證實(shí)了補(bǔ)腎健骨含藥血清在體外能促進(jìn)ROBs和rBMSCs的增殖、骨形成和礦化能力。

王艷等[11]發(fā)現(xiàn)牛膝通過降低尿羥脯氨酸/肌酐值含量來改善大鼠骨密度及骨生物力學(xué)性能。枸杞多糖含藥血清通過激活β-catenin和Wnt10b等Wnt信號通路來改善BMSCs的成骨活性和礦化能力[12]。女貞子水提物能減少去卵巢誘發(fā)的大鼠股骨骨小梁形態(tài)破壞和BMD的降低[13]。林日陽等[14]發(fā)現(xiàn)熟地鱉甲含藥血清可以通過提高成骨細(xì)胞增殖、ALP含量及cbfa1 mRNA的表達(dá)。陳宇等[15]發(fā)現(xiàn)紅芪抗骨質(zhì)疏松作用與其所含各種成分共同作用相關(guān)。因此，推測補(bǔ)腎健骨方含藥血清對ROBs和rBMSCs的增殖、骨形成和礦化促進(jìn)作用，與其單味藥材治療骨質(zhì)疏松的作用有關(guān)。

總而言之，不同濃度的補(bǔ)腎健骨方含藥血清對ROBs和rBMSCs的增殖、骨形成和礦化均具有一定的促進(jìn)作用，其原因可能為此方劑在促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖的同時(shí)還能促進(jìn)破骨細(xì)胞的凋亡，從而達(dá)到對骨質(zhì)疏松進(jìn)行治療的目的。但本研究的藥理作用為動物細(xì)胞體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的直接結(jié)果，關(guān)于補(bǔ)腎健骨方含藥血清進(jìn)一步作用于人體的效果還需深入探討。