覃曉虹 劉志昂 陸婷婷 楊 溢 董建輝

(中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九二三醫(yī)院1 檢驗(yàn)科，2 移植科，廣西南寧市 530021，電子郵箱：499432680@qq.com)

研究表明，器官移植后容易出現(xiàn)排斥反應(yīng)，而這是影響移植物能否在受者體內(nèi)存活及存活時(shí)間長短的最主要因素[1]。因此，移植排斥反應(yīng)的早期診斷也越來越受到重視。微小RNA(microRNA，miRNA)為內(nèi)源性非編碼RNA，其在免疫調(diào)節(jié)、胚胎發(fā)育、腫瘤發(fā)生和進(jìn)展等方面發(fā)揮重要作用[2-3]。最近有研究顯示，血清miRNA-21表達(dá)水平與腎細(xì)胞的增殖及凋亡有關(guān)[4]。但目前關(guān)于腎移植術(shù)后患者血清miRNA-21水平與移植腎早期急性排斥反應(yīng)的關(guān)系的研究較少。因此，本研究探討腎移植術(shù)后患者血清miRNA-21表達(dá)水平變化及其與早期急性排斥反應(yīng)的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2019年4月至2020年3月我院收治的78例腎移植術(shù)后患者作為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn)：均為首次行同種異體腎移植術(shù)且供受者血型相配，淋巴細(xì)胞毒試驗(yàn)呈陰性，群體反應(yīng)性抗體<10%。排除標(biāo)準(zhǔn)：發(fā)生嚴(yán)重手術(shù)并發(fā)癥者、多器官聯(lián)合移植者、重癥感染者及其他類型腎病者。根據(jù)腎移植術(shù)后1個(gè)月內(nèi)是否發(fā)生急性排斥反應(yīng)，將其分為急性排斥組33例和非急性排斥組45例。急性排斥反應(yīng)的診斷：通過移植腎穿刺病理檢查結(jié)果、影像學(xué)檢查結(jié)果、實(shí)驗(yàn)室檢測指標(biāo)及患者臨床癥狀等綜合分析做出判斷[5]。急性排斥組中男性19例、女性14例，年齡23～58(36.59±6.07)歲；非急性排斥組中男性27例、女性18例，年齡21～60(35.31±5.59)歲。兩組患者在性別、年齡差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，具有可比性。本研究通過醫(yī)院倫理學(xué)委員會(huì)審批。

1.2 方法

1.2.1 樣本收集：分別于術(shù)前及術(shù)后1周采集兩組患者晨起空腹靜脈血5 mL， 2 500 r/min離心15 min分離血清，置于-80℃保存待檢。

1.2.2 檢測方法：(1)參照TRIzol試劑盒(Life Technologies公司，產(chǎn)品批號(hào)：181103)說明書操作提取血清總RNA后，檢測樣本中RNA濃度及純度。(2)參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Life Technologies公司，產(chǎn)品批號(hào)：190224)說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系為20 μL，包括2 μL RNA樣品、1 μL引物、1 μL反轉(zhuǎn)錄酶、1 μL內(nèi)參引物、0.5 μL RNase 抑制劑 、1 μL dNTP混合物(10 mmol/L)、4 μL 5×RT 緩沖液、9.5 μL不含RNase的 H2O 。反應(yīng)條件為42℃ 30 s，92℃ 10 min，65℃ 30 s，32℃ 1 min，產(chǎn)物置于-20℃保存。(3)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(廠家：Life Technologies公司，型號(hào)：7900HT)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為25 μL，包括2 μL稀釋的cDNA、12.5 μL SYBP Premix EX TaqTMⅡ、2 μL引物、8.5 μL ddH2O 。反應(yīng)條件：30℃ 5 min，42℃ 10 min，85℃ 30 s，45℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)。miRNA-21及內(nèi)參U6引物由上海生工生物工程公司合成。miRNA-21上游引物序列為5′-AGCAAGUCUGAGUACUGAUGCAGUGCAUCAUGUCACCGUUGCAU-3′，下游引物序列為5′-ACAAAUCGACUUGCAUCGCCUGU-3′；內(nèi)參U6引物序列為5′-TCTCGCTCGCACGCAGA-3′(正向)，5′-TAACGCTCACAATTTGCGGT-3′(反向)；miRNA-21反轉(zhuǎn)錄引物序列為5′-CUCGUGAUUUACUGGCCCCUGCUCGAGAGAUGAGGAUAACUAGCACUGAGCCA-3′；內(nèi)參U6反轉(zhuǎn)錄引物序列為5′-CTTGCGCGGAATAGCTTCTTCAT-3′。miRNA-21的相對表達(dá)水平= 2-ΔΔCt值(miRNA-21)- 2-ΔΔCt值(U6)[6]計(jì)算。

2 結(jié) 果

2.1 兩組患者手術(shù)前后血清miRNA-21相對表達(dá)水平的比較 兩組患者術(shù)前血清miRNA-21相對表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；術(shù)后1周，兩組患者的血清miRNA-21相對表達(dá)水平均高于術(shù)前，且急性排斥組血清miRNA-21相對表達(dá)水平高于非急性排斥組(均P<0.05)，見表1。

表1 兩組患者手術(shù)前后血清miRNA-21相對表達(dá)水平的比較(±s)

2.2 血清miRNA-21對移植腎早期急性排斥反應(yīng)的預(yù)測價(jià)值 以術(shù)后血清miRNA-21相對表達(dá)水平作為檢驗(yàn)變量，以移植腎是否出現(xiàn)急性排斥反應(yīng)為狀態(tài)變量作ROC曲線。結(jié)果顯示，血清miRNA-21預(yù)測移植腎早期急性排斥反應(yīng)的曲線下面積為0.715(95%CI：0.794，1.608；P=0.009)，約登指數(shù)為0.692，最佳臨界值為2.04，特異度為81.93%，靈敏度度為93.65%，見圖1。

圖1 血清miRNA-21預(yù)測移植腎早期急性排斥反應(yīng)的ROC曲線

2.3 Kaplan-Meier生存分析 根據(jù)腎移植受者術(shù)后1周血清miRNA-21相對表達(dá)水平，將患者分為miRNA-21高表達(dá)組(>2.19)27例和miRNA-21低表達(dá)組(≤2.19)51例。miRNA-21高表達(dá)組腎移植術(shù)后30 d內(nèi)無急性排斥反應(yīng)生存率為48.15%，低于miRNA-21低表達(dá)組的72.55%(χ2=4.568，P=0.033)，見圖2。

圖2 Kaplan-Meier生存曲線

3 討 論

腎移植是大多數(shù)終末期腎臟疾病患者的理想治療方式，但術(shù)后移植腎可能會(huì)發(fā)生排斥反應(yīng)，包括急性排斥反應(yīng)和慢性排斥反應(yīng)，其中急性排斥反應(yīng)可對移植腎的長期存活造成一定影響[7-8]。因此，臨床上應(yīng)重視移植腎急性排斥反應(yīng)的早期診斷，并給予及時(shí)、有效的治療，以延長移植腎的存活時(shí)間。miRNA是一類具有高時(shí)序性、保守性、組織特異性等特征的內(nèi)源性非編碼RNA，既往研究顯示，miRNA-199a-9p、miRNA-663等與急性排斥反應(yīng)的發(fā)生存在一定關(guān)系[9-10]。miRNA-21位于17q23.2染色體上，其在腫瘤、腎臟疾病、心血管疾病等中發(fā)揮重要作用[11]。有研究顯示，腎移植術(shù)后患者血清miRNA-21的表達(dá)水平與其腎功能密切相關(guān)[12]。因此，本研究探討腎移植術(shù)后患者血清miRNA-21的表達(dá)水平及其與移植腎早期急性排斥反應(yīng)的相關(guān)性。

晉力等[13]研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-1426p、miRNA-144-5p、miRNA-130a-3p在腎移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)患者血漿中呈高表達(dá)。王本剛等[14]的研究表明，miRNA-27a和長鏈非編碼RNA LRFN2-2基因與腎移植后排斥反應(yīng)的發(fā)生有關(guān)。由以上研究可知，miRNA與腎移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，術(shù)后1周，兩組患者的血清miRNA-21相對表達(dá)水平均高于術(shù)前，且急性排斥組患者的血清miRNA-21相對表達(dá)水平高于非急性排斥組(均P<0.05)；進(jìn)一步采用Kaplan-Meier進(jìn)行生存分析，發(fā)現(xiàn)miRNA-21高表達(dá)組的腎移植術(shù)后30 d內(nèi)無急性排斥反應(yīng)生存率低于miRNA-21低表達(dá)組(均P<0.05)。以上結(jié)果提示在移植腎急性排斥反應(yīng)早期血清miRNA-21表達(dá)上調(diào)，且腎移植術(shù)后患者血清miRNA-21的水平變化與移植腎早期的急性排斥反應(yīng)密切相關(guān)。

劉小友等[15]研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-663在腎移植急性排斥反應(yīng)中發(fā)揮調(diào)控作用，可作為早期診斷移植腎急性排斥反應(yīng)的評價(jià)指標(biāo)。Iwasaki等[16]研究發(fā)現(xiàn)， miRNA-142-5p和miRNA-486-5p可作為腎移植排斥反應(yīng)的早期診斷標(biāo)記物，兩者聯(lián)合診斷的特異度和靈敏度均較高。本研究結(jié)果顯示，術(shù)后血清miRNA-21預(yù)測移植腎早期急性排斥反應(yīng)的曲線下面積為0.715，最佳臨界值為2.04，特異度為81.93%，靈敏度度為93.65%，提示miRNA-21對預(yù)測移植腎早期急性排斥反應(yīng)具有重要價(jià)值。Khalid 等[12]研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-21的異常表達(dá)可能提示腎移植患者預(yù)后不良。因此，我們推測術(shù)后血清miRNA-21或可作為預(yù)測移植腎早期急性排斥反應(yīng)的生物學(xué)標(biāo)記物。

綜上所述，在移植腎急性排斥反應(yīng)早期患者血清miRNA-21表達(dá)上調(diào)，其或可成為預(yù)測移植腎早期急性排斥反應(yīng)的生物學(xué)標(biāo)記物。由于本研究樣本量有限，研究結(jié)果存在一定局限性，今后會(huì)增加樣本量，深入探討miRNA-21在移植腎急性排斥反應(yīng)中的作用機(jī)制。