陳歷儒，易勁翔，江 帆，胡宇倩，唐 磊，龍一夫

（1.岳陽(yáng)市農(nóng)業(yè)綜合檢驗(yàn)檢測(cè)中心，湖南 岳陽(yáng) 414000；2.岳陽(yáng)市農(nóng)作物質(zhì)量安全工程技術(shù)研究中心，湖南 岳陽(yáng) 414000）

黃茶是我國(guó)特有的輕發(fā)酵茶，是由綠茶發(fā)展而來(lái)，特殊的“悶黃”工藝造就了其獨(dú)特的“干茶黃、湯色黃、葉底黃”和滋味甘醇的品質(zhì)特征[1-2]。岳陽(yáng)是中國(guó)黃茶之鄉(xiāng)[3]，出產(chǎn)的君山銀針是我國(guó)十大名茶之一，2019 年，岳陽(yáng)黃茶產(chǎn)量已達(dá)8 017 t[4]，占全國(guó)黃茶總產(chǎn)量的60%以上，綜合產(chǎn)值達(dá)到50 億元。當(dāng)?shù)夭枞~產(chǎn)業(yè)的壯大除了黃茶特有品質(zhì)之外，質(zhì)量安全也是影響產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因素。為防治茶樹(shù)病蟲(chóng)害，提高茶葉產(chǎn)量，施用農(nóng)藥的種類(lèi)和用量不斷增加，農(nóng)藥殘留的隱患日益凸顯。目前針對(duì)黃茶的研究主要集中在品質(zhì)[5-7]、加工工藝[8-11]等方面，對(duì)黃茶的農(nóng)藥殘留及其檢測(cè)方法的探究罕有報(bào)導(dǎo)。在檢測(cè)多種農(nóng)藥殘留時(shí)，色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法已被廣泛應(yīng)用于茶葉的質(zhì)量安全檢測(cè)中，特別是UPLC- MS/MS 是測(cè)定多農(nóng)殘的可靠、靈敏的方法[12]。因此，筆者在國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法的基礎(chǔ)上[13]，探究岳陽(yáng)黃茶中農(nóng)藥殘留的基質(zhì)效應(yīng)，優(yōu)化出一種高效便捷的UPLC- MS/MS 檢測(cè)方法，以期為岳陽(yáng)黃茶質(zhì)量安全監(jiān)管和產(chǎn)業(yè)提質(zhì)升級(jí)提供科學(xué)、準(zhǔn)確的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試黃茶樣品由岳陽(yáng)黃茶授權(quán)企業(yè)——華容縣勝峰茶葉有限公司提供。

主要儀器、耗材：超高效液相色譜三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國(guó)Waters 公司UPLC-Xevo TQD，配電噴霧離子源）；IKAT-25 勻漿機(jī)（德國(guó)艾卡公司）；CF-16RN 高速離心機(jī)（日立工機(jī)株式會(huì)社）；PL-E 電子分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；RE-5299 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠(chǎng)）；Carbon/NH2小柱（waters, 1 g，6 mL；微孔濾膜（尼龍，13 mm×0.2 μm）。

農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：多菌靈、氧樂(lè)果、啶蟲(chóng)脒、吡蟲(chóng)啉、甲拌磷、苯醚甲環(huán)唑均為100 mg/L，購(gòu)于農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所。

主要試劑：乙腈（Merck）、甲醇（Merck）、乙酸銨（Anaqua）、甲苯（TEDIA）均為色譜純。試驗(yàn)用水為屈臣氏蒸餾水。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配置 混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：取1 個(gè)10 mL 容量瓶，將濃度為100 mg/L 的6 種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇定容配置成10 mg/L 的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

標(biāo)準(zhǔn)工作液：將混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液采用逐級(jí)稀釋法分別用甲醇和黃茶基質(zhì)凈化液配置成濃度為5、10、50、100、200、500 μg/L 的溶劑標(biāo)準(zhǔn)工作液和基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.2.2 基質(zhì)效應(yīng)評(píng)價(jià) 同一濃度下基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液和溶劑標(biāo)準(zhǔn)工作液的比值為絕對(duì)基質(zhì)效應(yīng)（AME），公式如下。

絕對(duì)基質(zhì)效應(yīng)（%）= 基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液峰面積/溶劑標(biāo)準(zhǔn)工作液峰面積×100

當(dāng)AME ＞100 %時(shí)，表明該基質(zhì)為增強(qiáng)效應(yīng)，AME ＜100 %時(shí)，該基質(zhì)為抑制效應(yīng)。當(dāng)|AME-1|≤20 %時(shí)，其數(shù)值在誤差范圍之內(nèi)，認(rèn)為該基質(zhì)沒(méi)有基質(zhì)效應(yīng)，若20 %＜|AME-1|＜50 %，則為中等基質(zhì)效應(yīng)，|AME-1|≥50 %，則為強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)[14-15]。

1.2.3 樣品前處理 （1）制樣：茶葉樣品為日常檢測(cè)中獲得的不含這6 種農(nóng)藥的空白黃茶樣品，樣品于不銹鋼粉碎機(jī)中粉碎，混勻過(guò)40目篩網(wǎng)并裝于密封袋中，于-25℃條件下備用。（2）提?。簻?zhǔn)確稱(chēng)取5.00 g 已制備黃茶樣品于100 mL 離心管中，加入10 mL 蒸餾水浸透，密封1 h 后，加入30 mL 乙腈，10 000 r/min勻漿提取1 min，加入氯化鈉約3 g，再次勻漿1 min，置于高速離心機(jī)中4 000 r/min 離心5 min。（3）凈化：移取4 mL 上清液于已預(yù)淋洗的Carbon/NH2柱上，用12 mL 乙腈與甲苯混合溶液（體積比為3 ∶1）分3 次洗脫凈化柱，收集全部濾液于雞心瓶中，45℃水浴旋轉(zhuǎn)濃縮至近干，用甲醇定容至4 mL，過(guò)0.22 μm 微孔濾膜后待測(cè)。

1.2.4 液相色譜條件 色譜柱：Waters C18柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），柱溫40℃，進(jìn)樣量1 μL。流動(dòng)相A：水；流動(dòng)相B：0.5 mmol/L 乙酸銨（含1%甲酸）；流動(dòng)相C：甲醇。梯度洗脫條件見(jiàn)表1。

表1 液相色譜洗脫條件參數(shù)

1.2.5 質(zhì)譜條件 采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM），電噴霧離子源為ESI+，毛細(xì)管電壓3.5 kV，離子源溫度150℃，脫溶劑氣溫度350℃，錐孔氣流量100 L/h，脫溶劑氣流量750 L/h。

1.2.6 添加回收與基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn) 以黃茶為空白樣品，在0.01、0.05、0.10 mg/kg 這3 個(gè)水平下對(duì)6 種農(nóng)藥進(jìn)行添加回收試驗(yàn)，每個(gè)水平5 個(gè)重復(fù)，考察檢測(cè)分析方法的準(zhǔn)確性和可靠程度。測(cè)定以黃茶基質(zhì)凈化液配置的 5、10、50、100、200、500 μg/L 系列混標(biāo)，以添加農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度（μg/L）為橫坐標(biāo)，相對(duì)應(yīng)的定量離子對(duì)響應(yīng)值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理方法優(yōu)化

目前茶葉農(nóng)殘檢測(cè)利用固相萃取的前處理方法中，分為提取和凈化2 部分，經(jīng)查閱文獻(xiàn)可知[16]，純乙腈較不同濃度的乙腈水溶液有更好的提取效果，因此，試驗(yàn)采用乙腈為提取劑；在提取液凈化時(shí)，F(xiàn)lorlisil 柱[17]、Carbon/NH2柱[18]和Cleanert-Florisil 固相萃取柱[19]效果較好，考慮到黃茶的成分復(fù)雜、色素過(guò)多，選擇含有石墨化碳的Carbon/NH2柱作為凈化柱，能夠準(zhǔn)確高效萃取出目標(biāo)農(nóng)藥。

2.2 儀器參數(shù)優(yōu)化

在正離子模式下分別對(duì)0.4 mg/L 的6 種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行母離子全掃描，確定穩(wěn)定的母離子。再進(jìn)行子離子掃描，篩選響應(yīng)值較高、干擾較小的2 個(gè)離子作為子離子，信號(hào)較高的離子作為定量離子，并優(yōu)化錐孔電壓和碰撞能量。最后在多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式下達(dá)到最佳監(jiān)測(cè)條件，詳見(jiàn)表2。

表2 6 種農(nóng)藥質(zhì)譜參數(shù)

2.3 基質(zhì)效應(yīng)分析

3 個(gè)濃度水平下的6 種農(nóng)藥在黃茶中的絕對(duì)基質(zhì)效應(yīng)均小于100 %（圖1），參照 1.2.2 節(jié)中的評(píng)價(jià)方法，表明該基質(zhì)對(duì)6 種農(nóng)藥均存在抑制現(xiàn)象；多菌靈和氧樂(lè)果在3 個(gè)濃度水平下的AME 為80.53%～97.67%，認(rèn)為沒(méi)有基質(zhì)效應(yīng)；吡蟲(chóng)啉和啶蟲(chóng)脒的AME 在22.33%～38.20%，屬于強(qiáng)基質(zhì)抑制效應(yīng)；苯醚甲環(huán)唑和甲拌磷的AME 在59.33%～78.43%，屬于中等基質(zhì)抑制效應(yīng)。3 個(gè)濃度水平下的6 種農(nóng)藥，其AME 的RSD 在0.57%～7.40%，分析結(jié)果精確可靠。

圖1 6 種農(nóng)藥在黃茶中的基質(zhì)效應(yīng)

2.4 方法驗(yàn)證分析

2.4.1 基質(zhì)標(biāo)液線(xiàn)性范圍 參照1.2.6 計(jì)算目標(biāo)農(nóng)藥的基質(zhì)標(biāo)液線(xiàn)性方程，相關(guān)結(jié)果見(jiàn)表3。6 種農(nóng)藥在范圍5～500 μg/L 內(nèi)呈良好的線(xiàn)性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.998 8～0.999 9，根據(jù)6 種農(nóng)藥在該儀器的響應(yīng)值，以10 倍信噪比（S/N=10）計(jì)算定量限。結(jié)果顯示，吡蟲(chóng)啉、多菌靈、苯醚甲環(huán)唑、啶蟲(chóng)脒、甲拌磷、氧樂(lè)果的定量限分別為1.0、0.1、0.3、0.3、0.4、1.0 μg/kg，均遠(yuǎn)低于最大殘留限量500、5 000、10 000、10 000、10 000、50 μg/kg，表明該方法可對(duì)這6 種農(nóng)藥進(jìn)行準(zhǔn)確定性、定量分析。

表3 6 種農(nóng)藥的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)、相關(guān)系數(shù)、線(xiàn)性范圍和定量限

2.4.2 農(nóng)藥總離子流色譜圖 在1.2.4 的色譜條件下，6 種農(nóng)藥基質(zhì)混合標(biāo)液（濃度為100 μg/L）的總離子流色譜圖如圖2所示。出峰順序依次為氧樂(lè)果、吡蟲(chóng)啉、啶蟲(chóng)脒、多菌靈、苯醚甲環(huán)唑和甲拌磷。色譜圖峰形良好，無(wú)雜質(zhì)干擾，均得到較好的分離。

圖2 100 μg/L 水平下6 種農(nóng)藥基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的LC-MS/MS 色譜圖

2.4.3 回收率和精密度 在黃茶中添加6 種農(nóng)藥進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，每個(gè)添加濃度重復(fù)5 次，結(jié)果見(jiàn)表4。3 個(gè)添加水平下6 種農(nóng)藥的平均加標(biāo)回收率在77.17%～101.28%，RSD 在0.97%～9.97%，滿(mǎn)足黃茶中6 種農(nóng)藥殘留量的定性定量分析要求。除苯醚甲環(huán)唑和啶蟲(chóng)脒外，4 種農(nóng)藥的加標(biāo)回收率隨添加濃度的增大而降低。

表4 6 種農(nóng)藥在黃茶中的加標(biāo)回收率、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=5）

3 結(jié)論與討論

試驗(yàn)對(duì)岳陽(yáng)黃茶中的吡蟲(chóng)啉、多菌靈、苯醚甲環(huán)唑、啶蟲(chóng)脒、甲拌磷、氧樂(lè)果進(jìn)行定性、定量檢測(cè)，其線(xiàn)性關(guān)系、回收率、精確度均符合要求，具有較好的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性，該試驗(yàn)方法簡(jiǎn)便快速、靈敏度高、適宜于大批量檢測(cè)，可廣泛應(yīng)用于檢測(cè)岳陽(yáng)黃茶中6種農(nóng)藥的殘留量。

在國(guó)標(biāo)檢測(cè)茶葉方法的基礎(chǔ)上[13]，探究建立一種高效便捷的利用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定岳陽(yáng)黃茶中6 種農(nóng)藥殘留量的分析方法，并對(duì)分析方法的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性進(jìn)行驗(yàn)證。該研究減少了乙腈提取次數(shù)，簡(jiǎn)化了凈化流程，確定了以乙腈為提取劑，Carbon/NH2柱為凈化柱，UPLC-MS/MS 檢測(cè)的方法。

對(duì)于流動(dòng)相的選擇，前人研究中各有不同，乙腈-水[20]、甲醇-水[15]、乙酸銨-乙腈[14]、乙酸銨溶液（含0.1 %甲酸）-甲醇[21]是常見(jiàn)的流動(dòng)相組合，經(jīng)過(guò)反復(fù)試驗(yàn)，探究不同流動(dòng)相組合對(duì)目標(biāo)農(nóng)藥分離度、峰形的影響，最終確定了甲醇-乙酸銨溶液（含0.1 %甲酸）-水的組合。

不同種類(lèi)茶對(duì)目標(biāo)農(nóng)藥檢測(cè)的基質(zhì)效應(yīng)各有差異。在青錢(qián)柳茶的農(nóng)藥殘留檢測(cè)中，啶蟲(chóng)脒和吡蟲(chóng)啉的基質(zhì)效應(yīng)為中等基質(zhì)抑制效應(yīng)[15]，杜仲茶中啶蟲(chóng)脒為弱基質(zhì)抑制效應(yīng)，吡蟲(chóng)啉為中等基質(zhì)抑制效應(yīng)[22]，綠茶中氧樂(lè)果的基質(zhì)效應(yīng)為中等基質(zhì)抑制效應(yīng)[23]，這與該試驗(yàn)中黃茶對(duì)目標(biāo)農(nóng)藥的基質(zhì)效應(yīng)存在差異，其主要原因在于茶葉基質(zhì)的不同，可見(jiàn)，探究岳陽(yáng)黃茶中農(nóng)藥殘留的分析方法非常必要。