牛彪彪, 翟夢怡, 李揚

華南師范大學生命科學學院, 廣東省水產健康安全養(yǎng)殖重點實驗室, 廣東 廣州 510631

角毛藻屬(ChaetocerosEhrenberg)是海洋浮游硅藻中物種多樣性最為豐富的大屬之一, 廣泛分布于全球海域(Tomas et al, 1997)。依據角毛中是否含有色素體可劃分為兩個亞屬: 有色角毛藻亞屬Phaeoceros和無色角毛藻亞屬Hyalochaete(Hernández-Becerril,1996)。角毛藻是海洋浮游植物的優(yōu)勢類群(Tomas et al, 1997; Shevchenko et al, 2006), 也是重要的藻華生物(Tomas et al, 1997)。

塞舌爾角毛藻(C. seychellarusG.Karsten)隸屬于有色角毛藻亞屬, 是全球罕見種, 最初報道于印度洋(Karsten, 1907), 此后多年未見報道, 而近二三十年來在北美加利福尼亞沿岸、墨西哥灣以及印度洋開始有零星報道(Hernández-Becerril, 1993; Hernández-Becerril et al, 1998)。韓國近年亦曾有報道, 該報道中研究者利用光鏡在自然樣品中觀察到了少數群體,所提供的有效形態(tài)特征相對有限(Lee, 2011)。以往對于塞舌爾角毛藻的認知多限于普通光學顯微鏡觀察, 因而對其形態(tài)學了解得不夠全面, 導致在分類學上出現(xiàn)爭議, 如塞舌爾角毛藻與金色角毛藻是否為同種異名(Taylor, 1966)的問題。對于塞舌爾角毛藻在系統(tǒng)學劃分上也存在一些疑問, 有學者將塞舌爾角毛藻歸入北方組SectionBorealia(Taylor, 1966),也有學者將其單獨成組, 并命名為塞舌爾組SectionSeychellari(Hernández-Becerrilet al, 2001)。

為全面界定塞舌爾角毛藻的物種信息, 本文從臺灣海峽和海南島三亞海域分離并建立了單克隆培養(yǎng)株系, 利用光鏡和掃描電鏡(scanning electron microscopy, SEM)進行了較為詳盡的形態(tài)學觀察,首次擴增了該種的核糖體大亞基D1～D3區(qū)序列, 構建并分析了其分子系統(tǒng)樹。相關研究成果豐富了我國海洋硅藻的分類學資料, 也為硅藻系統(tǒng)學研究提供了基礎數據。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集

通過搭載國家自然科學基金委2016年度臺灣海峽春季共享航次, 采集了浮游植物活體樣品, 此外在海南島三亞海域也開展了相關樣品的采集。采樣時, 使用浮游植物網(孔徑10μm)進行水平拖網,并同步記錄水溫、鹽度等水文參數, 回到實驗室后進行目標藻株的分離、純化和擴大培養(yǎng)。

1.2 單克隆培養(yǎng)株系的建立

利用毛細玻璃管分離法在生物倒置顯微鏡(Mshot MI-12)下挑取目標藻細胞, 經多次復洗后快速轉移至滴有L1培養(yǎng)液的48孔培養(yǎng)板內, 待其存活并繁殖達到100個細胞, 再轉移到250ml三角瓶中進行擴大培養(yǎng)。藻株保存于光照培養(yǎng)室內, 培養(yǎng)條件是恒溫22±2℃、光暗周期比12∶12, 光照強度約50～80μmol·m-2·s-1。建立的塞舌爾角毛藻培養(yǎng)株系共5個, 詳細信息見表1。

表1 塞舌爾角毛藻培養(yǎng)藻株信息Tab. 1 Information of monoclonal strains used in this study

1.3 休眠孢子的誘導

在上述培養(yǎng)條件下, 分別吸取5mL處于對數生長期的藻液, 轉移到100mL三角瓶中, 以L1培養(yǎng)液(缺氮)誘導休眠孢子(Kooistra et al, 2010)。每個藻株均誘導 3 次以上, 每次誘導時間持續(xù)兩周, 期間觀察休眠孢子的產生。

1.4 形態(tài)學特征的觀察

光鏡觀察: 取5μL處于對數生長期的藻液, 置于載玻片上, 壓片后在顯微鏡(Olympus BX53)下進行微分干涉(differential interference contrast, DIC)觀察, 并使用Olympus DP27數碼相機記錄其形態(tài)特征。

掃描電鏡觀察: 取3mL處于對數生長期的藻液,加入等體積濃硫酸(＞95%), 酸化10min, 以去除有機質, 用滅菌雙蒸水(ddH2O)多次洗滌至中性。將藻細胞過濾到濾膜上, 放置在避光干燥處待其晾干后,利用碳導電膠貼于SEM樣品臺, 噴金后置于掃描電鏡(Zeiss Ultra 55)下觀察和記錄其形態(tài)特征。

1.5 分子系統(tǒng)學研究

利用離心法收集藻細胞, 提取總DNA, 擴增核糖體大亞基基因D1～D3區(qū)(Lundholm et al, 2002; Xu et al, 2020)。LSU rDNA引物為D1R-F(5’-ACC CGC TGA ATT TAA GCA TA-3’)和D3B-R (5’-TCG GAG GGA ACC AGC TAC TA-3’)。采用50μL的PCR反應體系: 25μL的PCR Mix, 正、反向引物各1μL,21μL滅菌ddH2O和 2μL目標藻株總DNA。擴增條件為: 首先94℃預變性5min; 然后進行如下36個循環(huán): 94℃變性30s, 56℃復性30s, 72℃延伸45s; 之后72℃再延伸7min。PCR產物于4℃保存, 并送往華大基因公司(The Beijing Genomics Institute, BGI)進行測序。從美國國家生物信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)下載角毛藻物種的 LSU nrDNA序列, 運用BioEdit軟件進行比對和矩陣分析(Nylander, 2004)?；贛rModeltest 2.3選擇最適模型, 分別用RAxML-HPC2(Miller et al, 2010)和MrBayes 3.2(Ronquist et al, 2012)構建最大似然樹(Maximum Likelihood, ML)和貝葉斯推理樹(Bayesian Inference, BI)。選用冕孢角毛藻C.diadema(EF42 3433)作為群外對照。

2 結果

2.1 塞舌爾角毛藻的形態(tài)學描述Chaetoceros seychellarusG.Kasten

Kasten, 1907: 987, Fig.4a～e; Hustedt, 1920: Pl.327, Fig.12～13; Hendey, 1937: 296; Simonsen, 1974:32; Hernández-Becerril, 1993: 121, Fig.16～27;Hernández-Becerril et al, 2001: 400, Fig.1～15.

根據鏡下顯示(圖1), 塞舌爾角毛藻細胞鏈直、粗壯, 常形成6～23個細胞不等的長鏈(圖1a), 也有單細胞(圖1c)。細胞和角毛內散布有數量眾多的顆粒狀色素體(圖1a、1c—f)。細胞寬環(huán)面觀為矩形, 殼面長軸短于貫殼軸, 殼面長軸介于12.85～14.73μm(中位值±標準差: 13.15±0.60μm), 貫殼軸高 20.51～45.51μm (中位值±標準差:28.55±6.27μm)。窗孔呈矩形(圖 1e、1f), 高2.56～4.61μm(中位值±標準差: 3.22±0.73μm)。殼套較高, 高度大于貫殼軸的三分之一, 與環(huán)帶相接處有明顯凹溝(圖1d—f、1i、1j)。角毛粗壯, 殼面觀時角毛長度較為一致, 向四周呈輻射狀(圖1b)。殼面和殼套上布滿細小孔紋(圖1g—i), 殼面孔紋散布, 角毛基部孔紋明顯密集(圖1h)。殼面呈圓形或近圓形(圖1h)。

圖1 塞舌爾角毛藻(株系編號: MC2054)a. 群體環(huán)面觀; b. 群體殼面觀; c. 單細胞; d. 上殼面; e. 下殼面; f. 鏈中細胞(箭頭指示殼套與環(huán)帶連接處); g. 鏈中相鄰殼面(箭頭指示唇形突); h. 內殼面觀; i. 上殼面; j. 下殼面; k、l. 角毛; m. 角毛截面Fig.1 Chaetoceros seychellarus (MC2054). a: Chain in girdle view; b: chain in valve view; c: solitary cell; d: terminal anterior valve; e:terminal posterior valve; f: intercalary cells and arrows showing connection between mantle and bands; g: sibling valves and arrows showing two rimoportulae; h: valve; i: terminal anterior valve; j: terminal posterior valve; k-l: setae structure; and m: setae section

鏈中角毛相交于基部, 融合后向外延伸, 末端向鏈端彎曲(圖1a、1e、1f)。鏈狀群體的兩個鏈端殼面形態(tài)不同(圖1a、1d、1e), 上殼面角毛先向殼面中心延伸, 彼此相交之后再分離(圖1a、1d、1i), 下殼面角毛不相交, 從殼面伸出即向兩側延伸(圖1a、1e、1j)。單細胞兩個殼面亦為異形(圖1c)。角毛呈四棱形(圖1m), 每條棱上分布有箭頭狀的刺, 大小介于0.70～3.00μm(中位值±標準差: 1.74±0.59μm),密 度 為 0.121～0.166 個·μm-1(中 位 值±標 準 差:0.150±0.118個·μm-1)。角毛上有兩種孔紋, 一種是沿著角毛徑向排列的大孔, 密度為0.574～0.890個·μm-1(中位值±標準差: 0.739±0.092個·μm-1); 另外一種是橫向排列的小孔, 密度為6.3～9.3個·μm-1(中位值±標準差: 7.6±1.2個·μm-1) (圖1k、1l)。

每個殼面均有兩個唇形突, 在殼面短軸兩側呈對稱分布(圖1g、1h)。其在外殼面具有短的外管, 末端呈嘴唇狀結構(圖1g、1i); 而在內殼面上則為裂縫狀, 呈“工”字形(圖1h)。

未見休眠孢子。

2.2 塞舌爾角毛藻的生態(tài)分布

本文藻株采自我國臺灣海峽(117°48'36"E,22°42'38"N; 120°20'24"E, 25°33'00"N)與三亞海域(111°54'00"E, 19°45'94"N)。根據已有的研究報道,塞舌爾角毛藻分布于印度洋(Karsten, 1907)、北美加利福尼亞沿岸、墨西哥灣(Hernández-Becerril, 1993;Hernández-Becerril et al, 1998)和韓國沿海(Lee, 2011)等。塞舌爾角毛藻為罕見的暖水種(Hernández-Becerril et al, 2001), 因此主要分布在熱帶和亞熱帶海域。

2.3 基于LSU nrDNA部分序列構建的分子系統(tǒng)樹分析

使用NCBI的blast (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)功能, 檢索塞舌爾角毛藻鄰近物種的LSUnr DNA D1～D3區(qū)序列, 得到31條鄰近物種和外類群序列, 另外本文研究獲得1條塞舌爾角毛藻藻株序列, 因此共有32條序列用于最終的分子系統(tǒng)學分析。基于核糖體大亞基DNA(LSU nrDNA)部分序列構建的ML和BI系統(tǒng)進化樹顯示, 兩者具有相似的拓撲結構, 其中ML樹拓撲結構在本文中展示(圖2)。

圖2 基于核糖體大亞基部分序列構建的系統(tǒng)發(fā)育樹斜杠左側值為BI, 右側值為ML, -表示BI值＜0.9或者ML值＜80 Fig.2 Phylogenetic analysis inferred from LSU partial sequences

該分子系統(tǒng)樹與De luca等(2019)的報道一致,有色角毛藻亞屬的物種聚集在一個大的分支上, 反映出較好的單系起源(BI/ML=1.00/100)。塞舌爾角毛藻首先與丹麥角毛藻(C. danicus)聚在一起(BI/ML=1.00/81), 之后與扭曲角毛藻(C. convolutus)聚在一個分支(BI/ML=1.00/94)上, 說明它們之間具有較近的遺傳關系。

3 討論

3.1 塞舌爾角毛藻的形態(tài)學研究

塞舌爾角毛藻的典型特征是鏈端殼面異形, 即上殼面與下殼面的特征不一致, 單細胞的上、下殼面亦為異形(圖1c), 這一特征也見于秘魯角毛藻(C.peruvianus)和均等角毛藻(C. aequatoralis) (Hernández-Becerril, 1993; Tomas et al, 1997; Hernández-Becerril et al, 2001)。此外, 本研究還觀察到另一新的形態(tài)學特征——鏈中角毛的走勢。當從殼面觀察漂浮狀態(tài)群體時, 角毛并非整齊地排列在兩側, 而是以細胞為中心向四周呈放射狀(圖1b)。角毛走勢也是角毛藻物種鑒定的重要依據(Tomas et al, 1997; Hernández-Becerril et al, 2001), 角毛走勢作為物種鑒定依據在聚生角毛藻復合群(C. socialiscomplex)(Chamnansinp et al, 2013)和柔弱角毛藻復合群(C. debiliscomplex)(Xu et al, 2020)中已有成功應用, 因此本文建議將鏈中角毛的走勢納入到塞舌爾角毛藻的識別特征中。

本文構建的分子系統(tǒng)樹顯示(圖2), 塞舌爾角毛藻與丹麥角毛藻具有最近的親緣關系, 它們也具有較多相似的形態(tài)特征, 如殼套較高、窗孔狹窄、殼套上有硅質增厚帶等(Hernández-Becerril, 1993)。兩者之間的形態(tài)學差異主要在于: 1) 塞舌爾角毛藻可形成長鏈狀群體, 也可單細胞生活(圖1c), 而丹麥角毛藻則常為單細胞生活, 偶見2～3個細胞的短鏈群體; 2) 塞舌爾角毛藻的鏈端殼面異形(圖1a、1d、1e、1i、1j), 丹麥角毛藻的鏈端殼面同形; 3) 塞舌爾角毛藻的每個殼面均具有兩個唇形突, 而丹麥角毛藻僅具有一個(Hernández-Becerril, 1996)。此外, 塞舌爾角毛藻的相似物種還有北方角毛藻和密連角毛藻, 上述形態(tài)學差異也同樣適用于塞舌爾角毛藻與后兩者之間的區(qū)別。

金色角毛藻(C. aurivillius)與塞舌爾角毛藻的形態(tài)特征基本一致, 尤其是鏈端殼面異形。學者們根據優(yōu)先原則認為塞舌爾角毛藻是金色角毛藻的同種異名(Taylor et al, 1966; 郭玉潔 等, 2003), 同時兩者也具有細微的差異, 如塞舌爾角毛藻殼套和環(huán)帶相接處有凹溝(圖1d—f、1i、1j), 而金色角毛藻卻沒有。但是, 以往關于上述兩個物種的研究多以光鏡為觀察手段, 尤其是金色角毛藻, 其在電鏡下的超微形態(tài)特征至今未見報道, 有關其分子系統(tǒng)學的研究更是空白。因此有學者持保留觀點, 認為在獲得詳盡的形態(tài)特征之前, 仍將它們作為獨立的物種(Manguin, 1957; Hernández-Becerril et al, 2001)。本研究并未建立金色角毛藻培養(yǎng)株系, 故未獲得其形態(tài)學和分子生物學數據, 建議暫時仍將金色角毛藻與塞舌爾角毛藻作為兩個獨立物種, 待后續(xù)研究獲取充分的物種信息后再進行分析。

3.2 塞舌爾角毛藻的系統(tǒng)學研究

根據形態(tài)特征, 有色角毛藻亞屬被劃分為7個組(section), 其中塞舌爾角毛藻被劃分到北方組SectionBorealia, 該組的典型特征是: 1) 細胞和角毛中含色素體; 2) 直鏈狀或單細胞生活; 3) 寬環(huán)面呈矩形; 4) 殼面呈橢圓形或圓形; 5) 角毛具刺和孔紋; 6) 窗孔狹窄; 7) 唇形突無明顯外管(Hernández-Becerril, 1996)。塞舌爾角毛藻也表現(xiàn)出上述典型特征。本文的分子系統(tǒng)學研究中, 引用了3個北方組物種: 塞舌爾角毛藻、丹麥角毛藻和卡氏角毛藻(C.castracanei), 分子系統(tǒng)樹顯示它們不在一個分支上。雖然塞舌爾角毛藻與丹麥角毛藻聚在一個分支上, 但是卡氏角毛藻(EF423453)卻位于另一個分支,兩分支之間被其他有色角毛藻亞屬的物種分割, 如大西洋角毛藻(C. atlanticus)和雙刺角毛藻(C.dichaeta)。根據系統(tǒng)樹顯示, 北方組并非單系起源,目前該組的劃分可能仍存在問題, 后續(xù)需要引入更多的分子數據來加以完善和修訂。

鑒于塞舌爾角毛藻的每個殼面均具有兩個唇形突, 顯著區(qū)別于北方組的其他物種, Hernández-Becerril等(2001)建議將塞舌爾角毛藻單獨劃分為塞舌爾組(SectionSeychellari)。該組的典型特征為:1) 適中或較長的鏈狀群體; 2) 鏈狀群體兩端細胞不同; 3) 窗孔為窄矩形狀; 4) 群體中每個殼面具有兩個唇形突, 對稱地位于殼面短軸末端, 相鄰殼面的唇形突位于相同位置(Hernández-Becerril et al, 2001)。根據本文構建的系統(tǒng)樹顯示, 塞舌爾角毛藻與丹麥角毛藻相鄰, 表明兩者之間有較近的親緣關系。但是, 丹麥角毛藻并不具有上述特征,以往報道的北方組物種亦不具有上述特征, 因此本文認為上述特征可能是塞舌爾角毛藻獨有的特征, 并非其隸屬小類群的共有特征, 因而不足以成為系統(tǒng)劃分的形態(tài)學依據, 更為復雜的復合特征或許能夠解答它們之間的系統(tǒng)學關系。至于塞舌爾角毛藻是否應該獨立成組, 目前尚不能給出結論, 后續(xù)還需要有色角毛藻亞屬物種更多分子數據的引入。