方 彥，曾秀存，馬 驪，孫柏林，武軍艷，董 云,3，劉麗君，金姣姣，孫萬(wàn)倉(cāng)，李學(xué)才

(1. 甘肅省干旱生境作物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 甘肅 蘭州 730070; 2. 甘肅省油菜工程技術(shù)研究中心, 甘肅 蘭州 730070;3. 甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所, 甘肅 蘭州 730070 4. 河西學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院, 甘肅 張掖734000)

低溫逆境嚴(yán)重影響植物的生長(zhǎng)和生產(chǎn)力。植物在一段時(shí)間的低溫鍛煉下可以獲得更高的抗凍能力[1]，在這一高度復(fù)雜的過(guò)程中，植物形態(tài)、分子、生化和生理均發(fā)生變化[2], 最終表現(xiàn)為與低溫脅迫相關(guān)的基因表達(dá)水平發(fā)生顯著變化，并重新調(diào)整代謝水平[3-4]。寒冷對(duì)植物的初生和次生代謝具有重要的調(diào)節(jié)作用[5]。植物在受到低溫等非生物脅迫之后，體內(nèi)的代謝平衡被打破，為了抵御脅迫產(chǎn)生的傷害，植物通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)誘導(dǎo)合成抗逆相關(guān)的代謝產(chǎn)物，以修復(fù)損傷或達(dá)到新的代謝平衡[6]。在外界環(huán)境發(fā)生變化時(shí)，不同植物的代謝產(chǎn)物不同，同一植物不同器官或不同的發(fā)育時(shí)期代謝產(chǎn)物也有一定的差異。代謝物是基因型與表型之間的橋梁，代謝物的變化更能直接揭示基因的功能，因此能夠更有效地揭示生物學(xué)及其生化和分子機(jī)制。代謝組學(xué)已經(jīng)被廣泛運(yùn)用于逆境脅迫研究中[7-8]。擬南芥在冷脅迫應(yīng)答過(guò)程中代謝組會(huì)發(fā)生明顯的變化[9]。低溫環(huán)境下的鼠耳芥屬植物的代謝指紋分析鑒定出了一系列已知和未知的與低溫相關(guān)的小分子代謝產(chǎn)物[10]。 Maruyama等[11]對(duì)擬南芥的冷處理材料利用液相色譜-離子阱質(zhì)譜分析法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，次級(jí)代謝產(chǎn)物數(shù)量明顯下降，許多種單糖、二糖、三糖和糖醇會(huì)大量積累。Kaplan等[10]利用代謝組對(duì)擬南芥在低溫馴化下代謝變化進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)低溫脅迫誘發(fā)廣泛的代謝響應(yīng)。 此外，研究還發(fā)現(xiàn)抗寒能力不同的兩種基因型水稻在冷脅迫下可溶性糖類(lèi)的積累是不同的[12]。

北方旱寒區(qū)冬油菜秋季播種，次年春季返青，冬季極端低溫限制了不同抗寒性冬油菜能否安全越冬。因此，強(qiáng)抗寒性是其適應(yīng)北方寒冷環(huán)境而生存的前提。本課題組對(duì)低溫脅迫下隴油7號(hào)的形態(tài)特征[13]、生理生化[14]、抗寒響應(yīng)的相關(guān)基因[15]和蛋白質(zhì)組學(xué)[16]等進(jìn)行了研究，但對(duì)冬油菜通過(guò)自身代謝調(diào)控來(lái)緩解傷害適應(yīng)脅迫的系統(tǒng)研究還少見(jiàn)報(bào)道。在植物細(xì)胞中，許多代謝中間產(chǎn)物是調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透勢(shì)的重要組分，而這些代謝物質(zhì)含量的變化可能在植物代謝與生理反應(yīng)中起十分重要的作用。通過(guò)廣泛靶向代謝組分析可以對(duì)特定的生理、生長(zhǎng)發(fā)育等表型中時(shí)序表達(dá)差異積累的代謝物信息進(jìn)行分析。根是北方旱寒區(qū)冬油菜越冬期唯一存活的器官，根部抵御低溫能力的強(qiáng)弱是決定冬油菜能否安全越冬的關(guān)鍵。因此，本試驗(yàn)選擇超強(qiáng)抗寒白菜型冬油菜品種隴油7號(hào)為材料，對(duì)低溫脅迫下根部進(jìn)行非靶向代謝組分析，為深入探討其越冬期的代謝變化提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

超強(qiáng)抗寒性白菜型冬油菜品種隴油7號(hào)種子由甘肅省油菜工程技術(shù)研究中心提供。將種子播于營(yíng)養(yǎng)缽培養(yǎng)，每缽留苗4株，待幼苗長(zhǎng)至 5～6片真葉進(jìn)行處理。一組放入22℃培養(yǎng)箱(12 h光照/12 h 黑暗)平衡48 h后取根(CK)；為適應(yīng)零度以下低溫處理，另一組降溫至4℃和0℃分別保持48 h(降溫速率2℃·h-1)，最后，以同樣的降溫速率降溫至-4℃保持 6 h(CT)，取根，液氮速凍后置于-80℃冰箱備用。每份樣品由在相同生長(zhǎng)條件下的6株油菜組成，代謝組分析6個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

1290超高壓液相色譜儀(Agilent，美國(guó))、 Triple TOF 5600高分辨質(zhì)譜儀(AB Sciex，美國(guó))；ACQUITY UPLC BEH Amide色譜柱 (美國(guó)，Waters，1.7 μm × 2.1 mm×100 mm)；PS-60AL型超聲儀(深圳市雷德邦電子有限公司)，甲醇、乙腈、醋酸銨和氨水均為德國(guó)CNW公司LC-MS級(jí)。

1.3 代謝物提取

樣品放入預(yù)冷的研缽中，加液氮研磨至粉末狀。稱(chēng)取50 mg粉末樣品置于2 mL EP管中，加入1 000 μL提取液(甲醇∶乙腈∶水=2∶2∶1)，再加入20 μL 內(nèi)標(biāo)L-2-氯苯丙氨酸，渦旋混勻30 s；放入鋼珠，45 Hz研磨儀處理4 min，冰水浴超聲5 min(重復(fù)3遍)；-20℃靜置1 h；4℃，12 000 r·min-1離心15 min；移取600 μL上清液于EP管中，真空濃縮后加入200 μL 提取液(乙腈∶水=1∶1)復(fù)溶；渦旋30 s，冰水浴超聲10 min后將樣品4℃、12 000 r·min-1離心15 min；取60 μL上清液于2 mL進(jìn)樣瓶。每個(gè)樣本各取10 μL混合成質(zhì)控樣本。

1.4 代謝物檢測(cè)

參考文獻(xiàn)[17]、[18]方法檢測(cè)代謝物。流動(dòng)相A為水(25 mM醋酸銨及25 mM氨水)，B為100%乙腈，洗脫梯度：0～0.5 min,95%B；0.5～7 min,95%B～65%B；7～8 min,65%B～40%B；8～9 min,40%B；9～9.1 min,40%B～95%B；9.1～12 min,95%B。進(jìn)樣體積為1 μL。

1.5 質(zhì)譜條件

AB 5600 Triple TOF質(zhì)譜儀在控制軟件(Analyst TF 1.7, AB Sciex)控制下基于IDA功能進(jìn)行一級(jí)、二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集。分別采用正、負(fù)離子模式采集。在每個(gè)數(shù)據(jù)采集循環(huán)中，篩選出強(qiáng)度最強(qiáng)且大于100的分子離子進(jìn)行采集對(duì)應(yīng)的二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)。轟擊能量：30 eV，15張二級(jí)譜圖每50 ms。ESI離子源參數(shù)設(shè)置：霧化氣壓(GS1)，60 Psi；輔助氣壓，60 Psi；氣簾氣壓，35 Psi；溫度，650℃；噴霧電壓，5 000 V(正離子模式)或-4 000 V(負(fù)離子模式)。

1.6 數(shù)據(jù)處理

參照文獻(xiàn)[19]方法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。使用ProteoWizard軟件將質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)成mzXML格式，再使用XCMS(version 3.2)進(jìn)行保留時(shí)間矯正、峰識(shí)別、峰提取、峰積分、峰對(duì)齊等處理。物質(zhì)鑒定的數(shù)據(jù)處理及匹配：使用百邁客生物有限公司基于XCMS開(kāi)發(fā)的程序及自建庫(kù)進(jìn)行處理，minfrac設(shè)為0.5，cutoff設(shè)為0.8。采取t檢驗(yàn)(Student’st-test)的P值與正交偏最小二乘法-判別分析(Orthogonal projections to latent structures- discriminant analysis, OPLS-DA)模型的VIP(Variable importance in the projection)值相結(jié)合的方法來(lái)篩選差異代謝物，篩選的標(biāo)準(zhǔn)為VIP>1，且顯著性達(dá)到P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫脅迫下隴油7號(hào)OPLS-DA分析

利用OPLS-DA方法，將低溫處理后的處理組和常溫對(duì)照組隴油7號(hào)根部共12個(gè)樣品的標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析(圖1)。從圖1可以看出，樣品處理組和對(duì)照組6個(gè)生物學(xué)重復(fù)的數(shù)據(jù)點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果均很好地分成兩組，并分別集中在一起。OPLS-DA分析方法評(píng)價(jià)模型的預(yù)測(cè)參數(shù)有R2X，R2Y和Q2，其中R2X和R2Y分別表示所建模型對(duì)X和Y矩陣的解釋率，Q2表示模型的預(yù)測(cè)能力，這3個(gè)指標(biāo)越接近于1時(shí)表示模型越穩(wěn)定可靠，Q2> 0.5時(shí)可認(rèn)為是有效的模型[20]。本研究模型的評(píng)價(jià)參數(shù)R2X，R2Y和Q2分別為0.588、0.989和0.608，參數(shù)均超過(guò)0.5，說(shuō)明本試驗(yàn)建立的OPLS-DA模型可為后續(xù)的數(shù)據(jù)分析提供支持。

注：X1-4,X1-5,X1-6,X1-7,X1-8,X1-9為22℃ 處理6個(gè)生物學(xué)重復(fù)；X5-4,X5-5,X5-6,X5-7,X5-8,X5-9為-4℃處理下6個(gè)生物學(xué)重復(fù)。Note: X1-4,X1-5,X1-6,X1-7,X1-8,X1-9： 6 biological replicates at 22℃；X5-4,X5-5,X5-6,X5-7,X5-8,X5-9：6 biological replicates at -4℃.圖1 隴油7號(hào)低溫處理與常溫對(duì)照正交偏最小二乘法-判別分析得分Fig.1 OPLS-DA score plots of two groups of samples

2.2 低溫脅迫下冬油菜隴油7號(hào)根部差異代謝物的篩選及KEGG富集分析

通過(guò)火山圖可以快速地查看代謝物在兩個(gè)組中表達(dá)水平的差異，以及差異的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。圖2為隴油7號(hào)根部差異表達(dá)火山圖。

圖2 隴油7號(hào)低溫處理與常溫對(duì)照差異代謝物篩選火山圖Fig.2 The volcano plot for two groups of samples

低溫處理組較對(duì)照組在正離子模式下上調(diào)代謝物116個(gè)，下調(diào)代謝物96個(gè)。在標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)進(jìn)行對(duì)比分析后，確定了124個(gè)代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)；在負(fù)離子模式下上調(diào)代謝物122個(gè)，下調(diào)代謝物39個(gè)。在標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)鑒定到101個(gè)代謝物。

KEGG富集分析結(jié)果顯示(圖3)，在正離子模式下，代謝物主要富集到果糖和甘露糖代謝、醚脂類(lèi)代謝、花生四烯酸代謝、苯丙氨酸代謝、甘油磷脂代謝、半乳糖代謝、α-亞麻酸代謝、氨基酸生物合成和亞油酸代謝等20個(gè)通路中；在負(fù)離子模式下，代謝物主要富集到淀粉和蔗糖代謝、果糖和甘露糖代謝、半胱氨酸和蛋氨酸代謝、半乳糖代謝、精氨酸和脯氨酸代謝等10個(gè)通路。這些代謝通路可能與隴油7號(hào)抗寒代謝途徑有關(guān)。

注：A—正離子模式，B—負(fù)離子模式。Note: A — positive ion mode；B — negative ion mode.圖3 隴油7號(hào)低溫處理與常溫對(duì)照差異代謝物KEGG富集Fig.3 Enrichment plot for two groups of samples

2.3 低溫脅迫處理后冬油菜隴油7號(hào)根部差異代謝物的鑒定結(jié)果

根據(jù)VIP>1且P<0.05篩選條件下的OPLS-DA結(jié)果，隴油7號(hào)根部共有225個(gè)已知代謝產(chǎn)物在低溫和常溫條件下有較大差異。對(duì)鑒定到的8種糖代謝相關(guān)產(chǎn)物、4種氨基酸類(lèi)、甘油磷酰膽堿、黃酮、6種磷脂進(jìn)一步分析(表1)，各類(lèi)成分在低溫處理后上下調(diào)模式不同。低溫促進(jìn)糖(除鼠李糖外)、黃酮、賴(lài)氨酸-纈氨酸、脯氨酸-色氨酸的積累。磷脂的變化存在差異，與對(duì)照相比，低溫下磷脂酰膽堿(PC)類(lèi)(除o-16∶0/18∶0亞類(lèi)外)上調(diào)，脂酰乙醇胺(PE)類(lèi)和磷脂酰絲氨酸(PS)類(lèi)下調(diào)，而磷脂酰肌醇(PI)類(lèi)、磷脂酸(PA)類(lèi)及磷脂酰甘油(PG)類(lèi)的變化因亞類(lèi)而異。

表1 低溫脅迫條件下隴油7號(hào)根部差異代謝物比較

3 討 論

3.1 隴油7號(hào)在低溫條件下調(diào)節(jié)糖和氨基酸代謝水平適應(yīng)環(huán)境

植物在遭受非生物脅迫時(shí)可產(chǎn)生脯氨酸、甜菜堿和可溶性糖等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)抵御外界壓力損傷[21]。低溫嚴(yán)重影響植物的生長(zhǎng)和發(fā)育，在長(zhǎng)期的抗寒鍛煉中，植物獲取了不同適應(yīng)低溫脅迫的能力。有些植物在低溫逆境脅迫時(shí)通過(guò)改變蔗糖及其衍生物寡糖的含量適應(yīng)不利環(huán)境，蔗糖的積累能顯著降低植物的冰點(diǎn)，增強(qiáng)細(xì)胞的保水力[22]。低溫條件下，葡萄藤會(huì)積累更多的海藻糖[23]，葡萄藤花序在冷處理下蔗糖含量更豐富[24]。擬南芥植株響應(yīng)冷脅迫的代謝研究結(jié)果表明，葡萄糖、果糖和棉子糖等糖類(lèi)對(duì)溫度脅迫具有重要作用[25]。植物組織中的氨基酸能對(duì)冷脅迫做出響應(yīng)，特別是脯氨酸水平增加是抗冷機(jī)制之一[26]。隴油7號(hào)根系低溫處理后與對(duì)照相比，KEGG分析代謝物主要富集到果糖和甘露糖代謝、淀粉和蔗糖代謝途徑及氨基酸生物合成通路。甘露糖、塔羅糖、阿洛糖、蔗糖、海藻糖和棉子糖6種糖類(lèi)差異倍數(shù)均在1.2以上，賴(lài)氨酸-纈氨酸和脯氨酸-色氨酸含量提高。表明低溫脅迫下，含有氨基酸和糖類(lèi)物質(zhì)的代謝網(wǎng)絡(luò)對(duì)低溫脅迫具有重要作用，冬油菜可主動(dòng)積累體內(nèi)糖類(lèi)和氨基酸類(lèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，提高細(xì)胞液濃度，維持滲透壓，保護(hù)膜系統(tǒng)組分，提高抗寒性。

3.2 磷脂類(lèi)代謝物質(zhì)對(duì)隴油7號(hào)抗寒性具有重要作用

植物細(xì)胞膜是所有細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的組成部分，是細(xì)胞與外界環(huán)境聯(lián)系的直接界面，對(duì)環(huán)境變化非常敏感[27]。前人在細(xì)胞膜對(duì)溫度變化的響應(yīng)方面做了大量的研究，結(jié)果表明，低溫誘導(dǎo)首先引起植物膜損傷[28-30]。磷脂是生物膜的主要組成成分。磷脂酰膽堿(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰絲氨酸(PS)、磷脂酸(PA)及磷脂酰甘油(PG)是植物中主要的磷脂分子。Uemura等[31]研究發(fā)現(xiàn)擬南芥在低溫處理后，磷脂的比例有增加的趨勢(shì)。PC是可提高膜穩(wěn)定性的雙層脂質(zhì)，而PE更傾向于過(guò)渡到非雙層結(jié)構(gòu)[32],PG分子水平與植物的冷敏感性呈正相關(guān)[33],PI在應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[34]。PA是一類(lèi)最重要的磷脂信使物質(zhì)，參與多種逆境與激素的信息傳遞過(guò)程[35]。本研究在隴油7號(hào)根部檢測(cè)出6類(lèi)磷脂，在低溫處理后其中PC亞類(lèi)上調(diào)， PE和PS下調(diào)，PG、PI和PA亞類(lèi)部分上調(diào)，部分下調(diào)。研究表明，不同磷脂種類(lèi)之間的轉(zhuǎn)換對(duì)細(xì)胞膜穩(wěn)定性有一定影響[36]。冷凍脅迫誘導(dǎo)各種膜磷脂的降解和轉(zhuǎn)化以及?；湶伙柡投鹊淖兓萚37]，植物更偏好脂質(zhì)重組適應(yīng)溫度變化[38]。低溫脅迫下，隴油7號(hào)可調(diào)節(jié)根部磷脂代謝，維持細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，免受低溫脅迫的危害。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)基于非靶向代謝組技術(shù)的研究方法，對(duì)強(qiáng)抗寒性冬油菜品種隴油7號(hào)根系在低溫脅迫處理后的代謝產(chǎn)物進(jìn)行了分離與鑒定。糖類(lèi)、氨基酸、甘油磷酰膽堿、黃酮、6種磷脂(PG、PC、PE、PI、PS和 PA)等均得到鑒定。低溫脅迫下，糖、賴(lài)氨酸-纈氨酸、脯氨酸-色氨酸積累，磷脂中PC增加，PE和PS下降， PI、PA和PG類(lèi)的變化因亞類(lèi)而異。隴油7號(hào)在低溫條件下調(diào)節(jié)糖、氨基酸和磷脂類(lèi)代謝水平適應(yīng)環(huán)境。研究結(jié)果為冬油菜抗寒相關(guān)物質(zhì)代謝深入研究奠定基礎(chǔ)。