李陽 錢櫟愷

在植物的一生中，它面臨著非常復(fù)雜、充滿威脅的生存環(huán)境，要面臨滅絕的危險，但植物通過物種進(jìn)化的方式形成了各種各樣的防御機制。十字花科植物中有很多種類是我國重要的經(jīng)濟作物，比如小白菜、芥菜、甘藍(lán)、油菜等。而小菜蛾是一種喜好取食十字花科植物的雜食性昆蟲，特別是當(dāng)小菜蛾成長為2～3齡幼蟲時，對十字花科植物有極大的危害性，給我國的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來了不可估量的經(jīng)濟損失。硫代葡萄糖苷（簡稱硫苷）是一種特殊的存在于十字花科植物中的次生代謝物質(zhì)，在植株的防御機制中發(fā)揮著重要作用，同時，硫苷還賦予了十字花科植物特殊的風(fēng)味，在人類的防癌、抗癌方面也有一定功能。我們的課題就是研究十字花科蔬菜的小白菜是如何在小菜蛾取食的情況下誘導(dǎo)產(chǎn)生出一系列防御機制的。在我們的實驗中，發(fā)現(xiàn)了：在被害蟲取食72h 后，小白菜植株被害蟲取食的地上部分葉片的硫苷含量趨于增加，硫苷可以在植物體內(nèi)形成非均勻分布的模式，并且容易遭受昆蟲取食的部位和植物的繁殖器官容易積累更多硫苷。

引言

植物的進(jìn)化面臨著復(fù)雜多變的環(huán)境，比如被害蟲取食，被動物當(dāng)作食物，被人類當(dāng)作糧食，甚至生存環(huán)境會被洪澇、干旱等極端條件影響，或者被細(xì)菌病毒浸染。因而進(jìn)化出了一系列防御機制，如“組成型防御”指的是植物利用自身固有特征，來阻止昆蟲取食或病原菌浸染，這種防御方式是植物與生俱來的，外界環(huán)境對其影響不大，并且可以在植物體內(nèi)持續(xù)地發(fā)揮作用;而“誘導(dǎo)型防御”則指的是植物因為遭受昆蟲取食或被機械損傷等行為的誘導(dǎo)，而產(chǎn)生了某種物質(zhì)來避免或減少被取食造成的傷害，這是在植物被外界損傷后才表現(xiàn)出的防御反應(yīng)，例如煙草被害蟲取食后會讓根部開始生產(chǎn)尼古丁將害蟲毒死，從而達(dá)到防御的目的。

十字花科是一個經(jīng)濟價值較大的科。全世界有300屬以上，3200種左右。主產(chǎn)地為北溫帶。在我國有95屬，400余種，全國各地均有分布，其中以西北、西南及東北的高山區(qū)或丘陵、平原地帶分布為多，是我國主要的經(jīng)濟作物。一般可分為四類：甘藍(lán)類、芥菜類、白菜類和蘿卜類。

小菜蛾，鱗翅目菜蛾科，主要為害的蔬菜品種包括甘藍(lán)、紫甘藍(lán)、青花菜、薹菜、芥菜、花椰菜、白菜、油菜、蘿卜等十字花科農(nóng)作物。其為害特點：初齡幼蟲僅取食葉肉，留下表皮，在菜葉上形成一個個透明的斑，即常說的“開天窗”。3～4齡幼蟲可將菜葉食成孔洞和缺刻，嚴(yán)重時植株全葉被吃成網(wǎng)狀。在苗期常集中心葉為害，影響包心。在留種株上，危害嫩莖、幼莢和籽粒。

硫代葡萄糖苷（簡稱硫苷），是十字花科蔬菜中的重要的也是其特有的一種次生代謝產(chǎn)物。學(xué)者根據(jù)側(cè)鏈基團的不同，把硫苷分為三大類，包括脂肪族硫苷、芳香族硫苷與吲哚族硫苷。硫代葡萄糖苷不僅在植株的防御機制中起著舉足輕重的作用，同時，十字花科植物中存在的特殊風(fēng)味也與硫苷有關(guān)，而且硫苷還在人類的健康方面也有一定功能，科學(xué)家倡導(dǎo)常吃白菜、蘿卜、甘藍(lán)等新鮮蔬菜可以防癌便是出于十字花科蔬菜含有硫苷的原因[2]。

我們選擇這個課題，希望通過比較農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中廣泛種植的小白菜在受到雜食性昆蟲小菜蛾的取食為害后，植株體內(nèi)硫苷含量是如何變化的，希望研究硫苷在十字花科植物防御體系中發(fā)揮的作用，在未來可以更多地去提取該類硫苷來開發(fā)“綠色農(nóng)藥”幫助十字花科植物建立更佳優(yōu)越的防御機制。

材料和方法

實驗材料

十字花科蔬菜：小白菜，2～3齡小菜蛾幼蟲，育苗營養(yǎng)缽，基質(zhì)土，光照培養(yǎng)箱，塑料罐。

實驗方案

育苗：將四種蔬菜分別播種于育苗盤當(dāng)中，做好標(biāo)記，標(biāo)明播種時間。

移栽：等待3～4天，幼苗長出3～4片葉子后，選擇長勢一致的幼苗，小心移植到營養(yǎng)缽中，移植過程中注意避免機械損傷。

培養(yǎng)：為了防止其他蟲害和機械損傷，將植株放置在光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行育苗培養(yǎng)。待幼苗長至四葉一心、八葉一心和十二葉一心，對幼苗進(jìn)行蟲吃處理。

蟲吃處理：實驗處理前，將小菜蛾進(jìn)行饑餓處理5h，然后把小菜蛾放置在葉片上，每棵植株上放置3頭。再把塑料罐的底部用剪刀剪去，透明塑料罐倒扣在營養(yǎng)缽上，這樣既能透氣又能透光，同時用圓形紙片將營養(yǎng)缽中的土全部蓋住，以上措施主要為了防止小菜蛾逃逸。

觀察與檢測：分別于不同時間進(jìn)行觀察并拍照記錄。蟲吃處理后，進(jìn)行硫苷含量的檢測。

硫苷提?。喝訒r以三株為一組處理，并且每組設(shè)置三次生物學(xué)重復(fù)，植株成熟并進(jìn)行接蟲處理采收后，分別做好標(biāo)記放入提前準(zhǔn)備好的網(wǎng)袋中，進(jìn)行液氮速凍保鮮。然后存放于-80℃冰箱，以便用于硫苷的提取和檢測。檢測時先對樣品進(jìn)行萃取，提取出硫苷后采用高效液相色譜法分析樣品中的硫苷含量[3]。

數(shù)據(jù)處理，采用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與作圖，SPSS進(jìn)行差異顯著性分析。

結(jié)果與分析

小菜蛾取食小白菜時間的探究

我們根據(jù)觀察實驗，發(fā)現(xiàn)小菜蛾對于小白菜的取食偏好主要集中在新生葉片部分，而且相比于八葉期植株和十二葉期植株，小菜蛾更偏好于取食四葉期植株。越靠近植株包心部分，受小菜蛾取食也更嚴(yán)重。此外，隨著時間的延長，蟲齡越大，植株被損害程度也越嚴(yán)重。

不同生長期小白菜硫苷含量的分析

通過文獻(xiàn)查詢確定植株體內(nèi)硫苷組分，使用高效液相色譜法對小白菜植株中不同種類的硫苷含量進(jìn)行分析，比較鑒定出小白菜植株中硫苷種類一共有8種（圖2），他們的名稱分別是：2-羥基-3-丁烯基硫苷、5-甲基亞硫酰戊烷基硫苷、3-丁烯基硫苷、4-羥基-3-吲哚基硫苷、4-戊稀基硫苷、2-苯乙基硫苷、4-甲氧基-3-吲哚基甲基硫苷、1-甲氧基-3-吲哚基甲基硫苷。

此外，不同時期總硫苷和各類硫苷的含量也有所不同，即四葉期植株、八葉期植株和十二葉期植株中葉片的硫苷含量也存在不同。從四葉期植株到八葉期植株，我們發(fā)現(xiàn)葉片中的硫苷含量呈顯著上升趨勢（p< 0.05），而八葉期植株硫苷含量則達(dá)到峰值，到十二葉期時植株的硫苷含量有所下降（圖3）。其中，小白菜植株中吲哚族和芳香族的硫苷含量變化趨勢與總硫苷含量的變化趨勢一致，即在八葉期時含量最高，而在四葉期和十二葉期含量較低。脂肪族硫苷的含量則是隨著葉期的生長而呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢，在十二葉期時含量達(dá)到了最低。另外，從圖中還可以發(fā)現(xiàn)，在不同的時期，小白菜植株中脂肪族硫苷、吲哚族硫苷和芳香族硫苷的含量分別占總硫苷含量的比重也有所不同。在植株四葉期時，脂肪族硫苷含量的占比是最高的，約占總硫苷含量的 65%;生長至八葉期時，吲哚族硫苷含量所占的比重最大，占總硫含量苷的 48%;到十二葉期時脂肪族硫苷與吲哚族硫苷的含量相差不大。此外，在這三個時期當(dāng)中，芳香族硫苷的含量所占比例都是最低的。

聯(lián)系我們的觀察實驗，這一結(jié)果告訴我們，對于小白菜植株來說，四葉期相比于八葉期和十二葉期來說更容易遭受昆蟲取食或者承受更多潛在的其他威脅，所以小白菜植株體內(nèi)產(chǎn)生了更多脂肪族硫苷來幫助植株抵御外界給小白菜帶來的危害;而隨著植株的生長，到八葉期時植株體內(nèi)的硫苷含量累計達(dá)到了峰值，且增加的硫苷也主要以吲哚族和芳香族硫苷為主，脂肪族硫苷含量則在慢慢減少。

小菜蛾取食后小白菜中硫苷含量變化

我們對不同時期的小白菜進(jìn)行含量檢測，發(fā)現(xiàn)小白菜在八葉期含量已累計達(dá)到峰值，說明此前小白菜硫苷含量處于加速積累狀態(tài)，因此為了減小因植株生長造成的硫苷含量增加的誤差，我們在探究小白菜被雜食性昆蟲小菜蛾取食后植株體內(nèi)硫苷含量的變化時，選擇的是長勢一致的八葉期植株，在光照培養(yǎng)箱中接同一時期的小菜蛾幼蟲，分別提取不同時間的對照植株和進(jìn)行了接蟲處理后葉片中的硫苷，利用高效液相色譜法進(jìn)行對照組和實驗組硫苷含量的鑒定。發(fā)現(xiàn)接蟲處理后植株總硫苷在被昆蟲危害的不同時間植株體內(nèi)硫苷含量的變化都有所不同（圖4）。

對小菜蛾取食后的72h內(nèi)選取了四個時間點：1h、24h、48h和72h進(jìn)行硫苷含量的檢測。我們發(fā)現(xiàn)，隨著時間的延長，不論是總硫苷含量還是各不同種類的硫苷含量，都表現(xiàn)出整體上升趨勢，這一結(jié)果說明小菜蛾取食確實能夠引起硫苷含量的增加。

在我們的實驗結(jié)果中，植株被昆蟲取食 1h 后，硫苷含量增加不顯著（p< 0.05），24h 后硫苷含量明顯上升，與對照差異性顯著，在48 h 后硫苷的含量呈增加趨勢，但上升的幅度卻逐漸減弱，被小菜蛾取食72h 時達(dá)到其最高值 2.02?mol/g，相比對照的 1.15?mol/ g，含量了上升將近 0.8 倍。在被小菜蛾取食前后，小白菜植株體內(nèi)的脂肪族硫苷在總硫苷含量中都確實占主要比重，而被小菜蛾取食 1h 后脂肪族硫苷明顯上升，隨取食時間的延長，脂肪族硫苷的含量逐漸升高，48h 達(dá)到最高值1.135?mol/ g，比對照組硫苷含量增加了 59%。此外，吲哚族硫苷含量的變化與總硫苷含量的變化趨勢一致，含量最高的 72h 相比于對照增加 136%。芳香族硫苷的含量較低，被小菜蛾取食24h 后達(dá)到最高，增加近 63.5%，而在被小菜蛾取食 48h 和 72h后，芳香族硫苷的含量都出現(xiàn)了顯著降低。

結(jié)果與討論

在抵御十字花科植物被害蟲取食方面，硫苷一直扮演者十分重要的角色。本實驗研究了小白菜在不同葉期時葉片中硫苷含量的變化，發(fā)現(xiàn)四葉期到八葉期硫苷含量加速累積，十二葉期時葉片中的硫苷含量下降，說明小白菜葉片在不同生長期的硫苷含量處于不斷的變化之中。硫苷在植株的體內(nèi)是不斷產(chǎn)生和積累的，而十二葉期硫苷含量的下降，則可能是因為植株中硫苷的積累速率是不高于植物的生長速率的，所以表現(xiàn)出來了硫苷在植株體內(nèi)出現(xiàn)含量降低的情況，同時也有可能是由于隨著植株的不斷生長和發(fā)育，葉片新合成的硫苷又被運輸?shù)搅酥参锏那o部或地下根等其他部位的器官所導(dǎo)致的。除此之外，本實驗還發(fā)現(xiàn)，小白菜在生長至四葉期時受昆蟲取食為害最為嚴(yán)重，所以小白菜植株體內(nèi)會產(chǎn)生更多硫苷希望幫助植株抵御昆蟲取食給小白菜帶來的危害，而這些產(chǎn)生的硫苷在植株生長至八葉期時累積達(dá)到了峰值;同時，在遭受害蟲取食為害1h，硫苷含量即開始上升，待被為害24-48h時，植株體內(nèi)的硫苷處于加速積累的過程，而且產(chǎn)生的硫苷也主要以脂肪族硫苷和吲哚族硫苷為主，這證明了小白菜在處于不利環(huán)境時，植株體內(nèi)會產(chǎn)生更多硫苷以幫助植株減少和抵御來自外界環(huán)境的侵害。

為了揭示害蟲取食植株后引起硫苷含量變化的反應(yīng)機理，我們利用害蟲小菜蛾對十字花科蔬菜品種小白菜進(jìn)行接蟲處理，能夠幫助我們更加深入地了解硫苷在植物抗蟲防御體系中所起到的重要作用。在我們的實驗中發(fā)現(xiàn)：在被害蟲取食72h 后，小白菜被害蟲取食的地上部葉片硫苷含量增加，說明硫苷介導(dǎo)的防御體系的確響應(yīng)了害蟲脅迫，對增加植物抗蟲的阻力也會起到一定的作用。此外，研究表明，硫苷可以在植物體內(nèi)形成非均勻分布的模式，而且在易受昆蟲取食的部位以及植物的繁殖器官當(dāng)中會容易積累更多硫苷。

在實驗過程中，由于時間和條件的限制，我們無法測量蟲體內(nèi)的解毒酶來觀察蟲體的變化，所以用測量植株內(nèi)的硫苷含量變化來進(jìn)行替代。不同植株和種類中硫苷的含量也存在很大差別，這些差別究竟對植物的防御起到了怎樣不同的影響，這些問題有待于我們進(jìn)一步去研究發(fā)現(xiàn)。明確以硫苷介導(dǎo)的植物防御機理，這對于將來在植物抗菌、抗蟲和抗病方面的研究將會有重要意義[4] 。

本研究創(chuàng)新點

在對各類文獻(xiàn)的查找過程中，我們發(fā)現(xiàn)雖然有關(guān)十字花科植物硫苷產(chǎn)生機制的研究比較多，但對于害蟲取食誘導(dǎo)十字花科產(chǎn)生硫苷防御機制的研究并不多。我們在本實驗中設(shè)置了植株在不同生長時期（四葉期、八葉期和十二葉期）被害蟲取食做比較，發(fā)現(xiàn)害蟲更傾向于取食四葉期植株，而且從四葉到八葉這一段時期硫苷是呈加速積累狀態(tài)的;此外我們還設(shè)置了被害蟲取食后不同時間（1h、24h、48h和72h）測量硫苷變化，發(fā)現(xiàn)被害蟲取食72h時達(dá)到最高值，而且脂肪族硫苷在植株防御機制中更起著主要作用。

研究感悟

植物為了生存必須拼盡全力，它們的祖先們由于承受了巨大的被取食的壓力，所以需要不斷進(jìn)化，進(jìn)化出了一系列防御機制。根據(jù)防御方式的不同，我們可以將這種進(jìn)化出來的優(yōu)異性狀防蟲術(shù)統(tǒng)分為兩類：一類是非常直接的，稱之為“直接防御”。比如，有些植物會讓自己變得很難吃，于是蟲子吃得就少了，或者干脆不吃了;有些植物長出堅硬鋒利的刺、毛，嚴(yán)禁蟲子靠近，或者給自己穿上厚厚的盔甲，增強角質(zhì)層的厚度，增多蠟質(zhì)的合成，讓蟲子們咬不動;植物還可以通過改變果實和葉片的形狀、大小、顏色，改變植株性狀等進(jìn)行直接防御。另外一類植物的防御方式是間接的，稱之為“間接防御”。有的植物在遭受蟲子襲擊的時候就釋放出一些揮發(fā)性化合物，釋放到空氣中，引誘植物的天敵前來捕食蟲子。此外，次生代謝產(chǎn)物在植物的整個代謝活動中都具有重要作用。大量的文獻(xiàn)表明，次生代謝物質(zhì)在植物的抗蟲、抗病、抗逆方面起重要作用，有的次生代謝產(chǎn)物可以增強植物的抗蟲性、抗病性，有的則可以作為植物逆境傳遞信號等，比如十字花科植物中特有的硫苷[5] 、橡膠樹產(chǎn)生的大量橡膠[6]和甜菊葉中特有的甜菊甙[7]等都是重要的植物次生代謝產(chǎn)物。

研究表明，植物和昆蟲的關(guān)系可以分為兩類：一類是相互受益，比如，昆蟲給植物傳播花粉，而植物為昆蟲提供食物然而，自然界中更普遍的植物和蟲的關(guān)系卻是第二類——單純的取食行為。事實上，所有的植物都會被至少一種蟲類所取食，這就是共進(jìn)化理論。植物為應(yīng)對極大的環(huán)境挑戰(zhàn)二形成了各自的防御機制，包括組成型防御，如許多植物都只是靠吸收土壤里的營養(yǎng)而生長，但豬籠草卻與眾不同——它不但靠吸收土壤里的營養(yǎng)而生長，還吸收昆蟲里的營養(yǎng);或誘導(dǎo)型防御，如植物通過進(jìn)化，產(chǎn)生一系列的次生代謝物，十字花科植物就產(chǎn)生了特殊的次生代謝產(chǎn)物——硫苷，保護(hù)了自身。在這個實驗當(dāng)中，我更加深刻地認(rèn)識了植物防御機制的重要性，雖然對我來說這個實驗比較難，但是在指導(dǎo)老師的幫助下我學(xué)會了很多知識，比如硫苷的提取、液相色譜圖的分析、怎樣去計算硫苷含量等，都是在學(xué)校里學(xué)不到的知識。這項研究讓我對化學(xué)、生物產(chǎn)生了很大興趣，希望未來我也可以為我國的科研事業(yè)出一把力！

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作者簡介：

李陽，女，漢，河南南陽?？茖W(xué)教師，碩士學(xué)歷，植物學(xué)專業(yè)。