孫孝文 劉誠 王慧敏

摘要 [目的]通過對(duì)3種活性污泥的長期馴化、微生物多樣性分析及優(yōu)勢菌篩選與復(fù)配，構(gòu)建一種對(duì)毒死蜱具有高降解活性的菌群。 [方法]以農(nóng)藥公司的3種不同廢水處理工序的污泥為材料，利用毒死蜱長期脅迫馴化以獲得高效降解毒死蜱的活性污泥;隨后，在馴化后的3種活性污泥中篩選優(yōu)勢菌株，并以篩選的菌株構(gòu)建復(fù)合菌群用于毒死蜱的降解。[結(jié)果]以毒死蜱為碳源，在馴化后的活性污泥中篩選到3株具有毒死蜱降解活性的菌株（Paracoccus MLCa-1、Klebsiella MLCp-2、Serratia MLCs-1），并對(duì)3種菌株進(jìn)行復(fù)配，構(gòu)建了復(fù)合菌群MLCF7。復(fù)合菌群MLCF7對(duì)100 mg/L毒死蜱降解率達(dá)82.84%。 [結(jié)論]復(fù)合菌群對(duì)毒死蜱具有高降解活性，表明其在農(nóng)藥污染生物修復(fù)中具有應(yīng)用潛力。

關(guān)鍵詞 毒死蜱;活性污泥;脅迫馴化;復(fù)合菌群;生物降解

中圖分類號(hào) X-172? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A? 文章編號(hào) 0517-6611（2021）13-0064-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.13.017

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Domestication and Screening of Chlorpyrifos degrading Bacteria and Construction of Composited Flora with High Chlorpyrifos degrading Capacity

SUN Xiao wen1，2，LIU Cheng2，WANG Hui min1

（1. Hubei Key Laboratory of Environmental and Health Effects of Persistent Toxic Substances， Institute of Environment and Health， Jianghan University， Wuhan，Hubei 430056;2. School of Life Sciences， Hubei University，Wuhan，Hubei 430062）

Abstract [Objective] Based on three activated sludges， through long term domestication， analysis of microbial diversity， and dominant bacteria screening and composition to construct a composited flora with high chlorpyrifos degrading capacity. [Method]Using sludge from 3 different wastewater treatment processes of pesticide companies as materials，the chlorpyrifos long term stress domestication was used to obtain activated sludge that efficiently degrades chlorpyrifos;subsequently， the dominant strains were screened from the three domesticated activated sludges， and the screened strains were used to construct a complex flora for the degradation of chlorpyrifos.[Result] Using chlorpyrifos as a carbon source， three dominant bacterial strains （Paracoccus MLCa 1， Klebsiella MLCp 2， and Serratia MLCs 1） were screened from these domesticated activated sludges when chlorpyrifos as the carbon source. A chlorpyrifos degrading flora was constructed by composition of these three dominant bacterial strains. The degradation capacity of the composited flora MLCF7 was reached 82.84% towards 100 mg/L chlorpyrifos. [Conclusion] The easily constructed composited flora MLCF7 has high degradation activities to chlorpyrifos， indicating it has the application potential for bioremediation of pesticide contamination.

Key words Chlorpyrifos;Activated sludge;Stress domestication;Composited flora;Biodegradation

毒死蜱是一種有機(jī)磷廣譜殺蟲劑，廣泛應(yīng)用于經(jīng)濟(jì)作物的病蟲害防治[1-2]。作為一種乙酰膽堿酯酶（AChE）的抑制劑，毒死蜱可以結(jié)合AChE并使其失去分解乙酰膽堿的能力，導(dǎo)致大量乙酰膽堿積累，從而使中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能喪失，最終導(dǎo)致昆蟲和哺乳動(dòng)物死亡[3-4]。毒死蜱在農(nóng)業(yè)上的大量持續(xù)使用，導(dǎo)致其在土壤和水中過量累積，從而對(duì)環(huán)境造成了嚴(yán)重的污染[1，5]。目前，已報(bào)道多種處理毒死蜱污染的方法，相較于傳統(tǒng)的物理化學(xué)方法（紫外光解、fenton 氧化法、臭氧氧化法和多相光催化降解等[6-9]），微生物修復(fù)法具有高效、廉價(jià)、無二次污染等特點(diǎn)，被認(rèn)為是安全有效的毒死蜱環(huán)境污染修復(fù)方法[10]?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)了一些來源于毒死蜱污染的土壤或者水體的毒死蜱降解菌株，包括Enterobacter、Pseudomonas、Serratia、Klebsiella、Bacillus、Paracoccus、Sphingopyxis、Ochrobactrum、Shewanella和Tistrella等[11-17]。相比單一微生物，復(fù)合菌群由于包含更健全的毒死蜱降解代謝基因，可有效避免降解途徑中中間產(chǎn)物積累且對(duì)環(huán)境具有更強(qiáng)的適應(yīng)性，更適合毒死蜱環(huán)境污染的修復(fù)。Vidya等[18]報(bào)道了來源于農(nóng)藥污染的土壤菌群（包含P.aeruginosa、B.cereus、Klebsiella sp.、S.marscecens）可以在30 d完全降解50 mg/L。Barathidasan等[19]報(bào)道了一種由Cellulomonas fimi 和Phanerochaete chrysosporium組成的菌群可以完全礦化毒死蜱，且其效果強(qiáng)于單種菌株。因此，開發(fā)新的毒死蜱降解菌群，將對(duì)毒死蜱農(nóng)藥污染修復(fù)有著積極意義。該研究使用來源于農(nóng)藥公司廢水處理工序的3種污泥，利用毒死蜱長期脅迫馴化以獲得高效降解毒死蜱的活性污泥;隨后，在馴化后的3種活性污泥中篩選優(yōu)勢菌株，并以篩選的菌株構(gòu)建了復(fù)合菌群用于毒死蜱的降解。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 活性污泥。3種活性污泥分別采集于湖北省農(nóng)藥公司中農(nóng)藥制備污水處理的不同工序?；钚晕勰郙LCa采集于好氧池I、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和V（1∶1∶1∶1∶1比例混合）;活性污泥MLCp采集于推流曝氣反應(yīng)池;活性污泥MLCs采集于SBR反應(yīng)器。

1.1.2 主要試劑。毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99.0%）、3，5，6-三氯-2-吡啶醇（TCP）（純度≥99.0%）購于Aladdin（中國，上海）。色譜級(jí)乙腈、二氯甲烷（純度≥99.8%）購于MREDA（中國，北京）。

1.1.3 培養(yǎng)基。LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.0 g、酵母提取物5.0 g、NaCl 10.0 g，pH 7.0～7.2。MSM培養(yǎng)基：Na2HPO4 5.8 g、KH2PO4 3.0 g、NaCl 0.5 g、NH4Cl 1.0 g、MgSO4·7H2O 0.25 g，pH 7.0～7.2。馴化補(bǔ)料培養(yǎng)基：葡萄糖10.0 g、（NH4）2SO4 0.5 g、MgSO4·7H2O 0.3 g、NaCl 0.3 g、KCl 0.3 g、FeSO4·7H2O 0.03 g、MnSO4·4H2O 0.03 g、酵母粉0.4 g，pH 7.0～7.2。

1.2 毒死蜱脅迫下活性污泥的馴化

將新鮮采集的3種活性污泥分別按30%的沉降比接種到含有90 mL無菌水的500 mL錐形瓶中，并補(bǔ)加50 mL滅菌的馴化補(bǔ)料培養(yǎng)基，使錐形瓶中液體的總體積為200 mL。28 ℃、150 r/min條件下進(jìn)行馴化7 d后，靜置過夜，倒出50 mL馴化體系上清，補(bǔ)加50 mL 新鮮的馴化補(bǔ)料培養(yǎng)基，并添加5 mg毒死蜱脅迫進(jìn)行下一輪馴化。此后，后一輪馴化體系比前一輪毒死蜱添加量遞增5 mg。循環(huán)馴化20次后，維持每輪100 mg毒死蜱添加量不變，繼續(xù)馴化4次，結(jié)束馴化。

1.3 活性污泥微生物多樣性檢測

1.3.1 活性污泥取樣。分別取3種活性污泥不同馴化時(shí)期（初始樣品，第10輪馴化樣品和最終馴化樣品）的活性污泥樣品各5 mL，8 000 r/min離心10 min去上清，活性污泥沉淀送至派森諾生物科技股份有限公司（中國，上海）進(jìn)行微生物多樣性分析。每個(gè)樣品取3組平行樣。

1.3.2

活性污泥微生物多樣性檢測及分析。微生物多樣性測序平臺(tái)為Illumina MiSeq。使用QIIME v1.8.0[20]對(duì)獲得的高通量測序數(shù)據(jù)剔除不可靠的序列。對(duì)得到的序列進(jìn)行合并，按97%的序列相似度對(duì)操作分類單元（OUT）進(jìn)行劃分;選取每個(gè)OTU中最豐富的序列作為OTU的代表序列。然后利用每個(gè)OUT的代表序列進(jìn)行分類狀態(tài)識(shí)別和系統(tǒng)發(fā)育分析。使用Chao1和Shannon指數(shù)考察微生物群落的Alpha多樣性。使用R軟件，對(duì)豐度前50位的屬進(jìn)行聚類分析并繪制熱圖。使用Metastats[21]分析樣品之間在屬水平上豐度的差異（P值<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異）。采用基于加權(quán)UniFrac距離的主坐標(biāo)分析方法（PCoA）對(duì)群落相似性進(jìn)行多維分析[22]。

1.4 毒死蜱檢測

1.4.1 HPLC法毒死蜱濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。色譜級(jí)乙腈配制0、50、100、150、200和250 mg/L的毒死蜱溶液，使用高效液相色譜儀LC-20A（SHIMADZU，日本）測定毒死蜱的濃度。色譜柱為Hypersil ODS-C18 反向色譜柱（4.6 mm×150 mm×5 μm）。流動(dòng)相為乙腈∶水=70∶30，流速1.0 mL/min，柱溫40 ℃，進(jìn)樣20 μL。檢測波長290 nm，毒死蜱的保留時(shí)間為7.8 min，峰面積和毒死蜱濃度呈正相關(guān)，回歸方程為峰面積= 9 951×毒死蜱濃度-22 414（R2=0.998）。

1.4.2 樣品中毒死蜱含量的檢測。取含毒死蜱溶液5.0 mL，加入2 倍體積的二氯甲烷萃取2次，回收下層有機(jī)相溶液，經(jīng)無水Na2SO4 脫水后，在烘箱中吹干，并重溶于5.0 mL的乙腈中。預(yù)試驗(yàn)顯示，萃取的回收率達(dá)90%。使用上述液相條件檢測，并根據(jù)毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中毒死蜱濃度。

1.5 毒死蜱降解菌的篩選與鑒定

1.5.1 毒死蜱降解菌的初篩。 將馴化后的活性污泥在初篩培養(yǎng)基I（MSM培養(yǎng)基添加100 mg/L毒死蜱）上進(jìn)行劃線分離;挑取生長良好的單菌落過夜活化，然后再在初篩培養(yǎng)基Ⅱ（MSM培養(yǎng)基添加200 mg/L毒死蜱）上進(jìn)行劃線分離;再將生長良好的單菌落過夜活化，最后在初篩培養(yǎng)基Ⅲ（MSM培養(yǎng)基添加500 mg/L毒死蜱）上進(jìn)行劃線分離，最終得到能夠以500 mg/L毒死蜱為碳源生長的菌株。

1.5.2 毒死蜱降解菌的復(fù)篩。將上述分離的菌株過夜活化，按1%接種量接種于含100 mg/L 毒死蜱的MSM 液體培養(yǎng)基中，28 ℃、150 r/min培養(yǎng)7 d，8 000 r/min離心10 min檢測上清液殘留毒死蜱濃度，并計(jì)算毒死蜱的降解率：

降解率=（1-Ct/C0）×100%，

式中，Ct為農(nóng)藥殘留濃度，C0為農(nóng)藥初始濃度。

1.5.3 毒死蜱降解菌的鑒定。挑取毒死蜱降解菌的單菌落，使用通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′），PCR擴(kuò)增16S rRNA基因序列。PCR 產(chǎn)物回收后與載體pClone007 Blunt Vector 連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞E.coli DH5α后送至武漢擎科生物技術(shù)公司進(jìn)行測序。將測序得到的結(jié)果在EzTaxon server 2.1 數(shù)據(jù)庫[23]中進(jìn)行比對(duì)后，采用CLUSTAL W對(duì)16S rRNA 基因序列進(jìn)行多序列比對(duì)，并利用MEGA 6.0 軟件[24]neighbor-joining method構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹分析，完成菌株鑒定。

1.6 復(fù)合菌群的構(gòu)建及其降解毒死蜱的效率測定

1.6.1 復(fù)合菌群的構(gòu)建。復(fù)合菌群由3 株經(jīng)過交叉平板劃線培養(yǎng)后沒有拮抗活性的毒死蜱降解菌株組成。將過夜活化的3 株單菌（MLCa-1、MLCp-2 和MLCs-1），按照1∶1∶1 的體積比比例混合，并按1%的接種量將混合菌液接種到新鮮的LB 培養(yǎng)基中。28 ℃、150 r/min培養(yǎng)24 h，即得到復(fù)合菌群（MLCF7）。

1.6.2 復(fù)合菌群降解毒死蜱的效率測定。將OD600 nm=1.0 的MLCF7按2%的接種量接種到含有100 mg/L毒死蜱MSM 培養(yǎng)基中，28 ℃、150 r/min培養(yǎng)7 d。采用上述HPLC法檢測毒死蜱的降解效率。

2 結(jié)果與分析

2.1 馴化后的活性污泥對(duì)毒死蜱的降解效果

3種來源于農(nóng)藥公司污水處理系統(tǒng)不同處理工序的活性污泥，在毒死蜱脅迫下，經(jīng)過6個(gè)月的馴化后，回收了降解活性穩(wěn)定的活性污泥。馴化后的活性污泥，以1%的添加量添加至含100 mg/L毒死蜱的MSM培養(yǎng)基中，在28 ℃、150 r/min的條件下，培養(yǎng)5 d，檢測毒死蜱降解效率。由圖1可見，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，3種活性污泥對(duì)毒死蜱的降解效率也不斷增強(qiáng)。3種活性污泥對(duì)毒死蜱的第5天降解效率排序?yàn)榛钚晕勰郙LCp（100.00%）> 活性污泥MLCs（87.59%）> 活性污泥MLCa（82.34%）。3種馴化后的活性污泥對(duì)毒死蜱的降解率均達(dá)到了80%以上，說明經(jīng)過毒死蜱的長期脅迫，活性污泥被成功馴化。

2.2 3種活性污泥在不同馴化時(shí)期的微生物多樣性分析

2.2.1 樣本微生物群落的Alpha多樣性。對(duì)3種活性污泥在不同馴化時(shí)期進(jìn)行了微生物多樣性分析。樣品包含初始樣品（MLCa-0、MLCp-0、MLCs-0）、第10輪馴化樣品（MLCa-2、MLCp-2、MLCs-2）和最終馴化樣品（MLCa-4、MLCp-4、MLCs-4）。每個(gè)樣本重復(fù)3次，使用A、B和C區(qū)別。

使用Chao1和Shannon指數(shù)評(píng)價(jià)樣本微生物群落的Alpha多樣性。Chao1指數(shù)值越大，表明群落的豐富度越高。Shannon指數(shù)值越高，表明群落的多樣性越高。由表1可知，3種活性污泥在毒死蜱的長期脅迫下的馴化過程中，微生物群落豐富度和多樣性呈現(xiàn)了不同的變化趨勢。來源于好氧池的活性污泥MLCa在馴化過程中微生物群落豐富度和多樣性均不斷下降;來源于推流曝氣反應(yīng)池的活性污泥MLCp在馴化過程中微生物群落豐富度不斷下降，多樣性先上升后下降;來源于SBR反應(yīng)器的活性污泥MLCs在馴化過程中微生物群落豐富度和多樣性均不斷上升。這可能與3種活性污泥原始微生物菌群組成差異有關(guān)。

2.2.2 基于UniFrac距離的PCoA主坐標(biāo)分析。?? 由圖2可知，每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)樣本，不同顏色的點(diǎn)屬于不同樣本（組），兩點(diǎn)之間的距離越近，表明2個(gè)樣本之間的微生物群落結(jié)構(gòu)相似度越高，差異越小。坐標(biāo)軸括號(hào)中的百分比代表了對(duì)應(yīng)的主坐標(biāo)所能解釋的原始數(shù)據(jù)中差異的比例。結(jié)果表明3種活性污泥在馴化的過程中，微生物群落結(jié)構(gòu)都發(fā)生了明顯的變化。菌群MLCp和MLCs馴化后微生物群落結(jié)構(gòu)較為相近，與MLCa馴化后微生物群落結(jié)構(gòu)差異較大。

2.2.3

結(jié)合聚類分析的群落組成熱圖。使用R 軟件，對(duì)樣本中豐度前50 位的屬進(jìn)行聚類分析并繪制熱圖。由圖3可知，馴化結(jié)束后，活性污泥MLCa 中主要優(yōu)勢菌群有Paracoccus sp.、Enterobacter sp.和Methylobacillus sp.等;活性污泥MLCp 中主要優(yōu)勢菌群有Klebsiella sp.、Pseudoxanthomonas sp.和Achromobacter sp.等;活性污泥MLCs 中主要優(yōu)勢菌群有Serratia sp.、Bacillus sp.和Pseudomonas sp.等。

2.3 毒死蜱降解菌的篩選及鑒定

2.3.1 毒死蜱降解菌的篩選。將3種馴化后的活性污泥在含毒死蜱的MSM固體培養(yǎng)基中經(jīng)過多次劃線分離篩選，共得到7株可以以500 mg/L毒死蜱為碳源生長的菌株，分別為來源于活性污泥MLCa的MLCa-1和MLCa-2，來源于活性污泥MLCp的MLCp-1、MLCp-2和MLCp-3以及來源于活性污泥MLCs的MLCs-1和MLCs-2。所有毒死蜱降解菌株經(jīng)過過夜活化后，按2%的接種量接種于含有100 mg/L 毒死蜱的MSM 培養(yǎng)基中，28 ℃、150 r/min培養(yǎng)7 d后，測定了菌株對(duì)毒死蜱的降解率。由圖4可知，所有毒死蜱降解菌株對(duì)毒死蜱均有降解作用，其中，降解率前三的菌株為MLCa-1（降解率為53.71%）、MLCp-2（降解率為51.85%）和MLCs-1（降解率為65.37%）。

2.3.2 毒死蜱降解菌的鑒定。篩選的毒死蜱降解菌株的16S rRNA基因，經(jīng)過CLUSTAL W多序列比對(duì)，MEGA 6.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹對(duì)菌株進(jìn)行鑒定。由圖5可知，MLCa-1與Paracoccus bengalensis JJJT的序列相似性為99.40%，MLCp-2與Klebsiella singaporensis LX3T的序列相似性為99.37%，MLCs-1與Serratia nematodiphila DSM 21420T的序列相似性為99.58%。因此將MLCa-1鑒定為Paracoccus sp.，MLCp-2鑒定為Klebsiella sp.，MLCs-1鑒定為Serratia sp.。

2.4 復(fù)合菌群MLCF7的構(gòu)建及其對(duì)毒死蜱的降解

2.4.1 MLCF7降解毒死蜱的生長曲線和降解曲線測定。復(fù)合菌群MLCF7按1%的接種量接種于含100 mg/L毒死蜱的MSM培養(yǎng)基中，150 r/min培養(yǎng)7 d，監(jiān)測毒死蜱的降解率。由圖6可知，在7 d的降解過程中，降解體系的菌液OD600 nm不斷上升，第5天后達(dá)到穩(wěn)定期。相應(yīng)地，在7 d的降解過程中，降解體系降解曲線也呈現(xiàn)不斷的上升趨勢。這表明復(fù)合菌群MLCF7可以降解毒死蜱，并利用毒死蜱為碳源生長。在第7天時(shí)，復(fù)合菌群MLCF7對(duì)毒死蜱的降解率達(dá)82.84%，由圖4可知，3株單菌對(duì)毒死蜱的降解率都在50%～60%。復(fù)合菌群對(duì)毒死蜱的降解顯著性高于3株單菌對(duì)毒死蜱的降解率。結(jié)果表明，3株單菌存在協(xié)同作用，提高了對(duì)毒死蜱的降解能力。

2.4.2 復(fù)合菌群MLCF7降解毒死蜱中間代謝產(chǎn)物研究。使用HPLC法檢測第1天、第3天、第7天復(fù)合菌群MLCF7降解毒死蜱體系代謝產(chǎn)物，由圖7可知，隨著降解時(shí)間增長，毒死蜱濃度不斷下降，中間產(chǎn)物TCP的濃度先上升后下降，直至消失。因此，復(fù)合菌群MLCF7 首先將毒死蜱降解成TCP，再進(jìn)一步地TCP 被降解成其他的小分子物質(zhì)。

3 結(jié)論與討論

對(duì)3種來源于農(nóng)藥公司廢水處理系統(tǒng)的污泥進(jìn)行毒死蜱長期脅迫下的馴化，得到了3種對(duì)100 mg/L毒死蜱降解率達(dá)80%以上的活性污泥。對(duì)3種活性污泥馴化的過程進(jìn)行微生物多樣性分析，發(fā)現(xiàn)毒死蜱脅迫下3種活性污泥的菌群發(fā)生了明顯的變化。其中，副球菌屬、克雷伯氏菌屬和沙雷式菌屬等菌屬在馴化的過程中被富集。通過以毒死蜱為碳源，在馴化后的活性污泥種篩選了3株毒死蜱降解細(xì)菌Paracoccus MLCa-1、Klebsiella MLCp-2和Serratia MLCs-1。以3種毒死蜱降解細(xì)菌構(gòu)建了復(fù)合菌群MLCF7，對(duì)100 mg/L毒死蜱降解率達(dá)82.84%。

3種毒死蜱降解菌對(duì)毒死蜱的降解活性較低，但復(fù)合后降解活性明顯增加，這種協(xié)同機(jī)制需進(jìn)一步研究。復(fù)合菌群MLCF7降解毒死蜱會(huì)形成中間產(chǎn)物TCP，然而TCP如何繼續(xù)被降解，也需進(jìn)一步研究。復(fù)合菌群MLCF7構(gòu)建簡單，易循環(huán)構(gòu)建使用，可避免活性污泥降解易退化的問題，在農(nóng)藥污染生物修復(fù)中具有應(yīng)用潛力。

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