鞏曉宇，嚴(yán)俊珍，張麗，陸燕萍，陳黎

(深圳市龍崗區(qū)人民醫(yī)院 & 香港中文大學(xué)(深圳)附屬第三醫(yī)院(籌)，深圳 518172)

動物類中藥中除去蛋白類，主要的化學(xué)物質(zhì)是脂質(zhì)成分[1-3]，研究比較不同動物類中藥中脂質(zhì)成分的差異，可以鑒別和分類不同來源的動物類中藥，同時(shí)也可以指導(dǎo)藥物作用機(jī)制和臨床應(yīng)用研究.因脂類成分參與能量運(yùn)輸、細(xì)胞間的信息通訊等，故脂類代謝在動物類樣本的生理代謝中占主導(dǎo)地位，其化學(xué)成分也是探討動物類樣本化合物特征的重要參考[4-6].本文基于液相-質(zhì)譜/質(zhì)譜(LC-MS/MS)檢測平臺，利用自建數(shù)據(jù)庫，采用MRM(多反應(yīng)監(jiān)測)檢測模式，對動物類中藥中脂質(zhì)代謝物進(jìn)行檢測定性定量.利用自建多元統(tǒng)計(jì)分析流程，對定性定量脂質(zhì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異分析.

代謝組學(xué)分析的主要目的是從生物樣本中檢測出各種特征化合物，通過差異物分析和統(tǒng)計(jì)學(xué)建模，對樣品的特征進(jìn)行歸納，探索不同生物體樣品的特點(diǎn)并進(jìn)行歸類，同時(shí)闡明代謝過程的生物學(xué)機(jī)制.本文選取11個樣品，基于實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、樣本的采集及處理、代謝物提取及代謝物的檢測分析鑒定出1050個代謝物.通過獲取的代謝組數(shù)據(jù)，進(jìn)行代謝物的鑒定與樣本數(shù)據(jù)的質(zhì)控分析和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，篩選差異的代謝物，對不同類型的動物類中藥進(jìn)行分類識別、差異物鑒定等，從而對樣本的特征進(jìn)行相關(guān)的功能預(yù)測和判別.

1 儀器與試劑

LC30A超高相液相色譜儀(日本島津)；6500 QTRAP串聯(lián)質(zhì)譜(Applied Biosystems)；ACQUITY UPLC HSS T3 C18色譜柱(美國Waters)；5427R高速臺式離心機(jī)(德國艾本德).

甲醇、甲酸銨為分析純，購于上?；瘜W(xué)試劑廠；乙腈、異丙醇為色譜純，水為純化水.樣品信息詳見表1，所有樣品均按照國家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行鑒定.

表1 樣品信息表Tab.1 Sample information table

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液的制備

樣品進(jìn)行冷凍干燥，在液氮環(huán)境下研磨成細(xì)粉，稱量20 mg加入到對應(yīng)的已編號的2 mL離心管中，加入1 mL脂質(zhì)提取液[V(甲基叔丁基醚)∶V(甲醇)=3∶1]，并放入鋼珠，搖勻；用球磨機(jī)勻漿，取出鋼珠，渦旋15 min 加入200 μL水，渦旋1 min，置離心機(jī)中離心(轉(zhuǎn)速12000 r·min-1、4 ℃，10 min)；吸取上層清液300 μL，放置在離心管中，濃縮至干，然后加入用200 μL 流動相 B，充分溶解，得到供試品溶液[7-9].

2.2 色譜條件及質(zhì)譜條件的選擇

流動相：A相：乙腈/水(60/40，V/V)(含 0.1% 甲酸，10 mmol·L-1甲酸銨)；B相：乙腈/異丙醇(10/90，V/V，含 0.1% 甲酸，10 mmol·L-1甲酸銨)，進(jìn)行梯度洗脫(0～10 min：A相從95%～5%;10～15 min：A相保持在5%;15～18 min，A相從5%～95%).設(shè)定流速0.35 mL·min-1，柱溫40 ℃，進(jìn)樣量2 μL.

質(zhì)譜條件：同時(shí)采用正離子模式和負(fù)離子模式進(jìn)行檢測，離子源溫度500 ℃，正離子模式下質(zhì)譜電壓設(shè)置為5500 V，負(fù)離子模式下質(zhì)譜電壓設(shè)置為-4500 V，離子源gas1(GS1)45 psi, gas2(GS2)55 psi,簾氣(curtain gas, CUR)35 psi.

數(shù)據(jù)比對基于自建數(shù)據(jù)庫(武漢邁特維爾公司)，數(shù)據(jù)庫的建立基于數(shù)千種脂質(zhì)化合物通過對照品確定保留時(shí)間和離子對信息，本文中選擇三重四級桿質(zhì)譜的多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)，將所有離子對信息和保留時(shí)間信息輸入到方法學(xué)文件，得到不同樣本的質(zhì)譜分析數(shù)據(jù)后，對所有物質(zhì)的質(zhì)譜信號進(jìn)行峰面積積分.圖1顯示的是質(zhì)控混合樣品(將所有動物類中藥樣品提取液各取100 μL混合)的總離子流圖，圖2是 MRM代謝物檢測多峰圖.

圖1 11種動物類中藥混合樣品的總離子流圖Fig.1 Total ion current diagram of 11 kinds of animal traditionalChinese medicine mixed samples (a)負(fù)離子模式；(b) 正離子模式

圖2 MRM代謝物檢測多峰圖Fig.2 MRM metabolite detection multi peak map(a)負(fù)離子模式；(b) 正離子模式

對所有單一動物類中藥樣品的總離子流圖進(jìn)行分析，可以發(fā)現(xiàn)每類樣品中均檢測出較為豐富的脂質(zhì)類化合物成分，本文采用相對定量的方法，根據(jù)保留時(shí)間與離子對信息，對每個化合物成分在不同樣本中檢測到的質(zhì)譜峰進(jìn)行校正.圖3展示了隨機(jī)抽取的代謝物在不同樣本中的定量分析積分校正結(jié)果，橫坐標(biāo)為代謝物檢測的保留時(shí)間(min)，縱坐標(biāo)為某代謝物離子檢測的離子流強(qiáng)度(cps).結(jié)合分離度和信噪比，共鑒定出1050個化合物.

圖3 代謝物定量分析積分校正圖Fig.3 Integral correction chart of metabolite quantitative analysis圖中為隨機(jī)抽取的代謝物在不同樣本中的定量分析積分校正結(jié)果，橫坐標(biāo)為代謝物檢測的保留時(shí)間

2.3 代謝組學(xué)分析

單純從總離子流圖上看，不同動物類中藥較為相似，而且每種動物類中藥中有大量的共有成分，差異離子對信號也多被掩蓋，很難進(jìn)行鑒定和區(qū)分.代謝組學(xué)分析的目標(biāo)是通過統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，對樣品的整體成分及其分布進(jìn)行考察，確定樣品之間的相關(guān)性和差異性，從而達(dá)到鑒別區(qū)分不同動物類中藥、指導(dǎo)生物學(xué)分類的目的.以下結(jié)合統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，對所有樣品中檢測到的脂質(zhì)類化合物成分進(jìn)行多種代謝組學(xué)分析，以鑒別分析，文中相關(guān)性圖、聚類熱圖、PCA和OPLS-DA通過Simca-p統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件繪制.

2.3.1 相關(guān)性圖和聚類熱圖分析

為了考察樣品間的相關(guān)性，通過對各樣品進(jìn)行層次聚類，去除空值，對每個批次樣品的質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，然后對所有檢測出的成分進(jìn)行積分、匹配和峰強(qiáng)度校正等，得到它們的相關(guān)性熱圖.結(jié)果如圖4.

圖4 樣品相關(guān)性圖Fig.4 Sample correlation diagram(a)包含mix混合樣品；(b) 不包含mix混合樣品

圖4中橫縱坐標(biāo)為各個樣品信息，不同顏色代表樣品間相關(guān)性強(qiáng)弱，紅色表示相關(guān)性強(qiáng)，藍(lán)色表示相關(guān)性弱.圖4(a)中3個mix混合樣品緊密聚合一起，與預(yù)期相符合，表明數(shù)據(jù)質(zhì)控符合要求.此外，金錢白花蛇、烏梢蛇、地龍、燙水蛭和紫河車具有較多類似成分，聚為一類；炒九香蟲、全蝎和炒僵蠶聚為一類；海馬、土鱉蟲和壁虎聚為一類.在不同的類型中，也有更為相似的聚類關(guān)系，如土鱉蟲和壁虎、烏梢蛇和紫河車等，這種相似的成分，也提示在藥材療效和適用性上具有一定的相關(guān)性，為藥物成分的開發(fā)和利用提供有意義的參考.

除了對樣品和代謝物兩個維度對代謝數(shù)據(jù)進(jìn)行了層次聚類，本文還通過色階熱圖進(jìn)行展示，更直觀地看出不同類型動物中藥中脂質(zhì)成分的異同、數(shù)據(jù)分布情況及不同樣品的相關(guān)性，結(jié)果如圖5.

圖5 樣品代謝物的聚類熱圖Fig.5 Cluster thermogram of metabolites

圖5的層次聚類熱圖是以代謝物相表達(dá)量經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類，橫坐標(biāo)代表樣品信息，縱坐標(biāo)代表各樣品所含代謝物信息；顏色表示相對表達(dá)量的高低，紅色的為高表達(dá)，藍(lán)色的為低表達(dá)，可以直觀地觀察到不同樣品的異同.

2.3.2 代謝組數(shù)據(jù)的PCA分析

PCA分析是把復(fù)雜數(shù)據(jù)進(jìn)行簡化的一種統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，在中藥品種鑒定和分類研究上有廣泛的應(yīng)用[10-12].每種動物類中藥中檢測到化合物數(shù)量極大，很難直觀地比較，通過PCA方法處理，可以初步了解樣品間的分組情形，可進(jìn)一步考察不同動物類中藥中脂質(zhì)成分整體代謝數(shù)據(jù)的相關(guān)性和差異情況，本文中將鑒定出的化合物作為多元數(shù)據(jù)集合，得到的PCA分析結(jié)果見圖6.

圖6 PCA分析散點(diǎn)圖Fig.6 Scatter plot of PCA analysis

圖6中橫縱坐標(biāo)軸分別代表PCA分析結(jié)果的前兩個主成分.圖中每個圓點(diǎn)代表1個樣品，圓點(diǎn)距離大小表示樣品相似度的遠(yuǎn)近.從圖6中可見：3個混合樣品mix01、mix02、mix03很好地聚類到一起，說明樣品的質(zhì)控效果符合預(yù)期，由于不同類型的動物類中藥樣品在平面空間上有不同的分布空間，單純的PCA分析可以在平面空間上很好地表達(dá)物種之間的差異，但同時(shí)也存在不同樣品較為接近的情況，差異信息不能得到完整表達(dá)，例如樣品5(烏梢蛇)和樣品8(紫河車)顯示空間分布較為接近，提示在藥物的成分上差異性不明顯，藥理作用上的相關(guān)性也具有探討價(jià)值.

2.3.3 代謝數(shù)據(jù)的PLS-DA分析及其置換檢驗(yàn)結(jié)果

為了更準(zhǔn)確地判別分析11個樣品中具有差異標(biāo)志物性質(zhì)的代謝物，對不同的樣品進(jìn)行鑒定，結(jié)合前面的樣品聚類熱圖及PCA分析結(jié)果，對該代謝數(shù)據(jù)做PLS-DA分析.PLS-DA是多變量數(shù)據(jù)分析技術(shù)中的判別分析法，用來處理分類和判別問題.通過對主成分適當(dāng)?shù)男D(zhuǎn)，PLS-DA可以有效地對組間觀察值進(jìn)行區(qū)分，并找到導(dǎo)致組間區(qū)別的影響變量.分組情況如下：組別1：QX-2、CJC-9、CJXC-10、TBC-4；組別2：JQBHS-3、WSS-5、ZHC-8；組別3：DL-1、TSZ-7；組別4：BH-6、HM-11.結(jié)果見圖7.

圖7 PLS-DA分析散點(diǎn)圖Fig.7 Scatter plot of PLS-DA analysis

圖7中橫縱坐標(biāo)軸分別代表PLS-DA分析結(jié)果的前兩個主成分.圖中每個圓點(diǎn)代表1個樣品，圓點(diǎn)距離大小表示樣品相似度的遠(yuǎn)近.不同顏色表示不同分組信息.由圖7可見：采用上述分組處理，可以較好地把11個樣品聚合成4類.

為了驗(yàn)證該P(yáng)LS-DA模型分類效果是否理想，采用置換檢驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果見圖8.置換檢驗(yàn)可以有效地避免過擬合現(xiàn)象，更準(zhǔn)確的評估分類模型是否與實(shí)際相符，R2 接近1，模型與樣品數(shù)據(jù)匹配性更好，Q2 接近1，說明如果有建立的模型具有擴(kuò)展性，新的樣品也可以按照類型匹配歸類，該方法對樣品之間的差異進(jìn)行了很好地詮釋.隨著置換保留度逐漸降低，R2和Q2均逐漸下降，說明原模型不存在過擬合現(xiàn)象，表明模型的耐受性與穩(wěn)健性良好.

圖8 置換檢驗(yàn)分析Fig.8 Permutation test analysis

以上結(jié)果表明：11種動物類中藥按照化學(xué)成分的異同，通過PLS-DA方法分為4類，其驗(yàn)證結(jié)果具有合理性，全蝎、炒僵蠶、炒九香蟲、土鱉蟲為一類；金錢白花蛇、烏梢蛇、紫河車為一類；地龍與燙水蛭為一類；壁虎與海馬為一類.這和普通的動物學(xué)分類不完全相同，成分上的相似性，對應(yīng)藥理活性和作用機(jī)制上，也必然存在一定的關(guān)聯(lián)，在藥物分析研究中，可以從同類型的動物中藥樣品中研究探討共同的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)，例如烏梢蛇和紫河車在物質(zhì)組成和分類上極為相似，提示在挖掘?qū)τ趧游镱愔兴幍幕钚猿煞盅芯可?，可以關(guān)聯(lián)分析分析；全蝎、炒僵蠶、炒九香蟲、土鱉蟲具有同類型的化合物較多，提示藥理活性上具有一定的相似性；壁虎與海馬，雖然來源不同，但化合物類型相似，可以作為替代品種進(jìn)行對比研究.

3 討論

本文通過液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對比分析了11種動物類中藥中化合物成分，按照代謝組學(xué)的方法，共鑒定出樣品中上千種化學(xué)成分，同時(shí)基于統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法，對不同動物類中藥之間的親緣關(guān)系進(jìn)行了分析和驗(yàn)證.代謝組學(xué)的分析方法，基于樣品中大量物質(zhì)(離子對)信息進(jìn)行綜合判斷，由于動物類中藥的藥理作用和脂質(zhì)類化學(xué)成分具有相關(guān)性，代謝組學(xué)的分析和傳統(tǒng)的生物學(xué)分類不完全相同，這對于闡明藥物的生物學(xué)藥理機(jī)制、發(fā)現(xiàn)藥物活性成分及合理用藥上提供了新的思路[13-15].

通過代謝物分析，也可以闡明不同的炮制工藝對化學(xué)成分的分布和差異的影響[16-17]，炒制后的動物類中藥化學(xué)成分上具有較強(qiáng)的關(guān)聯(lián)，如炒僵蠶和炒九香蟲等，這表明脂質(zhì)代謝分析，對于動物類中藥的炮制工藝研究也具有很好的參考價(jià)值.炒制后的動物類中藥和一些凈制加工的動物類中藥也具有關(guān)聯(lián)性，這對于動物類中藥的合理炮制也提供了參考依據(jù).

動物藥材一般是整體入藥，脂質(zhì)成分和蛋白類成分是主要的物質(zhì)基礎(chǔ)，除了對樣品的分類和鑒定具有重要的意義，在藥理作用上也是主導(dǎo)作用，但不可忽視動物藥材中其他小分子代謝物，如有機(jī)酸類、揮發(fā)性成分等對藥理作用的影響，需要根據(jù)每類物質(zhì)的相對含量，確定不同成分在藥物活性的分析中的權(quán)重.

由于脂質(zhì)成分物質(zhì)類型極為豐富，實(shí)驗(yàn)中為了達(dá)到最佳的質(zhì)譜分析效果，對色譜條件進(jìn)行了多次優(yōu)化，不同類型相對差異實(shí)驗(yàn)中也對流動相體系做了相應(yīng)的考察，加入0.1%甲酸和10 mmol·L-1甲酸銨能有效改善色譜峰型，乙腈、異丙醇和水的梯度洗脫程序，可以分離出更多的脂質(zhì)成分，同時(shí)可以增加柱效，能讓物質(zhì)分離過程中充分的展開.

以上的分析數(shù)據(jù)基于11種動物類中藥進(jìn)行了初步嘗試，實(shí)驗(yàn)中的樣本數(shù)量和品種偏少，但表明代謝分析方法對于動物類中藥的研究有很好的參考價(jià)值，下一步將繼續(xù)增加樣品數(shù)量和品種，便于更為準(zhǔn)確地研究動物類中藥的特性.