龔艷麗，彭 倍，付卓異，翁 璇，姜 海

(電子科技大學(xué)機(jī)械與電氣工程學(xué)院 成都 611731)

生化檢測(cè)分析在很多領(lǐng)域起重要作用，如何靈敏快速地針對(duì)某些低濃度物質(zhì)進(jìn)行定性或定量檢測(cè)的需求日益增加?，F(xiàn)有的高精度檢測(cè)設(shè)備主要為固定的臺(tái)式設(shè)備，其結(jié)構(gòu)復(fù)雜、價(jià)格昂貴、需要專業(yè)人員操作等特性限制了其使用范圍。隨著微納制造技術(shù)的迅猛發(fā)展，微流控檢測(cè)平臺(tái)為檢測(cè)系統(tǒng)的小型化及可便攜化發(fā)展帶來了發(fā)展空間[1-3]。微流控檢測(cè)平臺(tái)相較于大型檢測(cè)系統(tǒng)，具有樣本消耗量小、成本低、芯片即拋即用、分析時(shí)間短等更具競(jìng)爭(zhēng)性的優(yōu)勢(shì)[4]。然而，其在減小體積和樣本量的同時(shí)，給檢測(cè)的靈敏度帶來了挑戰(zhàn)。為了改善系統(tǒng)的檢測(cè)靈敏度，微流控富集技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。該技術(shù)通過對(duì)樣本預(yù)處理提高待檢成分的濃度，從而提高檢測(cè)靈敏度，很快成為微流控領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。

當(dāng)前，微流控富集技術(shù)發(fā)展呈現(xiàn)多樣化態(tài)勢(shì)，依據(jù)待富集物質(zhì)是否主動(dòng)參與到富集動(dòng)態(tài)中，可將這些技術(shù)分為被動(dòng)富集技術(shù)和主動(dòng)富集技術(shù)。被動(dòng)富集技術(shù)通常使用特殊通道結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)、過濾輔助結(jié)構(gòu)或具有特異性的捕獲元來對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行捕獲富集[5-7]，應(yīng)用這類方法最大的優(yōu)勢(shì)是富集本身不需要外場(chǎng)的干預(yù)，但對(duì)樣本的物理特性(如目標(biāo)物的尺寸、剛度、黏彈度等)或免疫特性要足夠了解，針對(duì)這些特性設(shè)計(jì)的通道結(jié)構(gòu)往往較為復(fù)雜[8-9]。主動(dòng)富集技術(shù)通常需要外場(chǎng)的干預(yù)來實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物的富集，典型技術(shù)有：基于梯度場(chǎng)建立的速度差異富集技術(shù)[10-12]，主要包括等電位聚焦(isoelectric focusing, IEF)、電場(chǎng)梯度聚焦(electric field gradient focusing, EFGF)、溫度梯度聚焦(temperature gradient focusing, TGF)等；基于緩沖介質(zhì)特性差異實(shí)現(xiàn)的邊界堆疊富集技術(shù)[13-15]，主要包括掃描堆積(Sweeping)、等速電泳(isotachophoresis, ITP)和場(chǎng)放大樣品堆疊(field amplified sample stacking, FASS)等；介電泳富集技術(shù)[16-17]和基于電滲流與電泳合力作用下的電動(dòng)富集技術(shù)。其中，電動(dòng)富集技術(shù)是一種實(shí)現(xiàn)相對(duì)簡(jiǎn)單的富集技術(shù)，而基于離子濃差極化(ion concentration polarization, ICP)效應(yīng)的電動(dòng)富集是目前效率較高的富集方式，其將微米通道由納米結(jié)構(gòu)串接，而納米通道是具有離子選擇性的，通過合理的電場(chǎng)條件控制，就能在納米通道一側(cè)的微米通道內(nèi)形成特定離子的高效富集。ICP現(xiàn)象自首次被文獻(xiàn)[18]發(fā)現(xiàn)以來，已廣泛應(yīng)用于微流控富集中[19-21]。利用ICP現(xiàn)象的電動(dòng)富集方式無疑是目前最受歡迎的富集方式之一，但納米工藝的制作還不具備普適性，這是限制其發(fā)展的主要因素。

現(xiàn)有的富集方式各自具有自身的適用領(lǐng)域與應(yīng)用局限，包括需要掌握目標(biāo)成分的物化特性、需嚴(yán)格的微納通道工藝及電極工藝制備條件、需配置特性符合需求的緩沖介質(zhì)等。而現(xiàn)有的大部分生化檢測(cè)對(duì)象是具有負(fù)電荷屬性的，如何利用微通道中的流體電動(dòng)特性在簡(jiǎn)單的微通道結(jié)構(gòu)中實(shí)現(xiàn)電動(dòng)富集仍然具有較大的研究空間。前期研究表明，在T型微通道內(nèi)，通過電滲流的誘導(dǎo)可以產(chǎn)生壓力驅(qū)動(dòng)流，實(shí)現(xiàn)持續(xù)穩(wěn)定的流體進(jìn)樣，而優(yōu)化的雙T型通道結(jié)構(gòu)在實(shí)現(xiàn)流體驅(qū)動(dòng)的同時(shí)，還具有帶電離子富集的潛能[22-23]；同時(shí)液態(tài)金屬可以注入微通道中作為微電極用于雙T型微流控通道中，降低微通道中電極制作的難度[24]。本文在此基礎(chǔ)上對(duì)雙T型通道內(nèi)熒光離子和皮質(zhì)醇適配體的富集特性分別進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究，發(fā)現(xiàn)了皮質(zhì)醇適配體的新型富集現(xiàn)象，并以此為基礎(chǔ)實(shí)現(xiàn)了皮質(zhì)醇的熒光檢測(cè)。

1 雙T型電動(dòng)富集結(jié)構(gòu)與原理

雙T型電動(dòng)富集結(jié)構(gòu)及流體電動(dòng)控制原理如圖1所示，通道中心由液態(tài)金屬提供形狀規(guī)則的中心電極，并通過阻擋柱陣列與樣本通道耦合接觸。通道主體由進(jìn)樣通道(包括兩個(gè)進(jìn)樣分支)、出樣通道(分左右兩側(cè))、過渡腔與富集腔4個(gè)部分構(gòu)成，如圖1a所示，芯片的實(shí)際制作模型如圖1b所示，其中的5個(gè)圓形區(qū)域?yàn)樾酒O(shè)計(jì)的打孔位置，O與O’所示孔位為液態(tài)金屬注射控制孔位，直徑均為2 000 μm，A、B、C為樣本溶液注入與存儲(chǔ)孔位，直徑均為4 000 μm，芯片呈左右對(duì)稱結(jié)構(gòu)。

圖1 芯片參數(shù)及控制原理圖

當(dāng)通道如圖1b所示接入直流電源DC后，流體在富集腔、過渡腔和兩側(cè)出樣通道間產(chǎn)生沿著電場(chǎng)方向的電滲流，使得富集腔中心區(qū)域形成負(fù)壓腔，此時(shí)流體可由進(jìn)樣通道吸入負(fù)壓區(qū)域形成持續(xù)進(jìn)樣，其流場(chǎng)分布如圖1c所示。該流場(chǎng)分布由微通道中的直流電場(chǎng)和層流場(chǎng)共同控制，其控制方程為：

式中，V表示電勢(shì)；E為由電勢(shì)差形成的電場(chǎng)強(qiáng)度；ε0為真空中的介電系數(shù)；εr為流體的相對(duì)介電率；ζ為通道的zeta電勢(shì)；μ為流體中的動(dòng)態(tài)粘滯度；u為速度矢量；ρ為流體密度；p為壓強(qiáng)；I為單位矢量；F為由粘滯度引起的流動(dòng)阻力。其中，速度u為關(guān)鍵變量，由上述方程組求得，并根據(jù)其分布可得到流體的流場(chǎng)分布。同時(shí)，當(dāng)樣本溶液中目標(biāo)成分為帶電物質(zhì)時(shí)，其在對(duì)流、擴(kuò)散及電場(chǎng)遷移的共同作用下，會(huì)在流體通道中形成速度平衡點(diǎn)，由此形成富集效應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)主要研究負(fù)電荷物質(zhì)在該結(jié)構(gòu)中的電動(dòng)富集性能。

2 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備及平臺(tái)搭建

2.1 試劑準(zhǔn)備

實(shí)驗(yàn)以熒光素納(fluorescein sodium salt, SIGMA,F6377, Germany)陰離子染料作為離子類物質(zhì)代表，用熒光素納和去離子水配制成濃度為7.8×10-8mol/L的樣本溶液1備用。該染料的激發(fā)光峰值波長(zhǎng)為488 nm，經(jīng)激發(fā)后的發(fā)射光峰值波長(zhǎng)為518 nm。以皮質(zhì)醇適配體15-1序列作為本次實(shí)驗(yàn)的DNA類分子物質(zhì)代表，其序列號(hào)為：5’-GGA ATGGAT CCA CAT CCA TGG ATG GGC AAT GCG GGG TGG AGA ATG GTT GCC GCA CTT CGG CTT CAC TGC AGA CTT GAC GAA GCT T-3’[25]。為了觀察皮質(zhì)醇適配體的富集情況及后續(xù)皮質(zhì)醇檢測(cè)，將該序列5端修飾了羧基熒光基團(tuán) (6-FAM，6-Carboxyfluorescein)。該熒光基團(tuán)的激發(fā)光峰值波長(zhǎng)為494 nm，經(jīng)激發(fā)后的發(fā)射光峰值波長(zhǎng)為518 nm。將上述修飾過熒光基團(tuán)的皮質(zhì)醇適配體用去離子水配置成1 μmol/L的樣本溶液2備用。

2.2 芯片制作與實(shí)驗(yàn)平臺(tái)

本結(jié)構(gòu)的芯片制作簡(jiǎn)單，且其中心電極由液態(tài)金屬電極構(gòu)成，中心電極通道與樣本運(yùn)輸通道耦合一體成型[24]。制作時(shí)，首先由光刻工藝得到通道陽模，再由PDMS澆注得到具有通道結(jié)構(gòu)的芯片，并將其與玻璃鍵合、成功地注入液態(tài)金屬后即可用，如圖2a所示。實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)平臺(tái)主要包括微流控芯片、芯片控制電源、熒光顯微鏡、顯微鏡電源與熒光控制器及電腦顯示組件，其系統(tǒng)框架與實(shí)物平臺(tái)如圖2b和2c所示。

圖2 芯片結(jié)構(gòu)與實(shí)驗(yàn)平臺(tái)

2.3 實(shí)驗(yàn)流程

將樣本溶液、芯片和實(shí)驗(yàn)平臺(tái)準(zhǔn)備好后，按如下步驟開展實(shí)驗(yàn)。

1)在左右兩側(cè)樣本溶液預(yù)留孔位A和B中分別注入4.5 μL去離子水，待液體在整個(gè)通道中流通；

2)調(diào)節(jié)顯微鏡載樣平臺(tái)至視場(chǎng)合適，打開熒光，在樣本預(yù)留孔位C中注入6 μL樣本溶液，接通芯片電源；

3)觀察實(shí)驗(yàn)，等待數(shù)據(jù)記錄。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

3.1 熒光富集實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)首先研究了樣本溶液1在雙T型通道內(nèi)的電動(dòng)富集狀態(tài)，分別記錄了當(dāng)加載電壓為30、60、90 V時(shí)的富集過程，記錄時(shí)間為5 min，得到的結(jié)果如圖3所示。由圖可以看到，該通道結(jié)構(gòu)對(duì)熒光陰離子具有明顯的電動(dòng)富集功能，富集區(qū)域主要集中在富集腔內(nèi)。由熒光強(qiáng)度分布可以看到，在5 min內(nèi)電壓越高、富集腔內(nèi)的富集效果越好。

圖3 不同電壓下雙T型通道內(nèi)熒光離子的富集狀態(tài)

前期研究表明，進(jìn)樣通道中兩分支通道的間距對(duì)負(fù)電荷離子的富集效果有明顯影響，間距越大，富集效果越好[23]。因此，實(shí)驗(yàn)研究中，將圖1中芯片結(jié)構(gòu)的分支通道間距進(jìn)行了調(diào)整，制作了新的芯片結(jié)構(gòu)，將圖1中的芯片結(jié)構(gòu)定義為結(jié)構(gòu)1，新的芯片結(jié)構(gòu)定義為結(jié)構(gòu)2，并對(duì)兩種結(jié)構(gòu)在60 V電壓下的富集過程進(jìn)行了對(duì)比分析，如圖4所示。其中，圖4a顯示了兩種芯片結(jié)構(gòu)及其在5 min內(nèi)富集過程的對(duì)比，圖4b為圖4a中3個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)下(1、3、5 min)由熒光強(qiáng)度表征的富集倍率的量化結(jié)果(富集倍率定義為富集腔內(nèi)平均熒光強(qiáng)度I與進(jìn)樣通道熒光強(qiáng)度I0的比值I/I0)。由圖可以看到，結(jié)構(gòu)2針對(duì)熒光離子的富集效果明顯優(yōu)于結(jié)構(gòu)1，且兩者富集區(qū)域均以富集腔為核心。

圖4 兩種芯片結(jié)構(gòu)在60 V電壓下的富集對(duì)比

3.2 皮質(zhì)醇適配體富集實(shí)驗(yàn)

依據(jù)上述熒光離子的富集結(jié)果，本節(jié)針對(duì)富集效果更優(yōu)的結(jié)構(gòu)2展開了皮質(zhì)醇適配體的電動(dòng)富集研究。實(shí)驗(yàn)仍以加載電壓為變量，分別記錄了樣本溶液2在電壓為30、60、90 V時(shí)的富集過程，記錄時(shí)間為10 min，得到的結(jié)果如圖5所示。由圖可以看到，該通道對(duì)皮質(zhì)醇適配體的富集效果不同于對(duì)熒光離子的富集效果，電壓較低(30 V)時(shí)，皮質(zhì)醇適配體在入口通道與出口通道交匯口處出現(xiàn)了明顯的富集(如圖5a所示)，隨著電壓增加，在通道交匯口的適配體逐漸向過渡腔和富集腔轉(zhuǎn)移(如圖5b所示)，到90 V時(shí)，適配體在富集腔內(nèi)與液態(tài)金屬電極接觸處匯聚(如圖5c所示)，此時(shí)，其富集區(qū)域與熒光離子在該通道結(jié)構(gòu)中的富集區(qū)域一致。定義該結(jié)構(gòu)中的局部熒光較強(qiáng)區(qū)域與進(jìn)樣主通道區(qū)域內(nèi)的熒光強(qiáng)度之比為富集倍率(同樣記為I/I0)，得到不同電壓下通道不同位置處的富集倍率在10 min內(nèi)隨時(shí)間的變化關(guān)系如圖5d所示。

圖5 結(jié)構(gòu)2芯片通道中不同電壓下皮質(zhì)醇適配體的富集效果

分析上述實(shí)驗(yàn)如下：進(jìn)樣流與出樣流在進(jìn)樣通道與出樣通道交匯口處首次發(fā)生流體交匯，此時(shí)進(jìn)樣流與出樣流各自在通道內(nèi)的寬度明顯減小，而皮質(zhì)醇適配體不同于熒光離子，其尺寸在微通道內(nèi)不可忽略，當(dāng)電壓較低時(shí)，由電滲流誘導(dǎo)的流體流動(dòng)速度較低，適配體由于通道驟然變窄會(huì)出現(xiàn)阻塞現(xiàn)象，由此逐漸在該區(qū)域形成了阻塞型富集；當(dāng)電壓逐漸增大，流體速度也相應(yīng)增大，流體對(duì)適配體的拖拽力增強(qiáng)，更容易使適配體突破該交匯口進(jìn)入過渡腔內(nèi)，而當(dāng)電壓增大到一定值后，適配體基本可以突破過渡區(qū)域進(jìn)入富集腔內(nèi)形成與離子類物質(zhì)相似的富集效果。由圖5d可以看到，對(duì)于本結(jié)構(gòu)而言，在30 V電壓下通道交匯口形成的阻塞型富集效果明顯優(yōu)于90 V電壓下富集腔內(nèi)的富集效果，前者局部熒光強(qiáng)度可在4 min內(nèi)迅速達(dá)到進(jìn)樣通道中熒光強(qiáng)度的100倍。

由此，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了該結(jié)構(gòu)針對(duì)尺寸較大的DNA分子基于阻塞與驅(qū)動(dòng)平衡的新型富集方式，即在雙T型通道中，當(dāng)通道尺寸與驅(qū)動(dòng)電壓相互匹配時(shí)，可以實(shí)現(xiàn)分子尺度的物質(zhì)在通道進(jìn)樣流與出樣流首次交匯口處的快速富集，該區(qū)域不與電極接觸，可以避免樣本物質(zhì)與電極的相互腐蝕和滲透。

3.3 皮質(zhì)醇熒光檢測(cè)實(shí)驗(yàn)

利用上述基于阻塞與驅(qū)動(dòng)平衡的新型富集方式，本節(jié)對(duì)皮質(zhì)醇進(jìn)行了基于熒光猝滅-點(diǎn)亮機(jī)制的定性檢測(cè)，檢測(cè)原理如下：配制3種狀態(tài)的樣本溶液，第一種是被熒光基團(tuán)6-FAM修飾的皮質(zhì)醇適配體，標(biāo)記為樣本1；第二種為在第一種溶液的基礎(chǔ)上添加了適量納米片狀結(jié)構(gòu)的二硫化鉬，標(biāo)記為樣本2；第三種為在第二種溶液的基礎(chǔ)上添加了適量的皮質(zhì)醇，標(biāo)記為樣本3。其中，樣本1的濃度達(dá)到一定值后，通過特定波長(zhǎng)的激光激發(fā)可以觀察到與濃度對(duì)應(yīng)強(qiáng)度的熒光；樣本2由于二硫化鉬的加入，其與熒光基團(tuán)形成了Forster共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)對(duì)[26]，使得熒光發(fā)生猝滅，因此觀察不到熒光；樣本3則由于皮質(zhì)醇的加入，其與適配體通過堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合，其結(jié)合力遠(yuǎn)高于適配體與二硫化鉬基面結(jié)合的范德華力，因此，適配體被皮質(zhì)醇拉離二硫化鉬，熒光被重新釋放。根據(jù)3種樣本溶液的熒光激發(fā)狀態(tài)，即可判斷皮質(zhì)醇的存在與否，而雙T型通道的富集效應(yīng)可以加強(qiáng)局部熒光信號(hào)顯示，更有利于低濃度皮質(zhì)醇的檢測(cè)。

實(shí)驗(yàn)中，首先配置了100 μL濃度為1 μmol/L的適配體溶液，將其分成兩等份，其中一份標(biāo)記為樣本1，在第二份溶液中加入超聲剝離好的濃度為5 mg/mL的二硫化鉬水溶液2.5 μL，震蕩混勻10 s，又將其分為兩等份，其中一份標(biāo)記為樣本2，另一份加入濃度為1 μg/mL的皮質(zhì)醇溶液2.5 μL，震蕩10 s，標(biāo)記為樣本3。將上述3份樣本按前述實(shí)驗(yàn)步驟在30 V電壓下依次展開實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)時(shí)間為10 min，得到的結(jié)果如圖6所示。由圖6a可以看到，樣本1通過本結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)了進(jìn)樣流與出樣流交匯口處的阻塞型富集，在此處可以觀察到明顯的熒光信號(hào)；由圖6b可以看到，樣本2在通道中觀察不到明顯的熒光信號(hào)，但可以通過熒光顯微鏡自然光視場(chǎng)下看到結(jié)合二硫化鉬的樣本在進(jìn)樣流與出樣流交匯口處發(fā)生匯聚，如圖6b右下角所示；由圖6c可以看到，樣本3在進(jìn)樣流與出樣流交匯口處也能觀察到明顯的熒光信號(hào)。這組實(shí)驗(yàn)證明了本通道對(duì)3組樣本物質(zhì)的富集均符合上述新型富集機(jī)制。圖6d分別展示了樣本1、樣本2、樣本3在通道交匯口富集區(qū)域內(nèi)由熒光強(qiáng)度表征的富集倍率隨時(shí)間的變化關(guān)系。由于樣本富集使得局部熒光信號(hào)增強(qiáng)，本次實(shí)驗(yàn)通過雙T型電動(dòng)富集結(jié)構(gòu)觀察到了明顯的熒光猝滅與點(diǎn)亮過程，證明了皮質(zhì)醇的存在，皮質(zhì)醇的檢測(cè)濃度為0.1 μg/mL。后續(xù)工作中，通過各種參數(shù)的優(yōu)化分析，包括結(jié)構(gòu)尺寸的優(yōu)化、3種溶質(zhì)參與量的匹配優(yōu)化、電壓與結(jié)構(gòu)的匹配優(yōu)化等，該結(jié)構(gòu)具有實(shí)現(xiàn)皮質(zhì)醇更低濃度檢測(cè)的潛能。

圖6 皮質(zhì)醇的熒光檢測(cè)實(shí)驗(yàn)

4 結(jié) 束 語

本文主要研究了雙T型通道對(duì)不同物質(zhì)的電動(dòng)富集效應(yīng)。首先，在微通道內(nèi)流體電動(dòng)控制理論研究的基礎(chǔ)上，通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)了雙T型通道對(duì)熒光陰離子的電動(dòng)富集功能；其次，對(duì)兩種不同的結(jié)構(gòu)分別進(jìn)行了熒光離子富集，發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)2具有更好的富集效果，由此展開了該結(jié)構(gòu)對(duì)皮質(zhì)醇適配體的電動(dòng)富集性能研究，發(fā)現(xiàn)了一種低電壓驅(qū)動(dòng)下的新型富集現(xiàn)象，其富集區(qū)域遠(yuǎn)離電極，可以避免目標(biāo)物質(zhì)與電極接觸造成的相互污染與滲透；最后，利用這種新型富集現(xiàn)象實(shí)現(xiàn)了對(duì)濃度為0.1 μg/ml皮質(zhì)醇的熒光檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)表明，雙T型通道對(duì)離子及分子尺度的負(fù)電荷物質(zhì)均具有富集功能，但各自富集條件及有效的富集區(qū)域不同。該電動(dòng)富集結(jié)構(gòu)為在線微流控富集技術(shù)的發(fā)展及針對(duì)低濃度物質(zhì)檢測(cè)的微流控平臺(tái)的發(fā)展提供了新的思路。