陳 春

(福建省林業(yè)科技試驗(yàn)中心，福建 南靖 363600)

蝴蝶蘭(Phalaenopsisspp.)屬于蘭科蝴蝶蘭屬，因其具有很高的觀賞價(jià)值與經(jīng)濟(jì)價(jià)值，被稱為“蘭中皇后”，可作為盆栽和鮮切花銷售，深受消費(fèi)者青睞[1-3]。蝴蝶蘭‘紅箭’是以‘瑞麗美人’為母本、‘臺(tái)林紅天使’為父本，通過人工雜交的方法選育出的新品系(良種編號(hào)：閩R-SC-DR-026-2015)。該品種是蝴蝶蘭大紅花系列，株型整齊，葉片挺立勻稱，花序排列對(duì)稱整齊，花型豐滿圓潤，花色鮮紅，色澤艷麗、均衡，花瓣邊緣略帶白邊，唇瓣深紅無雜色，柱頭花粉苞片雪白，平均花梗長達(dá)100 cm以上，最長可達(dá)110 cm，花梗粗壯，尤其適合作為鮮切花品種；具有花期長、耐低溫等優(yōu)點(diǎn)，適合作為國內(nèi)市場的年銷花，市場應(yīng)用前景廣闊。

蝴蝶蘭組織培養(yǎng)已有較多的報(bào)道[4-15]，但不同的蝴蝶蘭品種，其培養(yǎng)條件差別也較大[4，15]，研究結(jié)果有較大的不同。而‘紅箭’組織培養(yǎng)技術(shù)未見報(bào)道。為此，本研究對(duì)蝴蝶蘭新品種‘紅箭’的誘導(dǎo)、增殖、生根培養(yǎng)及組培苗移栽等關(guān)鍵環(huán)節(jié)開展系統(tǒng)研究，以期建立其組織培養(yǎng)快繁技術(shù)體系，為蝴蝶蘭新品種‘紅箭’種苗規(guī)?；a(chǎn)及推廣應(yīng)用提供有力的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

‘紅箭’是漳州森暉蘭花產(chǎn)業(yè)有限公司和福建省林業(yè)科技試驗(yàn)中心共同培育的蝴蝶蘭新品種。2019年3月從溫室大棚中選取花朵無畸形、無病蟲害的花梗作為外植體。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 外植體的消毒 用剪刀將花梗上的花朵剪掉，將外植體用稀釋過的洗衣粉溶液浸泡10 min，再用自來水沖洗30 min，放置于超凈工作臺(tái)上備用。具體消毒方法(表1)：將75 %酒精倒入外植體的燒杯中輕輕震蕩消毒30、45、60 s，之后用無菌水清洗外植體3～5遍；然后用0.1 % 升汞消毒，消毒時(shí)間設(shè)置為15、20、25、30 min，最后以無菌水震蕩沖洗5～6遍。將消毒后的外植體切成2 cm左右且?guī)а奎c(diǎn)的小段，接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，每個(gè)消毒處理接30個(gè)外植體，3次重復(fù)。培養(yǎng)20 d后觀察、統(tǒng)計(jì)并計(jì)算污染率、死亡率、存活率。污染率/% = 污染外植體數(shù)/接種總外植體數(shù)×100；死亡率/%=死亡的外植體數(shù)/接種總外植體數(shù)×100；存活率/%=100-污染率-死亡率。

1.2.2 不定芽的誘導(dǎo)培養(yǎng) 不定芽誘導(dǎo)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為MS+蔗糖30 g·L-1，應(yīng)用L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，6-BA質(zhì)量濃度為：3.0、5.0、7.0 mg·L-1；Ad(腺嘌呤)質(zhì)量濃度為：0、5.0、10.0 mg·L-1，NAA質(zhì)量濃度為：0、0.3、0.6 mg·L-1，各處理因子水平見表2。每個(gè)處理接種30瓶，每瓶接種1個(gè)外植體，3次重復(fù)。30 d后，觀察并分析不定芽的萌發(fā)及生長狀況，進(jìn)行正交試驗(yàn)方差分析，篩選‘紅箭’的最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基。誘導(dǎo)率=萌發(fā)的外植體數(shù)/接入的總外植體數(shù)。

1.2.3 不定芽的增殖培養(yǎng) 增殖培養(yǎng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基為MS+香蕉80 g·L-1+土豆80 g·L-1+蔗糖30 g·L-1，附加不同質(zhì)量濃度的6-BA(分別為4.0、5.0、6.0、7.0 mg·L-1)和NAA(分別為0.2、0.4、0.6 mg·L-1)(表4)。每個(gè)處理接30個(gè)不定芽，3次重復(fù)。培養(yǎng)50 d后，分析不定芽的增殖系數(shù)并觀察其生長情況。增殖系數(shù)=總不定芽數(shù)/接種的不定芽數(shù)。

1.2.4 生根誘導(dǎo)培養(yǎng) 不定芽生長至2～3 cm且有3個(gè)葉片以上時(shí)，接種到生根壯苗培養(yǎng)基中。生根基礎(chǔ)培養(yǎng)基為1/2 MS+香蕉80 g·L-1+土豆80 g·L-1+活性炭1.5 g·L-1+蔗糖20 g·L-1，附加不同質(zhì)量濃度NAA(0.2、0.4、0.6 mg·L-1)和IBA(0.2、0.4、0.6 mg·L-1)，具體組合見表5。每種培養(yǎng)基接種30瓶，每瓶接種10個(gè)不定芽，3次重復(fù)。45 d時(shí)，統(tǒng)計(jì)平均根數(shù)、平均根長、平均生根率。平均生根率/%=培養(yǎng)45 d時(shí)的生根苗數(shù)/接種的芽數(shù)×100。

1.2.5 煉苗及移栽 ‘紅箭’的組培苗根長至3 cm以上且長出3片葉子時(shí)即可煉苗及出瓶移栽[7-8]。煉苗7 d后，可將組培苗移栽到不同的基質(zhì)中進(jìn)行栽培，基質(zhì)分別為水苔、樹皮、水苔∶樹皮=2∶1、水苔∶樹皮=1∶1，共4個(gè)處理(表6)，每個(gè)處理移栽30株組培生根苗，3次重復(fù)。組培苗移栽后應(yīng)澆透水，并注意保持一定濕度，放置在溫室大棚中栽培40 d時(shí)，統(tǒng)計(jì)成活率，并觀察植株的生長情況。

1.3 培養(yǎng)及栽培條件

組織培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)基均添加瓊脂7.0 g·L-1，pH值均調(diào)至5.60～5.80，培養(yǎng)室溫度控制在22～25 ℃，光照強(qiáng)度為2500～3000 lx，光照的周期控制在10～12 h·d-1。煉苗及移栽時(shí)，白天溫度為25～28 ℃，夜間溫度為20～22 ℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 消毒時(shí)間對(duì)‘紅箭’外植體無菌體系建立的影響

由表1可知，不同酒精和升汞的消毒時(shí)間對(duì)花梗污染率和死亡率的影響顯著。當(dāng)酒精消毒時(shí)間少于60 s時(shí)，隨著酒精和升汞消毒時(shí)間的延長，污染率均呈下降趨勢；升汞消毒時(shí)間達(dá)30 min時(shí)，外植體開始出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。處理12(酒精消毒時(shí)間為60 s和升汞消毒時(shí)間為30 min)的死亡率最高，達(dá)44.9%；處理11(酒精消毒60 s，升汞消毒25 min)的污染率最低，但有一部分外植體死亡，死亡率為28.0%，存活率50.4%；而處理7(酒精消毒45 s、升汞消毒25 min)的外植體污染率為23.5%，死亡率為0，存活率高達(dá)76.5%。因此本試驗(yàn)篩選出‘紅箭’的最適消毒方法為處理7。

表1 消毒時(shí)間對(duì)花梗誘導(dǎo)的影響

2.2 植物生長調(diào)節(jié)劑對(duì)花梗誘導(dǎo)的影響

將消毒后的‘紅箭’花梗接種到不定芽萌發(fā)誘導(dǎo)的培養(yǎng)基上，15 d左右不定芽開始萌發(fā)。正交試驗(yàn)結(jié)果(表2)表明，不同的植物生長調(diào)節(jié)劑組合，‘紅箭’梗誘導(dǎo)率不同，添加一定濃度的6-BA、Ad、NAA有利于‘紅箭’不定芽的誘導(dǎo)。9組處理中，處理5的平均誘導(dǎo)率最高，為84.6%?！t箭’梗誘導(dǎo)培養(yǎng)基的最佳組合為A2B2C3，也就是MS+6-BA 5.0 mg·L-1+Ad 5.0 mg·L-1+NAA 0.6 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1。3個(gè)因子A(6-BA)、B(Ad)、C(NAA)對(duì)‘紅箭’的花梗誘導(dǎo)率的影響不同，其影響力為A>B>C，6-BA對(duì)‘紅箭’花梗不定芽的誘導(dǎo)影響最大，其次為Ad，最后是NAA。方差分析結(jié)果(表3)顯示，6-BA、Ad、NAA 3個(gè)因子對(duì)‘紅箭’的誘導(dǎo)率的影響均極顯著(P<0.01)。

2.3 不同濃度的6-BA與NAA組合對(duì)不定芽增殖的影響

從表4可以看出，當(dāng)NAA質(zhì)量濃度相同時(shí)，不同質(zhì)量濃度6-BA的增殖系數(shù)差異顯著，隨6-BA質(zhì)量濃度增加，增殖系數(shù)也隨著增大，6-BA質(zhì)量濃度7.0 mg·L-1時(shí)，增殖系數(shù)達(dá)4.36，然而此時(shí)的不定芽葉色轉(zhuǎn)淺，葉片未展開，芽弱而小。綜合增殖系數(shù)及苗木的生長狀態(tài)，6-BA的質(zhì)量濃度為6.0 mg·L-1較為適宜。當(dāng)6-BA質(zhì)量濃度為6.0 mg·L-1時(shí)，NAA質(zhì)量濃度在0.2、0.4 mg·L-1時(shí)的增殖系數(shù)最高，且顯著優(yōu)于其它處理；NAA 0.2 mg·L-1時(shí)不定芽增殖系數(shù)為3.51，葉色深綠，葉片適中，芽粗壯。

表2 花梗不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 誘導(dǎo)培養(yǎng)正交試驗(yàn)方差分析

表4 不同濃度的6-BA與NAA組合對(duì)不定芽增殖的影響

2.4 不同濃度的NAA、IBA對(duì)紅箭生根的影響

不定芽生根培養(yǎng)約25 d時(shí)，可看到綠色根點(diǎn)長出，50 d時(shí)統(tǒng)計(jì)平均根數(shù)、平均根長、平均生根率以及觀察生根苗的生長情況。從表5可以看出，NAA和IBA均可以促進(jìn)根的生成，雖然生根率均達(dá)100%，但附加IBA時(shí)，平均根數(shù)和根長均顯著高于附加NAA的處理。IBA質(zhì)量濃度為0.4 mg·L-1時(shí)，平均根數(shù)最多，達(dá)4.20條；平均根長最長，達(dá)3.88 cm。綜上，‘紅箭’生根培養(yǎng)基為1/2 MS+IBA 0.4 mg·L-1+香蕉80 g·L-1+土豆80 g·L-1+活性炭1.5 g·L-1+蔗糖20 g·L-1。

表5 不同濃度的NAA、IBA對(duì)生根的影響

2.5 不同基質(zhì)對(duì)組培苗移栽成活率的影響

移栽40 d后觀察并分析移栽成活率。由表6可知，基質(zhì)對(duì)移栽成活率的影響呈顯著差異。以水苔為基質(zhì)時(shí)，‘紅箭’組培苗移栽成活率最高，達(dá)95.2%；在水苔中添加一定比例的樹皮，組培苗移栽的成活率降低；隨著水苔比例降低，成活率呈下降趨勢。這可能是因?yàn)楹m的根是氣生根，疏松、透氣、保肥保水性好的基質(zhì)適合其生長，而水苔基質(zhì)柔軟性好，且保水性和肥力強(qiáng)，因此本試驗(yàn)選擇水苔作為組培苗移栽的基質(zhì)。

表6 不同基質(zhì)對(duì)組培苗移栽成活率的影響

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)確定了蝴蝶蘭‘紅箭’花梗的最佳消毒處理為75%酒精消毒45 s后，0.1%升汞消毒25 min；最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6-BA 5.0 mg·L-1+Ad 5.0 mg·L-1+NAA 0.6 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1，誘導(dǎo)率達(dá)83.5%；最佳增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA 7.0 mg·L-1+Ad 5.0 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1+香蕉80 g·L-1+土豆80 g·L-1+蔗糖30 g·L-1，增殖系數(shù)達(dá)3.36；最佳生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基為1/2 MS+NAA 0.5 mg·L-1+香蕉80 g·L-1+土豆80 g·L-1+活性炭 1.0 g·L-1+蔗糖15 g·L-1，生根率達(dá)100%；蝴蝶蘭組培苗在以水苔為基質(zhì)中，移栽成活率可達(dá)95.2%。

蝴蝶蘭植物組織培養(yǎng)無菌體系建立的成功與否主要取決于污染率的控制[4]。本試驗(yàn)通過選擇合適的外植體，采用優(yōu)化酒精與升汞消毒的時(shí)間，降低外植體的污染率和死亡率，這與宋火元[16]的研究相一致。

本試驗(yàn)應(yīng)用正交試驗(yàn)，對(duì)花梗不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行較全面的優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)‘紅箭’梗誘導(dǎo)培養(yǎng)基的最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA 5.0 mg·L-1+Ad 5.0 mg﹒L-1+NAA 0.6 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1，這個(gè)結(jié)果與已建立的組培體系的其它蝴蝶蘭品種的的培養(yǎng)基不一致[8-12]，這也進(jìn)一步說明了蝴蝶蘭不同品種的組織培養(yǎng)條件差別較大。