馬曉博，吳 磊，張 斌，張?zhí)m天，蓋麗娜

（河北省食品檢驗研究院，河北省食品安全重點實驗室，河北 石家莊 050200）

左旋肉堿又被稱為維生素BT，是一種類維生素營養(yǎng)素，其作為營養(yǎng)強化劑廣泛應用于嬰幼兒食品、減肥類保健品、中老年人營養(yǎng)補充食品中[1-4]。左旋肉堿通過調(diào)節(jié)線粒體內(nèi)酰基的比例，促進支鏈氨基酸正常代謝，在嬰兒利用脂肪作為能量來源的代謝中起著重要作用，因此左旋肉堿是嬰幼兒必需營養(yǎng)物質(zhì)[5-7]。GB 25596—2010《食品安全國家標準 特殊醫(yī)學用途嬰兒配方食品通則》[8]和GB 29922—2013《食品安全國家標準 特殊醫(yī)學用途配方食品通則》[9]規(guī)定，左旋肉堿作為特殊醫(yī)學用途配方食品的可選擇性成分，其添加量≥0.3 mg/kJ。特殊醫(yī)學用途嬰兒配方食品作為嬰幼兒早期甚至長期賴以生存的主要食物來源，其質(zhì)量應得到嚴格控制[5]。

目前，左旋肉堿的檢測方法主要有高效液相色譜法、質(zhì)譜法、離子色譜法和分光光度法等[10-18]。GB 29989—2013《食品安全國家標準 嬰幼兒食品和乳品中左旋肉堿的測定》[19]中的檢測方法為分光光度法，該方法較其他方法具有操作簡單的優(yōu)點，是目前檢測機構(gòu)普遍采用的方法[19-20]。本研究在GB 29989—2013的基礎上，針對特定基質(zhì)配方的特殊醫(yī)學用途嬰兒配方乳粉，從標準曲線制作、樣品前處理、乙酰肉堿轉(zhuǎn)移酶配制等幾個方面進行分析優(yōu)化，研究其對左旋肉堿測定的影響，為特殊醫(yī)學用途嬰兒配方乳粉檢測提供參考[21]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

市售嬰幼兒配方乳粉、氨基酸配方、乳蛋白深度水解和部分水解配方特殊醫(yī)學用途嬰兒食品（3 類特殊醫(yī)學用途乳粉配料均含有麥芽糊精），各10 批次。

α-淀粉酶（酶活力≥3.7 U/mg） 北京奧博星生物技術有限責任公司；乙二胺四乙酸二鈉、高氯酸、氫氧化鈉、氫氧化鉀（均為分析純） 天津永大化學試劑有限公司；乙酰輔酶A、乙酰肉堿轉(zhuǎn)移酶 美國Sigma試劑公司；2-硝基苯甲酸、N-2-羥乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司；左旋肉堿標準品（純度98.5%） 北京曼哈格生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

UV2700紫外-可見分光光度計 日本島津儀器有限公司；MS204S/01電子分析天平 瑞士梅特勒-托利多公司；PHS-3C pH計 上海儀電科學儀器股份有限公司；CT15RT高速冷凍離心機 上海天美生化儀器設備工程有限公司；TWS-24恒溫水浴鍋 上海喆圖科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 試劑配制

左旋肉堿標準儲備液（78.8 μg/mL）：準確稱取20 mg于（102±2） ℃烘箱中烘干2 h的左旋肉堿標準品，用去離子水定容至250 mL容量瓶。

左旋肉堿標準工作液：分別吸取左旋肉堿標準儲備液0.25、0.50、1.00、2.00、3.00、5.00 mL于25 mL容量瓶中，用去離子水定容至刻度，混勻，該系列標準溶液質(zhì)量濃度分別為0.788、1.576、3.152、6.304、9.456、15.760 μg/mL，現(xiàn)用現(xiàn)配。

乙酰輔酶A溶液：稱取20.0 mg乙酰輔酶A，溶于2.0 mL去離子水中?，F(xiàn)用現(xiàn)配。

乙酰肉堿轉(zhuǎn)移酶溶液：吸取100 μL乙酰肉堿轉(zhuǎn)移酶懸浮液，6 000 r/min離心10 min，棄去上層清液，沉淀用2 mL去離子水溶解。現(xiàn)用現(xiàn)配。

顯色儲備液：分別稱取50 mg 2-硝基苯甲酸、5.96 mgN-2-羥乙基哌嗪-2-乙烷磺酸、185 mg乙二胺四乙酸二鈉，溶于30 mL去離子水中，用10 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至7.4～7.6，然后用去離子水定容至50 mL。

顯色工作液：吸取5.0 mL顯色儲備液，用去離子水定容至25 mL。

1.3.2 樣品前處理

準確稱取5 g（精確至0.000 1 g）混合均勻的乳粉試樣于燒杯中，用30 mL 40 ℃溫水溶解并轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，準確加入0.25 gα-淀粉酶，混勻后于50 ℃水浴酶解30 min；取出冷卻，加入10 mL體積分數(shù)13%高氯酸溶液，混勻靜置20 min；用蒸餾水定容至刻度，搖勻，用定量快速濾紙過濾。

待測液制備：取濾液20 mL于50 mL離心管中，用4 mol/L氫氧化鉀溶液調(diào)節(jié)pH 12.5～13.0，置于40 ℃水浴60 min；取出冷卻后，先用體積分數(shù)13%高氯酸溶液調(diào)節(jié)pH 9.5～10.0，再用體積分數(shù)5%高氯酸溶液調(diào)節(jié)pH 7.0～7.5；將樣液移入50 mL容量瓶，用去離子水定容，將樣液置于4 ℃冰箱中過夜，取出放置至室溫，用一次性醫(yī)用注射器吸取上清液，通過0.45 μm水基膜過濾于50 mL離心管內(nèi)，備用。

1.3.3 標準曲線繪制及試樣測定

分別吸取左旋肉堿標準工作液和試樣待測液2 mL于1 cm比色皿中，依次加入0.8 mL顯色工作液和0.1 mL乙酰輔酶A溶液，用滴管混勻，置于分光光度計樣品槽，空白比色皿中放蒸餾水。將波長設置為412 nm，5 min后歸零。迅速加入0.1 mL左旋肉堿轉(zhuǎn)移酶溶液，混勻，反應10 min后記錄吸光度。以左旋肉堿標準工作液質(zhì)量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，制作標準曲線。樣品中左旋肉堿含量按下式計算。

式中：ρ為從標準曲線查得的試樣處理液質(zhì)量濃度/（μg/mL）；V為濾液體積/mL；m為試樣質(zhì)量/g。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel軟件進行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 左旋肉堿標準工作曲線優(yōu)化

與GB 29989—2013相比，本研究增加吸取0.25 mL標準儲備液、對應標準溶液質(zhì)量濃度為0.788 μg/mL作為標準曲線第1點。依據(jù)GB 29989—2013，以標準溶液質(zhì)量濃度分別為1.576、3.152、6.304、9.456、15.760 μg/mL繪制所得標準曲線為y=0.055 3x＋0.008 0（R2=999 9）；以標準溶液質(zhì)量濃度分別為0.788、1.576、3.152、6.304、9.456、15.760 μg/mL繪制所得標準曲線為y=0.055 4x＋0.005 6（R2=999 9），2 條標準曲線無明顯差異。標準溶液在0.789～15.776 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與吸光度呈良好線性關系。實際樣品檢測過程中，部分左旋肉堿含量低于7.5 mg/100 g的特殊醫(yī)學用途配方乳粉吸光度低于0.092 8（稱樣量5 g，吸光度0.090 9），導致結(jié)果不在第2條標準曲線范圍內(nèi)，測定結(jié)果不準確。質(zhì)量濃度最低點（0.788 μg/mL）吸光度8 次測定結(jié)果分別為0.046 2、0.046 1、0.046 1、0.045 9、0.046 2、0.046 0、0.045 9、0.046 3，相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）為0.32%，表明該點吸光度穩(wěn)定。因此，對于低含量左旋肉堿樣品，檢測過程應采用第2條標準曲線[21]。

2.2 乙酰肉堿轉(zhuǎn)移酶溶液制備轉(zhuǎn)速優(yōu)化

實驗中發(fā)現(xiàn)，乙酰肉堿轉(zhuǎn)移酶懸浮液經(jīng)1 500 r/min離心10 min，上清液未完全澄清，棄去上清液會導致轉(zhuǎn)移酶實際含量降低。

研究乙酰肉堿轉(zhuǎn)移酶懸浮液離心轉(zhuǎn)速與上清液透光率的關系，透光率采用紫外-可見分光光度計直接測定。由圖1可知，隨著轉(zhuǎn)速的增加，乙酰肉堿轉(zhuǎn)移酶溶液的透光率明顯增大，轉(zhuǎn)速為5 500 r/min后趨于穩(wěn)定，因此確定6 000 r/min為最佳轉(zhuǎn)速。

圖1 乙酰肉堿轉(zhuǎn)移酶溶液透光率隨離心轉(zhuǎn)速的變化Fig. 1 Change in transmittance of acetylcarnitine transferase solution with centrifugal speed

2.3 前處理條件優(yōu)化

在檢測過程中發(fā)現(xiàn)氨基酸配方、乳蛋白深度水解配方和部分水解配方特殊醫(yī)學用途嬰兒配方乳粉存在如下問題：經(jīng)高氯酸沉淀蛋白質(zhì)后試樣溶液過濾困難，影響實驗效率；制得試樣備用液顏色較深，影響吸光度測定；加標回收率較低等。原因是樣品配料中添加的麥芽糊精黏度較大，會附著濾紙孔，導致過濾速度較慢和濾液渾濁；同時高氯酸沉淀劑不能將其沉淀下來，堵塞濾紙孔，導致過濾較慢且濾液渾濁[21-25]。因此，通過向試樣中加入淀粉酶以消除麥芽糊精的影響，本研究通過優(yōu)化確定淀粉酶最優(yōu)添加量及其最佳水解溫度和水解時間。

2.3.1 淀粉酶添加量

5 g（精確至0.000 1 g）混合均勻的乳粉，測定淀粉酶添加量分別為0、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40 g時濾液的透光率。由圖2可知，隨著淀粉酶添加量的增加，樣液透光率顯著增大，并于淀粉酶添加量0.20 g之后趨于穩(wěn)定，因此確定0.25 g為最佳淀粉酶添加量。

圖2 樣液透光率隨淀粉酶添加量的變化Fig. 2 Change in light transmittance of sample solution with the amount of enzyme added

2.3.2 水解溫度

測定水解溫度分別為30、35、40、45、50、60、70、80 ℃時濾液的透光率。由圖3可知，樣液的透光率隨著水解溫度的增加不斷增大，并且在45 ℃時基本趨于穩(wěn)定，考慮到特殊醫(yī)學用途嬰兒配方乳粉復雜基質(zhì)的影響，確定最佳水解溫度為50 ℃。

圖3 樣液透光率隨水解溫度的變化Fig. 3 Change in light transmittance of sample solution with hydrolysis temperature

2.3.3 水解時間

測定水解時間分別為10、15、20、25、30、40、50、60 min時樣液的透光率。由圖4可知，隨水解時間的延長，樣液透光率逐漸增大，并在20 min后逐漸趨于穩(wěn)定?？紤]到特殊醫(yī)學用途嬰兒配方乳粉復雜基質(zhì)的影響，確定最佳水解時間為30 min。

圖4 樣液透光率隨水解時間的變化Fig. 4 Change in light transmittance of sample solution with hydrolysis time

因此，特殊醫(yī)學用途嬰兒配方乳粉最佳實驗條件為：標準曲線以0.25 mL為最低點，乙酰肉堿轉(zhuǎn)移酶懸浮液離心轉(zhuǎn)速為6 000 r/min，添加α-淀粉酶0.25 g，在50 ℃時水解30 min。

2.4 實際樣品測定

選取普通嬰幼兒配方乳粉、氨基酸配方、乳蛋白深度水解配方和部分水解配方特殊醫(yī)學用途嬰兒配方乳粉，采用GB 29989—2013方法和本研究優(yōu)化后方法測定左旋肉堿含量，并計算RSD。

由表1可知，對于普通嬰兒配方乳粉，國標法測得左旋肉堿平均值為18.925 mg/100 g，RSD為2.36%，優(yōu)化法測得平均值為19.063 mg/100 g，RSD為2.29%。2 種方法測得數(shù)值基本一致，且滿足GB 29989—2013規(guī)定要求。對于氨基酸配方乳粉，國標法測得左旋肉堿平均值為7.875 mg/100 g，RSD為14.3%；優(yōu)化法測得平均值為9.213 mg/100 g，RSD為3.71%。對于乳蛋白深度水解配方乳粉，國標法測得左旋肉堿平均值為6.275 mg/100 g，RSD為8.57%；優(yōu)化法測得平均值為7.125 mg/100 g，RSD為2.57%。對于乳蛋白部分水解配方乳粉，國標法測得左旋肉堿平均值為9.938 mg/100 g，RSD為14.0%；優(yōu)化法測得平均值為11.825 mg/100 g，RSD為3.93%。說明對于此3 種類型特殊醫(yī)學用途嬰兒配方乳粉，采用優(yōu)化后的方法，樣品測定精密度才符合實驗室質(zhì)量控制的要求[26]。

表1 2 種前處理方法測得的左旋肉堿含量（n=8）Table 1 Contents of L-carnitine in infant formula samples determined by traditional and optimized methods (n = 8)

2.5 加標回收率實驗

選取普通嬰兒配方乳粉、氨基酸配方、乳蛋白深度水解配方、乳蛋白部分水解配方特殊醫(yī)學用途嬰兒配方乳粉進行加標回收率測定。

由表2可知，在3 個不同的加標水平下，對于普通嬰兒配方乳粉，國標法平均加標回收率為92.475%～99.800%，RSD為1.11%～3.43%，優(yōu)化法平均加標回收率為93.813%～99.900%，RSD為1.36%～2.78%。說明對于普通嬰兒配方乳粉，國標法樣品加標回收率和RSD符合實驗質(zhì)量控制要求[26]。對于氨基酸配方乳粉，國標法平均加標回收率為81.138%～84.175%，RSD為7.78%～8.69%；優(yōu)化法平均加標回收率為94.138%～100.100%，RSD為3.27%～4.12%。對于乳蛋白深度水解配方乳粉，國標法平均加標回收率為83.850%～86.975%，RSD為6.68%～7.97%；優(yōu)化法平均加標回收率為100.288%～102.263%，RSD為2.68%～3.07%。對于乳蛋白部分水解配方乳粉，國標法平均加標回收率為73.950%～79.775%，RSD為4.06%～6.55%；優(yōu)化法平均加標回收率為89.412%～92.088%，RSD為1.71%～3.50%。說明對于特殊醫(yī)學用途嬰兒配方乳粉，經(jīng)優(yōu)化法處理樣品的加標回收率和RSD符合實驗室質(zhì)量控制要求[26]。

表2 2 種前處理方法測得的加標回收率（n=8）Table 2 Spiked recoveries of traditional and optimized methods (n = 8)

3 結(jié) 論

優(yōu)化一種特殊醫(yī)學用途嬰兒配方乳粉中左旋肉堿含量的測定方法。通過增加標準曲線最低點、增大酶提取離心轉(zhuǎn)速、優(yōu)化前處理過程等手段，解決了氨基酸配方、乳蛋白深度水解配方和部分水解配方特殊醫(yī)學用途嬰兒配方乳粉試樣溶液過濾困難、測定液顏色較深影響吸光度測定和加標回收率較低的問題。該方法可以縮短前處理時間，提高檢測效率，滿足實驗室質(zhì)量控制的要求。對于其他基質(zhì)配方的特殊醫(yī)學用途嬰兒配方乳粉，該方法的適用性還需要進一步驗證。