孫銀玲 陳麗艷 張蕾 王萍 綦菲 曹陽 王偉明*

1.黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150036

2.黑龍江護(hù)理高等?？茖W(xué)校，黑龍江 哈爾濱 150080

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是以骨量減少、骨組織微結(jié)構(gòu)破壞為特征的全身代謝性骨病，可導(dǎo)致骨脆性和骨折風(fēng)險增加[1]。2018年國家衛(wèi)生健康委員會對骨質(zhì)疏松進(jìn)行首次全國流行病學(xué)調(diào)查，結(jié)果顯示65歲以上老年人群骨質(zhì)疏松患病率高達(dá)32%[2]。因為潛在的破壞性結(jié)果和高的骨折累計率，骨質(zhì)疏松癥很大程度關(guān)系到社會老齡化問題[1，3]。

黃瓜籽又名哈力蘇，為葫蘆科植物黃瓜(Cucumis sativus L.)的種子[4]?！吨腥A本草》中記載其具有續(xù)筋接骨、祛風(fēng)、消痰的功效，主治骨折筋傷、風(fēng)濕痹痛、老年痰喘等癥[5]，在民間用于治療骨質(zhì)疏松癥也具有悠久的應(yīng)用歷史?，F(xiàn)代研究顯示黃瓜籽具有補(bǔ)鈣、壯骨、抗疲勞等多種功效，可藥食兼用而備受青睞[3]。本研究通過考察黃瓜籽總皂苷提取物(cucumber seed saponins，CSS)對小鼠成骨前體細(xì)胞MC3T3-E1增殖、分化、礦化的作用，以及對SPARC、OPG/RANKL/RANK信號通路mRNA和蛋白表達(dá)的影響，從細(xì)胞學(xué)水平探討黃瓜籽總皂苷促進(jìn)骨形成的作用機(jī)制，為其防治骨質(zhì)疏松癥的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞株和主要試劑

小鼠顱頂前成骨細(xì)胞MC3T3-E1(subclone 14)購于中國科學(xué)院細(xì)胞庫(貨號：GNM15)；α-MEM培養(yǎng)基(HyClone，Cat. No. SH30265.01B)，胎牛血清(四季青，低內(nèi)毒素)，0.25% Trypsin-EDTA(HyClone)；ALP活性檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)；兔多克隆抗體SPARC(ab203284)、兔多克隆抗體OPG(ab9986)、兔單克隆抗體RANKL(ab124797)及兔多克隆抗體β-actin(ab8227)(Abcam公司)；辣根酶標(biāo)記抗兔二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；DAB辣根過氧化物酶顯色試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒(TaKaRa公司)；GoTaq?PCR Master Mix試劑盒(Promega公司)。

1.2 藥物

黃瓜籽購于河北省康派中藥材有限公司，經(jīng)黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院王偉明研究員鑒定為葫蘆科植物黃瓜(Cucumis sativus L.)的干燥成熟種子，黃瓜籽總皂苷提取方法同參考文獻(xiàn)[6]。取100 mg黃瓜籽總皂苷提取物加入1 mL DMSO中制成100 mg/mL的儲備液，保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 方法

1.3.1MTT細(xì)胞增殖實驗：MC3T3-E1細(xì)胞培養(yǎng)(傳代、凍存和復(fù)蘇)按常規(guī)方法。將細(xì)胞以(3～5)×104個細(xì)胞/孔的密度接種于96孔板，分別加入180 μL不同濃度含藥無血清培養(yǎng)基，其中黃瓜籽總皂苷提取物(CSS)終濃度分別為10-1、10-2、10-3mg/mL，雷洛昔芬(raloxifene)終濃度1 μmol/L為陽性對照，0.1% DMSO為陰性對照，及不含細(xì)胞的空白組，每組設(shè)3個平行孔。繼續(xù)培養(yǎng)48 h，每孔加入20 μL MTT(5 mg/mL)，孵育4 h，棄去各孔液體，加入150 μL DMSO溶解，544 nm波長下測定各孔的吸光度。

1.3.2ALP活性檢測：細(xì)胞培養(yǎng)及給藥方法如1.3.1，按照ALP測定試劑盒提供方法檢測胞外ALP活性，在520 nm波長下測定樣品及標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度，ALP活力(金氏單位/100 mL)=7.14 U/L[7-9]。

1.3.3細(xì)胞鈣化結(jié)節(jié)數(shù)量測定：為誘導(dǎo)MC3T3-E1細(xì)胞分化為成熟的成骨細(xì)胞，細(xì)胞在含藥的成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基(含有10 mmol/L β-甘油磷酸鈉及50 μg/mL L-抗壞血酸的完全α-MEM培養(yǎng)基)培養(yǎng)28 d，每組設(shè)3個平行孔。培養(yǎng)結(jié)束后PBS清洗，加入無水乙醇固定10 min，雙蒸水清洗3次。加入0.5%茜素紅-Tris-HCl (pH=4.3)，于37 ℃染色30 min至1 h，雙蒸水沖洗后，利用顯微鏡每個樣本隨機(jī)選取10個視野進(jìn)行觀察[1，9-11]，應(yīng)用Image-Pro Plus6.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計。

1.3.4RT-PCR檢測基因表達(dá)：MC3T3-E1細(xì)胞在含藥的α-MEM完全培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)48 h，每組設(shè)3個平行孔。利用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，定量后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。RT-PCR反應(yīng)條件：①預(yù)變性 95 ℃ 2 min；②變性95 ℃ 15 s；③退火60 ℃ 1 min，共40 cycle；④延伸72 ℃，5 min。檢測SPARC、OPG、RANKL的基因表達(dá)，以β-actin為內(nèi)參，引物序列見表1。采用2-ΔΔCT法對基因進(jìn)行相對定量分析。

1.3.5Western blot檢測蛋白表達(dá)：MC3T3-E1細(xì)胞在含藥的α-MEM完全培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)48 h，每組設(shè)3個平行孔。提取各組細(xì)胞總蛋白，BCA法檢測蛋白質(zhì)濃度后，Western blot檢測β-actin、SPARC、OPG、RANKL的蛋白表達(dá)。孵育一抗β-actin(1∶1000)，SPARC(1∶1000)，OPG(1∶500)，RANKL(1∶1000)，選擇相應(yīng)的二抗孵育后，采用DAB辣根過氧化酶法顯色，利用Quantity One測定灰度值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 24 統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，采用GraphPad Prism 6作圖，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CSS對MC3T3-E1細(xì)胞增殖的影響

MC3T3-E1細(xì)胞加入各組藥物培養(yǎng)48 h后，結(jié)果表明(圖1)，與陽性對照組相比，CSS給藥組對MC3T3-E1的增殖作用隨著濃度的升高而顯著增強(qiáng)(P<0.05)。

2.2 CSS對MC3T3-E1細(xì)胞分化的影響

ALP是成骨早期的標(biāo)志物。結(jié)果如圖2所示，MC3T3-E1細(xì)胞加入各組藥物培養(yǎng)48 h后，與空白組相比，CSS及陽性對照組處理MC3T3-E1細(xì)胞后ALP活性均顯著升高(P<0.01)；與陽性對照組相比，10-1mg/mL、10-2mg/mL CSS作用于細(xì)胞后ALP活性明顯升高(P<0.05)。

圖2 不同劑量CSS對MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化的影響Fig.2 The effect of the different doses of CSS on the differentiation in MC3T3-E1 cells

2.3 CSS對MC3T3-E1細(xì)胞礦化的影響

茜素紅染色結(jié)果見圖3和表2，與空白組相比，CSS組和陽性對照組鈣化結(jié)節(jié)面積明顯增多(P<0.05)；與陽性對照組相比，CSS 10-1mg/mL和10-2mg/mL鈣化結(jié)節(jié)面積明顯增多(P<0.05)，CSS 10-3mg/mL差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

圖3 不同劑量CSS對MC3T3-E1細(xì)胞礦化的影響A：CSS 10-1mg/mL組；B：CSS 10-2mg/mL組；C：雷洛昔芬組；D：對照組Fig.3 The effect of different doses of CSS on cellular mineralization in MC3T3-E1 cellsA: CSS 10-1 mg/mL; B:CSS 10-2 mg/mL; C: Raloxifene; D:Control

表2 CSS對MC3T3-E1細(xì)胞礦化的影響Table 2 The effect of CSS on cellular mineralization

2.4 CSS對MC3T3-E1細(xì)胞OPG/RANKL及SPARC mRNA表達(dá)的影響

RT-PCR結(jié)果如圖4，與空白組相比，不同劑量的CSS組及陽性對照組SPARC、OPG/RANKL mRNA表達(dá)量均明顯增高(P<0.05)；與陽性對照組相比，CSS高劑量組SPARC、OPG/RANKL mRNA表達(dá)量明顯升高(P<0.05)。

圖4 不同劑量CSS對MC3T3-E1細(xì)胞SPARC、OPG/RANKL mRNA表達(dá)的影響Fig.4 The effect of CSS on SPARC and OPG/RANKL mRNAs in MC3T3-E1 cells

2.5 CSS對MC3T3-E1細(xì)胞OPG/RANKL及SPARC蛋白表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果見圖5，與空白組相比，CSS高、中劑量組及陽性對照組OPG/RANKL蛋白表達(dá)均明顯升高(P<0.05)；與陽性對照組相比，CSS高劑量組OPG/RANKL蛋白表達(dá)量明顯升高(P<0.05)。與空白組相比，不同劑量CSS組及陽性對照組SPARC蛋白表達(dá)量明顯升高(P<0.05)；與陽性對照組相比，CSS高、低劑量組SPARC蛋白表達(dá)量明顯升高(P<0.05)。

圖5 不同劑量CSS對MC3T3-E1細(xì)胞SPARC、OPG/RANKL蛋白表達(dá)的影響Fig.5 The protein expressions of SPARC and OPG/RANKL in MC3T3-E1 cells treatment with different doses of CSS

3 討論

骨組織是不斷重建的動態(tài)組織器官，其重建過程涉及血管的生成及局部骨微環(huán)境的構(gòu)建。重建過程由成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞介導(dǎo)，通過去除舊的骨組織并產(chǎn)生新的骨組織而不斷更新。目前針對骨質(zhì)疏松癥最理想的治療是在刺激新骨形成的同時，能夠糾正具有骨質(zhì)疏松特征的骨小梁微體系結(jié)構(gòu)失衡，為骨質(zhì)疏松癥的治療提供新的選擇[12]。

黃瓜籽中主要含有礦物質(zhì)元素、脂肪酸、糖類、苷類和植物甾醇類成分[4]，在民間多用于接骨壯骨，近幾年多項研究表明黃瓜籽具有抗骨質(zhì)疏松癥作用，章舒[13]研究發(fā)現(xiàn)黃瓜籽粉能夠預(yù)防絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥，且可能通過調(diào)節(jié)OPG/RANK/RANKL信號通路發(fā)揮作用。蔡偉明等[14]研究發(fā)現(xiàn)黃瓜籽多肽能夠促進(jìn)原代培養(yǎng)成骨細(xì)胞增殖、分化及礦化。李娜等[15]研究發(fā)現(xiàn)黃瓜籽乙酸乙酯提取物能夠提高M(jìn)G63細(xì)胞活性及ALP含量，并能夠促進(jìn)BMP-2表達(dá)。裴啟洋等[16]研究發(fā)現(xiàn)黃瓜籽不同提取部位均能促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，同時正丁醇、乙酸乙酯提取部位能夠提高成骨細(xì)胞的堿性磷酸酶活性及骨鈣素分泌，從而達(dá)到促進(jìn)骨形成和修復(fù)的目的。本研究通過考察黃瓜籽總皂苷提取物小鼠顱頂成骨細(xì)胞MC3T3-E1的增殖、分化及礦化作用，揭示黃瓜籽抗骨質(zhì)疏松的部分作用機(jī)制。

骨形成及骨吸收的平衡受多種細(xì)胞信號、激素及生長因子的調(diào)控，其中RANKL及其兩個受體RANK和OPG具有重要作用，在骨的微環(huán)境中成骨細(xì)胞表達(dá)OPG/RANKL的相對比例對于破骨細(xì)胞的活性至關(guān)重要，并且上調(diào)該比例能夠減少破骨細(xì)胞的分化及成熟，因而被認(rèn)為是骨質(zhì)疏松癥治療的一種策略[1，17]。SPARC也稱為骨粘連蛋白，在骨形成過程中由成骨細(xì)胞分泌，在調(diào)節(jié)骨骼重塑以及維持骨量方面起著重要作用，在細(xì)胞外基質(zhì)中，SPARC與膠原蛋白在骨骼中的沉積、礦物質(zhì)結(jié)合及骨基質(zhì)礦化密切相關(guān)。體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)無SPARC小鼠成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞數(shù)量減少，骨形成速率降低，骨流失速率增加，導(dǎo)致骨量減少[17]。因此，OPG/RANKL/RANK及SPARC在骨骼的重塑中起重要作用。

成骨細(xì)胞在骨形成中主要由增殖、分化和基質(zhì)礦化3個步驟組成。在細(xì)胞增殖和基質(zhì)成熟期，與成骨細(xì)胞表型和分化相關(guān)的特定蛋白ALP可以檢測到。ALP是成骨細(xì)胞的功能酶，能夠水解有機(jī)磷酸酯，使成骨細(xì)胞基質(zhì)中局部磷酸根濃度增加，促進(jìn)羥基磷灰石的形成、沉積、以及基質(zhì)的鈣化，同時水解焦磷酸，破壞鈣化抑制劑，從而啟動基質(zhì)鈣化[19-20]。

本研究以MC3T3-E1細(xì)胞的增殖、ALP活性、鈣化結(jié)節(jié)形成以及OPG/RANKL、SPARC表達(dá)為指標(biāo)，考察黃瓜籽總皂苷提取物對MC3T3-E1成骨樣細(xì)胞的影響。結(jié)果表明，黃瓜籽總皂苷在體外能夠促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞增殖、分化和礦化，并具有一定的劑量依賴性。高劑量的黃瓜籽總皂苷對于成骨重要因子SPARC及OPG/RANKL的比率均具有明顯的上調(diào)作用，提示其能促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，為黃瓜籽在骨質(zhì)疏松癥方面的應(yīng)用提供依據(jù)和基礎(chǔ)。