姚 凱 吳沿友

(1.貴州師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 貴陽 550025；2.中國科學(xué)院地球化學(xué)研究所 環(huán)境地球化學(xué)國家重點實驗室 貴陽 550081)

氟離子主要通過植物根系吸收，并在木質(zhì)部隨蒸騰流向上運輸，最后儲藏積累在各器官(主要為葉片)中，抑制光合作用、呼吸作用以及其他代謝過程關(guān)鍵酶，影響植物生長代謝并最終導(dǎo)致植物死亡(Miller,1993;Fornasiero,2003;Elloumietal.,2005)，對早期幼苗的傷害作用尤為強烈(利鋒,2004;Weinsteinetal.,2004)。此外，氟中毒引起機體顯著的氧化應(yīng)激反應(yīng)，產(chǎn)生大量自由基和活性氧(ROS)，增加膜脂質(zhì)過氧化，并破壞胞內(nèi)蛋白酶的結(jié)構(gòu)(Izquierdo-Vegaetal.,2008;Barbieretal.,2010;Gutowskaetal.,2010)。而各種蛋白酶在植物光合、清除ROS系統(tǒng)和糖代謝過程中具有重要作用。在光合系統(tǒng)中，除核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶(ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase,Rubisco,EC 4.1.1.39)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase,PEPC,EC 4.1.1.31)等固定CO2的羧化酶以外，碳酸酐酶(carbonic anhydrase,CA,EC 4.2.1.1)等非直接固碳的酶也是不可或缺的。CA是催化CO2可逆水合反應(yīng)的一類含鋅金屬酶。在光合過程中，CA加速無機碳向羧化酶活性部位擴散以增強CO2的固定速率(蔣春云等,2013)。CA對陸地植物利用碳酸氫鹽具有重要的作用，特別是植物氣孔開放受環(huán)境因子限制時，CA被迅速激活(吳沿友等,2011)。逆境中的植物可通過葡萄糖代謝途徑的調(diào)控來響應(yīng)環(huán)境變化，并保持生長生理活性。植物葡萄糖代謝途徑的調(diào)控可體現(xiàn)在葡萄糖通過磷酸戊糖途徑(pentose phosphate pathway,PPP)和糖酵解途徑(glycolytic pathway,EMP)代謝的份額變化。PPP途徑和EMP途徑是生物體糖代謝系統(tǒng)的核心。已有研究表明，在非生物脅迫下，葡萄糖代謝從EMP途徑轉(zhuǎn)移到PPP途徑(Yuetal.，1967；Lietal.,2011;Liuetal.,2013)。PPP途徑的激活可產(chǎn)生大量NADPH，為維持抗氧化酶活性提供還原力；同時增強核酮糖-5-磷酸(RuMP)的再生以促進(jìn)Calvin-Benson循環(huán)。磷酸果糖激酶(phosphofructokinase,PFK,EC 2.7.1.11)和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(glucose-6-phosphatedehydrogenase,G6PDH,EC 1.1.1.49)分別是EMP途徑和PPP途徑的限速酶，控制著葡萄糖通過這2種途徑的代謝份額。

金屬離子是金屬酶活性中心的重要組成部分，氟元素易與帶正電的金屬離子形成不溶絡(luò)合物，所以能抑制許多金屬酶的活性。長時間高濃度的氟處理可強烈抑制植物呼吸作用過程中的酶活性，并不可逆地?fù)p害線粒體的結(jié)構(gòu)甚至使其功能完全喪失(Yuetal.,1967;Lietal.,2011)；另一方面，氟離子能與圍繞酶活性中心的氨基酸官能團(tuán)結(jié)合，使酶的構(gòu)象發(fā)生變化而失活(Chlubeketal.,2003;Chlubek,2003)。NaF也常被用為EMP途徑的抑制劑。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與培養(yǎng)

選取喀斯特適生樹種構(gòu)樹為研究對象，種子收集于中國科學(xué)院地球化學(xué)研究所老園區(qū)。選取籽粒飽滿的種子，置于盛有珍珠巖的育苗盒中，種子上覆蓋薄層珍珠巖，育苗盒中注入適量的蒸餾水，以不浸泡種子為宜。光照培養(yǎng)箱的溫度設(shè)置為25 ℃、光周期為12 h。種子在播種后12天開始萌發(fā)，幼苗出現(xiàn)4片真葉后，選取健壯的幼苗移栽。移栽后每個育苗盒栽培2株幼苗，并保持適當(dāng)間距以保證幼苗生長至適合試驗大小時不互相遮蓋光照。將移苗后的育苗盒置于人工氣候室內(nèi)，設(shè)置光周期為12 h，光照強度為300 μmol·m-2s-1，日間氣溫為25 ℃，夜間氣溫為20 ℃，相對濕度為55%～65%。添加1/2濃度的Hoagland營養(yǎng)液為構(gòu)樹幼苗提供營養(yǎng)和水分。

1.2 試驗處理

待植株高度達(dá)到12～13 cm時，選取生長均一的幼苗進(jìn)行試驗(表1)。在營養(yǎng)液中加入NaF和NaHCO3制成處理液，本試驗共有4個處理組，即對照組、3 mmol·L-1NaF處理組、3 mmol·L-1NaHCO3處理組和3 mmol·L-1NaF+3 mmol·L-1NaHCO3處理組。因試驗大背景為喀斯特生境，故各組處理液的pH值均調(diào)為7.8。隔天在固定時間更換處理液。第0 天和第6天時，測量植株的各項生長指標(biāo)。因?qū)挾仍?0 mm左右的葉片生長活性較強且數(shù)量較多，故以此標(biāo)準(zhǔn)采集葉片為樣品，-80 ℃冷凍保存，用于測試植株葉片的各項生理生化指標(biāo)。所有指標(biāo)均設(shè)置5個重復(fù)。

表1 處理前構(gòu)樹的生長指標(biāo)①Tab.1 The growth parameters of Broussonetia papyrifera before treatments

1.3 植株生長參數(shù)測定

處理后，分別于第0天和第6天測量植株的生長指標(biāo)。選取株高(H)、基徑(Db)、葉片數(shù)(N)和葉寬≥70 mm的葉片數(shù)(N70)作為衡量植物生長的指標(biāo)。

1.4 構(gòu)樹葉片中酶液的提取

根據(jù)Liu等(2013)的方法并稍作修改，提取葉片中的酶。取0.1 g的構(gòu)樹葉片置于冰浴研缽中并加入液氮研磨。待液氮揮發(fā)后，加入1 mL酶提取液，其中含有50 mmol·L-1HEPES Tris-HCl(pH7.8)，3 mmol·L-1MgCl2，1 mmol·L-1EDTA，1 mmol·L-1二硫蘇糖醇和1 mmol·L-1苯甲基磺酰氟。把研磨后的勻漿移入離心管中，在4 ℃下，12 000×g離心20 min，取上清液冷藏待測。

1.5 構(gòu)樹葉片中G6PDH酶活性測定

根據(jù)Tian等(1998)的方法并稍作修改，測定G6PDH酶活性。首先測定G6PDH和6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶(6-phosphogluconate dehydrogenase,6PGDH,EC 1.1.1.44)的總活性，把200 μL酶提取液加入到1.8 mL G6PDH和6PGDH總酶活性分析液中以測定G6PDH和6PGDH的總活性。G6PDH和6PGDH總酶活性分析液中含有50 mmol·L-1HEPES Tris-HCl(pH7.8)，3.3 mmol·L-1MgCl2，0.5 mmol·L-16-磷酸葡萄糖酸酯二鈉鹽，0.5 mmol·L-16-磷酸葡萄糖酸酯和0.5 mmol·L-1NADPNa2。把200 μL酶提取液加入到1.8 mL 6PGDH酶活性分析液中以測定6PGDH的酶活性。6PGDH酶活性分析液中含有50 mmol·L-1HEPES Tris-HCl(pH7.8)，3.3 mmol·L-1MgCl2，0.5 mmol·L-16-磷酸葡萄糖酸酯和0.5 mmol·L-1NADPNa2。用紫外分光光度計測定反應(yīng)混合液在340 nm處的光吸收，以測量反應(yīng)混合液中NADP+還原為NADPH的速率的變化。G6PDH酶活性的值等于G6PDH和6PGDH總酶活性值減去6PGDH酶活性值。

1.6 構(gòu)樹葉片中PFK酶活性測定

根據(jù)Carnal和Black(1983)的方法并稍作修改，測定PFK的活性。PFK酶活性等于ATP-PFK酶活性加上焦磷酸(PPi)-PFK酶活性。為測定ATP-PFK酶活性，把200 μL酶提取液加入到1.8 mL ATP-PFK酶活性分析液中，分析液中含有50 mmol·L-1HEPES Tris-HCl(pH7.8)，2.5 mmol·L-1MgCl2，0.1 mmol·L-1NADH，5 mmol·L-1果糖-6-磷酸，2 U·mL-1醛縮酶(aldolase,EC 4.1.2.13)，1 U·mL-1丙糖磷酸異構(gòu)酶(triose-phosphate isomerase,TPI,EC 5.3.1.1)，2 U·mL-13-磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH,EC 1.2.1.12)和1 mmol·L-1ATP；為測定PPi-PFK酶活性，把200 μL酶提取液加入到1.8 mL PPi-PFK酶活性分析液中，分析液中含有50 mmol·L-1HEPES Tris-HCl(pH7.8)，2.5 mmol·L-1MgCl2，0.1 mmol·L-1NADH，5 mmol·L-1果糖-6-磷酸，2 U·mL-1醛縮酶，1 U·mL-1TPI，2 U·mL-1GAPD和1 mmol·L-1PPi。用紫外分光光度計測定反應(yīng)混合液在340 nm處的光吸收，以測量反應(yīng)混合液中NADH氧化為NAD+的速率的變化。

1.7 葡萄糖通過EMP途徑和PPP途徑代謝的比例計算

計算出PFK酶活性為EApfk，G6PDH酶活性為EAg6pdh，同時假設(shè)生物體內(nèi)參與葡萄糖代謝的代謝途徑的關(guān)鍵酶的總活性為EA∑，除EMP途徑和PPP途徑之外參與葡萄糖代謝的各途徑的限速酶活性為EAelse，且各途徑的限速酶的活性代表了各途徑葡萄糖代謝的份額。則生物體內(nèi)葡萄糖通過EMP途徑代謝的占比PEMP可表示為：

PEMP=EApfk/(EApfk+EAg6pdh+EAelse)×100% 。

(1)

同理，PPP途徑在葡萄糖代謝中的占比PPPP可表示為：

PPPP=EAg6pdh/(EApfk+EAg6pdh+EAelse)×100% 。

(2)

在植物細(xì)胞中，約75%的葡萄糖通過EMP代謝，15%～30%的葡萄糖通過PPP代謝(Copelandetal.，1987；Debnametal.，2004),EAelse的占比很??；且在本文中只研究PFK和G6PDH的酶活性關(guān)系，所以在式1和式2中，EAelse可忽略。葡萄糖通過EMP途徑代謝與通過PPP途徑代謝的份額比可簡單表示為：

P=PEMP∶PPPP=EApfk∶ EAg6pdh。

(3)

1.8 構(gòu)樹葉片中CA的提取及活性測定

按照吳沿友等(2011)的方法測定CA的活性。稱取0.1 g左右鮮質(zhì)量的構(gòu)樹葉片，置于冰浴的研缽中并加入液氮研磨，再加入3 mL的CA提取液(pH8.30)，其中含有0.01 mol·L-1巴比妥鈉、0.05 mol·L-1巰基乙醇，持續(xù)研磨至勻漿。把葉片勻漿轉(zhuǎn)移到5 mL的離心管中，4 ℃下，12 000×g離心5 min，取上清液置于離心管中，冷藏待測。CA活性的測定方法如下：將測定的反應(yīng)系統(tǒng)置于0 ～ 2 ℃的低溫環(huán)境中，取CA提取液400 μL，加入到反應(yīng)液中，反應(yīng)液為4.5 mL巴比妥鈉緩沖液(20 mmol·L-1，pH8.30)，同時加入3 mL預(yù)冷溫度為0 ～ 2 ℃的飽和CO2蒸餾水。用pH銻電極測量整個反應(yīng)體系中的電位變化并記錄電位隨時間變化的過程曲線，根據(jù)該時間-電位曲線得到添加CA提取液和空白條件下反應(yīng)體系內(nèi)單位電位值下降的時間t和t0。t0為空白處理所需的時間，t為樣品所需的時間。CA活性單位為WAU·g-1，其計算公式為WA=(t/t0-1)。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

利用統(tǒng)計分析軟件SPSS(20.0版本)對不同處理水平間試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行單因子顯著性差異分析(P≤ 0.05)。插圖均用Origin(9.0版本)軟件繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 NaF和NaHCO3處理對構(gòu)樹生長指標(biāo)的影響

測量植株地上部分的各項生長指標(biāo)以評估構(gòu)樹在NaF和NaHCO3處理下的生長情況(表2)。較之對照組，營養(yǎng)液中添加3 mmol·L-1NaF的處理下構(gòu)樹的H和Db的增長均受嚴(yán)重抑制，N和N70也停止增長。在添加3 mmol·L-1NaF+ 3 mmol·L-1NaHCO3處理組中，植株的各項生長指標(biāo)也受到嚴(yán)重抑制，但抑制程度與單獨添加NaF組相比較低。4個處理組中，植株的生長情況在添加3 mmol·L-1NaHCO3處理組最好，各項生長指標(biāo)均略高于對照組。

表2 NaF和NaHCO3處理下構(gòu)樹的生長和光合指標(biāo)Tab.2 The growth and photosynthetic parameters of Broussonetia papyrifera under NaF and NaHCO3 treatments

2.2 NaF和NaHCO3處理對PFK酶活性的影響

處理6天后，各處理組ATP-PFK和PPi-PFK的酶活性及PFK酶的總活性如圖1所示。在3 mmol·L-1NaF處理組，構(gòu)樹葉片中ATP-PFK酶活性下降到對照組的66%左右，而PPi-PFK的酶活性下降到對照組的16%左右；在3 mmol·L-1NaHCO3處理組，ATP-PFK酶活性為對照組的110%，PPi-PFK酶活性上升到對照組的161%左右；在3 mmol·L-1NaF+3 mmol·L-1NaHCO3處理組，ATP-PFK和PPi-PFK的酶活性分別為對照組的122%和39%，為NaHCO3處理組的111%和24%，為NaF處理組的185%和241%。

圖1 不同處理組構(gòu)樹葉片中ATP-PFK (A)、PPi-PFK (B)和PFK (C)酶活性的變化Fig.1 The activities of ATP-PFK (A),PPi-PFK (B)and PFK (C)in leaves of Broussonetia papyrifera seedlings under different treatments不同字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。下同。Different letters indicate significant differences between treatments (P<0.05).The same below.

PFK酶總活性在3 mmol·L-1NaF處理組僅為對照組的47%左右；在3 mmol·L-1NaHCO3處理組，PFK酶活性最高，為對照組的129%左右。而在3 mmol·L-1NaF+3 mmol·L-1NaHCO3處理組中，PFK的酶活性分別為對照組的90%、NaHCO3處理組的70%、NaF處理組的193%。

2.3 NaF和NaHCO3處理對G6PDH酶活性的影響

由圖 2可知，在3 mmol·L-1NaF處理組，構(gòu)樹葉片中G6PDH酶活性上升為對照組的157%；3 mmol·L-1NaHCO3處理組G6PDH酶活性為對照組的87%；3 mmol·L-1NaF+3 mmol·L-1NaHCO3處理組的G6PDH酶活性分別為對照組的145%、NaHCO3處理組的167%、NaF處理組的92%。

圖2 不同處理組構(gòu)樹葉片中G6PDH酶活性的變化Fig.2 The activities of G6PDH in leaves of B. papyrifera seedlings under different treatments

2.4 NaF和NaHCO3處理下構(gòu)樹葉片中葡萄糖代謝途徑的轉(zhuǎn)移

如圖3所示，在對照組中，葡萄糖通過EMP途徑代謝所占的比例(PEMP)為70%，通過PPP途徑代謝的比例(PPPP)為30%；3 mmol·L-1NaHCO3處理組，PEMP和PPPP分別為78%和22%；3 mmol·L-1NaF的處理組，PEMP下降到42%，PPPP上升為58%；而在3 mmol·L-1NaF+3 mmol·L-1NaHCO3處理組，PEMP和PPPP分別為60%和40%。同時，各處理組的糖代謝總量排序為：NaF處理組<對照組

圖3 不同處理組構(gòu)樹葉片中葡萄糖代謝途徑的歧化狀況Fig.3 Disproportionation of glucose metabolism in leaves of B. papyrifera seedlings under different treatments

2.5 NaF和NaHCO3處理對CA酶活性的影響

各處理組CA酶活性如圖4所示。在3 mmol·L-1NaF處理組，構(gòu)樹葉片中CA酶活性為對照組的98%；3 mmol·L-1NaHCO3處理組中葉片CA酶活性為對照組的287%；3 mmol·L-1NaF+3 mmol·L-1NaHCO3處理組CA酶活性分別為對照組的107%、NaHCO3處理組的37%、NaF處理組的109%。

圖4 不同處理組構(gòu)樹葉片中CA酶活性的變化Fig.4 The activities of CA in leaves of B. papyrifera seedlings under different treatments

3 討論

在營養(yǎng)液中添加3 mmol·L-1NaF對構(gòu)樹生長產(chǎn)生顯著的抑制作用，株高、基徑和葉片數(shù)等指標(biāo)均顯著低于對照組。與環(huán)境因子脅迫會誘導(dǎo)植株某些器官生長增加不同，F(xiàn)-對植株各部分生長都顯著抑制，且葉片顏色較對照組明顯偏黃。有研究表明，F(xiàn)-在植物葉片中易與Mg2+結(jié)合形成MgF+絡(luò)合物從而顯著降低光合色素(特別是葉綠素)的濃度(Trappetal.,1995;Deyetal.,2012)，導(dǎo)致葉片顏色偏黃并使植物的光合能力顯著下降，因此植株各個器官的生物量積累和生長都會受到抑制。通過對植株光合指標(biāo)的研究也發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)-處理顯著抑制植株的Pn和gs。此前也有研究報道，氟化物能夠通過抑制Rubisco酶活性使植物的碳同化能力受到抑制(徐麗珊等，2003)。通過研究構(gòu)樹葉片中PFK酶活性發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)-對ATP-PFK和PPi-PFK的活性都產(chǎn)生了抑制作用，其中，對PPi-PFK的抑制作用尤為強烈。同時，G6PDH酶活性受到F-處理激活。NaF處理抑制EMP途徑并激活PPP途徑現(xiàn)象與其他學(xué)者的研究結(jié)果(Yuetal.，1967；Lietal.,2011)一致。PPP途徑的激活可為清除F-脅迫下植物產(chǎn)生的過量ROS物質(zhì)提供更多的還原力，對維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整和代謝酶的活性具有重要的作用。

4 結(jié)論