周銀麗，熊 浪，陳永玲，彭夢(mèng)林，楊 偉，胡先奇

（1.紅河學(xué)院，a.云南省高校農(nóng)作物優(yōu)質(zhì)高效栽培與安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；b.商學(xué)院，云南 蒙自 661100；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物多樣性與病害控制教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650201）

間套作種植模式在中國(guó)有悠久的歷史，適宜的間套作模式對(duì)緩解用地矛盾、增加土地產(chǎn)能、降低病蟲(chóng)害、維持土壤生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性以及促進(jìn)土地可持續(xù)利用具有重要作用［1］，可提高根際微生物多樣性［2］，并且改善農(nóng)田生態(tài)環(huán)境，促進(jìn)生態(tài)平衡。高圣超等［3］通過(guò)研究不同大豆種植制度對(duì)土壤質(zhì)量的影響表明大豆輪作、間套作有助于充分利用耕地資源，改善土壤理化性質(zhì)，提高土壤酶活性更有利于維持土壤地力，提高土壤質(zhì)量；國(guó)內(nèi)外大量研究表明，合理間套作能夠顯著改善作物的礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)，從而促進(jìn)作物生長(zhǎng)、提高產(chǎn)量［4］。李章輝［5］通過(guò)研究花生連作田中土壤微生物群落得出隨著花生連作年限的增加，土壤中真菌數(shù)量增加，細(xì)菌數(shù)量減少，證明連作使細(xì)菌型土壤向真菌型土壤轉(zhuǎn)化。土壤微生物群落在不同的土壤、溫度及水分條件下都有不同的成分構(gòu)成。土壤微生物參與土壤腐殖質(zhì)形成、有機(jī)質(zhì)分解、養(yǎng)分轉(zhuǎn)化和循環(huán)等過(guò)程，對(duì)土壤肥力形成及養(yǎng)分供應(yīng)具有明顯的調(diào)節(jié)作用［6］；同時(shí)，土壤養(yǎng)分也為土壤微生物提供生長(zhǎng)環(huán)境及能量，使得土壤質(zhì)量可通過(guò)微生物的變化而體現(xiàn)［7］。石榴是一種重要的經(jīng)濟(jì)果樹(shù)，廣泛用于食品、醫(yī)用及有機(jī)合成，具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。隨著石榴種植規(guī)模的逐漸擴(kuò)大，石榴病害日益嚴(yán)重，影響了石榴的產(chǎn)量，造成較嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，研究表明石榴枯萎病的病原菌是甘薯長(zhǎng)喙殼（Ceratocystis fimbriata）［8］。蒙自市發(fā)現(xiàn)石榴枯萎病的時(shí)間較早，相關(guān)的防治研究陸續(xù)在開(kāi)展［9，10］，近年來(lái)石榴枯萎病在當(dāng)?shù)氐奈：χ鹉昙又?，是一種危害極為嚴(yán)重的毀滅性土傳病害，很難防治，石榴枯萎病嚴(yán)重威脅著石榴產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。利用高通量測(cè)序的方法分析比較枯萎病石榴根際細(xì)菌與健康石榴根際細(xì)菌及間作桃樹(shù)石榴園枯萎病土壤細(xì)菌多樣性的差異，解析枯萎病石榴園間作桃樹(shù)對(duì)改善土壤微生態(tài)平衡及其對(duì)多年生石榴果園連作障礙的修復(fù)作用。

1 材料與方法

1.1 石榴根際土樣的采集

在云南省石榴主要栽培區(qū)的石榴園，分別選取石榴枯萎病根際土（MZD1、MZD2、MZD3）、健康石榴樹(shù)根際土（MZ6、MZ7、MZ8）、間作桃樹(shù)的石榴枯萎病土壤（MZP17、MZP18、MZP19）3種類型土壤，除去地表面土壤，采集根系周圍1 cm左右的土為根際土，置于無(wú)菌自封袋中，將5棵同種果樹(shù)根際土樣混合作為一個(gè)樣品，每種類型的石榴土壤樣品均設(shè)3個(gè)重復(fù)，將土樣置于冷藏箱中，及時(shí)帶回實(shí)驗(yàn)室分析處理，首先進(jìn)行去雜和過(guò)篩處理，用于土壤基因組DNA提取的土壤樣品，置于1.5 mL的離心管裝好，-80℃冰箱保存。

1.2 土壤基因組DNA提取方法

用土壤基因組DNA提取OMEGA試劑盒，參照步驟進(jìn)行，提取好的DNA放在-20℃冰箱保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 3種類型樣品根際土壤細(xì)菌的OTU分析及物種注釋

3種樣品MZD、MZ、MZP在界水平上的平均序列數(shù)目分別為33 160、14 742、15 426；MZD、MZ、MZP在門(mén)水平上的平均序列數(shù)目分別為33 099、14 729、15 419；MZD、MZ、MZP在綱水平上的平均序列數(shù)目分別為32 779、14 631、15 362；MZD、MZ、MZP在目水平上的平均序列數(shù)目分別為26 781、12 743、13 634；MZD、MZ、MZP在科水平上的平均序列數(shù)目分別為15 953、8 554、9 607；MZD、MZ、MZP在屬水平上的平均序列數(shù)目分別為5 884、3 661、4 497；MZD、MZ、MZP在種水平上的平均序列數(shù)目分別為1 443、970、850，物種序列構(gòu)成柱狀見(jiàn)圖1。

圖1 每個(gè)樣品細(xì)菌在各分類水平上的序列構(gòu)成

按所有樣品間序列最小值對(duì)OTUs聚類結(jié)果進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，根據(jù)OTUs聚類分析結(jié)果和研究需求，分析不同樣品之間OTUs的共有、特有信息繪制韋恩圖（Venn Graph），結(jié)果見(jiàn)圖2。在圖2中比較了3種不同土壤樣品中OTUs的信息，MZD、MZ、MZP的OTUs數(shù)分別為1 727、1 662、1 510，MZD、MZ、MZP共 有 的OTUs有1 246，MZD特 有OTUs數(shù) 為159，MZ特有OTUs數(shù)為46，MZP特有OTUs數(shù)為54。

圖2 三種類型土壤樣品細(xì)菌多樣性

2.2 3種類型樣品根際土壤細(xì)菌微生物多樣性統(tǒng)計(jì)及物種豐度聚類

2.2.1 門(mén)水平上3種類型樣品根際土壤細(xì)菌多樣性 門(mén)水平上3種類型樣品根際土壤細(xì)菌多樣性見(jiàn)圖3。MZP18中BRC1、AD3、酸桿菌門(mén)（Acidobacteria）相對(duì)豐度較高，綠彎菌門(mén)（Chloroflexi）、WS3、裝甲菌門(mén)（Armatimonadetes）相對(duì)豐度較低；MZ7中迷蹤菌門(mén)（Elusimicrobia）、OD1、GAL15相對(duì)豐度較高，裝甲菌門(mén)、綠菌門(mén)（Chlorobi）、綠彎菌門(mén)相對(duì)豐度較低；MZ6中TM6、泉古菌門(mén)（Crenarchaeota）、綠彎菌門(mén)相對(duì)豐度較高，浮霉菌門(mén)（Planctomycetes）、酸桿菌門(mén)、硝化螺旋菌門(mén)（Nitrospirae）相對(duì)豐度較低；MZP19中擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）、藍(lán)藻門(mén)（Cyanobacteria）、綠菌門(mén)相對(duì)豐度較高，AD3、厚壁菌門(mén)（Firmicutes）、WS3相對(duì)豐度較低；MZD1中裝甲菌門(mén)、TM6、纖維桿菌門(mén)（Fibrobacteres）相對(duì)豐度較高，泉古菌門(mén)、AD3、廣古菌門(mén)（Euryarchaeota）相對(duì)豐度較低；MZ8中浮霉菌門(mén)、TM7、Thermi相對(duì)豐度較高，TM6、迷蹤菌門(mén)、OD1相對(duì)豐度較低；MZP17中疣微菌門(mén)（Verrucomicrobia）、放線菌門(mén)（Actinobacteria）、AD3相對(duì)豐度較高，浮霉菌門(mén)、酸桿菌門(mén)、芽單胞菌門(mén)（Gemmatimonadetes）相對(duì)豐度較低；MZD3中酸桿菌門(mén)、厚壁菌門(mén)（Firmicutes）、WS3相對(duì)豐度較高，放線菌門(mén)、變形菌門(mén)（Proteobacteria）、泉古菌門(mén)相對(duì)豐度較低；MZD2中廣古菌門(mén)（Euryarchaeota）、NC10、GNO4相對(duì)豐度較高，擬桿菌門(mén)、疣微菌門(mén)、AD3相對(duì)豐度較低。

圖3 門(mén)水平上3種類型樣品根際土壤細(xì)菌的物種豐度聚類

2.2.2 屬水平上3種類型樣品根際土壤細(xì)菌多樣性 如表1所示，在屬的分類水平上，3種類型土壤的細(xì)菌在一定程度上存在著數(shù)量上的顯著差異性，枯萎病石榴根際細(xì)菌與栽種桃樹(shù)修復(fù)枯萎病石榴土壤根際細(xì)菌存在顯著差異的屬有蓖麻桿菌屬（Kaistobacter）、紅游動(dòng)菌屬（Rhodoplanes）、假諾卡氏菌屬（Pseudonocardia）、新鞘脂菌屬（Novosphingobium）、地嗜皮菌屬（Geodermatophilus）、類諾卡氏菌屬（Nocardioides）、戴 沃 斯 菌 屬（Devosia）、苯 基 桿 菌 屬（Phenylobacterium）、放線孢菌屬（Actinomycetospora）、豐祐菌屬（Opitutus）、無(wú)色桿菌屬（Achromobacter）、腸球菌屬（Enterococcus）、纖維菌屬（Cellulosimicrobium）、黃桿菌屬（Flavobacterium）、柄桿菌屬（Caulobacter）、諾卡氏菌屬（Nocardia）等。栽種桃樹(shù)修復(fù)石榴枯萎病土壤根際與健康石榴根際土壤細(xì)菌存在顯著差異的屬有假諾卡氏菌屬、苯基桿菌屬、放線孢菌屬、無(wú)色桿菌屬、鏈球菌屬、柄桿菌屬、糖單孢菌屬、諾卡氏菌屬等。

表1 屬水平上3種類型樣品根際土壤細(xì)菌多樣性的部分統(tǒng)計(jì)分析

2.3 3種類型土壤樣品的根際細(xì)菌多樣性的PCA比較

對(duì)3種類型土壤樣品的根際細(xì)菌多樣性進(jìn)行PCA［11］（Principal Component Analysis，PCA）分析，結(jié)果見(jiàn)圖4，第一主成分對(duì)樣品差異的貢獻(xiàn)值為33.92%，第二主成分對(duì)樣品差異的貢獻(xiàn)值為19.79%。間作桃樹(shù)的石榴枯萎病土壤（MZP）的細(xì)菌群落組成較相似，距離較近，基本聚在一起；蒙自石榴園的健康石榴根際土壤樣品（MZ）與間作桃樹(shù)的石榴枯萎病土壤（MZP）的細(xì)菌群落組成也較相似，距離相對(duì)較近，基本聚在一起；來(lái)自蒙自市石榴園的枯萎病石榴根際土壤樣品MZD1與MZD2、MZD3的距離相對(duì)較遠(yuǎn)，群落組成差異相對(duì)較大，可能與采樣地域跨度較大有關(guān)。間作桃樹(shù)的石榴枯萎病根際土壤（MZP）的細(xì)菌群落組成與枯萎病石榴根際土壤樣品（MZD）的細(xì)菌群落組成差異較大。

圖4 3種類型土壤樣品細(xì)菌的PCA分析

3 討論

利用16S rDNA測(cè)序法研究土壤根際細(xì)菌多樣性的報(bào)道較多。楊廣容等［12］基于16S rDNA測(cè)序法對(duì)茶園土壤細(xì)菌群落多樣性的研究，表明古茶園土壤細(xì)菌的豐度和多樣性高于現(xiàn)代茶園及森林，徐麗霞等［13］研究了玉米根際土壤（RS）與非根際土壤（NRS）土壤細(xì)菌多樣性的差異，同時(shí)利用細(xì)菌16S rDNA測(cè)序法研究健康及病害植物土壤根際細(xì)菌多樣性差異的報(bào)道也較多。鄧曉等［14］研究了3個(gè)典型香蕉枯萎病患病樣地的健康植株根區(qū)土壤和患病植株根區(qū)土壤細(xì)菌遺傳基因多樣性，從微生物生態(tài)學(xué)的角度解釋香蕉枯萎病的發(fā)生原因并為其防控提供理論依據(jù)。馬云艷等［15］研究表明辣椒病株根區(qū)土中的微生物數(shù)量較健康植株發(fā)生較大變化，其中真菌數(shù)量增加388.9%，辣椒病株與健康植株根區(qū)土中微生物數(shù)量異常，種類變化是辣椒疫病發(fā)生的重要原因之一。研究表明，間作桃樹(shù)的石榴枯萎病土壤與石榴枯萎病石榴根際土壤細(xì)菌多樣性在屬的分類水平上，兩種類型土壤有16屬的細(xì)菌差異顯著，說(shuō)明通過(guò)間作桃樹(shù)可以改變枯萎病石榴根際的細(xì)菌多樣性，進(jìn)而改善土壤微生態(tài)平衡，促進(jìn)石榴健康生長(zhǎng)。

4 小結(jié)

用高通量測(cè)序的方法研究了云南省蒙自市石榴園根際細(xì)菌的多樣性，通過(guò)對(duì)石榴枯萎病根際土、健康石榴樹(shù)根際土、栽種桃樹(shù)修復(fù)枯萎病土壤3種類型樣品根際土壤細(xì)菌多樣性進(jìn)行物種注釋，探索間作桃樹(shù)對(duì)石榴園枯萎病土壤根際細(xì)菌多樣性的影響。結(jié)果表明，MZD、MZ、MZP得到的OTUS數(shù)分別為1 727、1 662、1 510。PCA分析結(jié)果表明，間作桃樹(shù)修復(fù)石榴枯萎病根際土壤的細(xì)菌群落組成與枯萎病石榴根際土壤樣品的細(xì)菌群落組成差異較大，間作桃樹(shù)能較大程度改變枯萎病石榴根際土壤細(xì)菌的群落組成。在屬的分類水平上，栽種桃樹(shù)修復(fù)枯萎病土壤與健康石榴根際土壤細(xì)菌多樣性顯著差異的屬有假諾卡氏菌屬、苯基桿菌屬、放線孢菌屬等8種。栽種桃樹(shù)修復(fù)枯萎病土壤與枯萎病石榴根際土壤細(xì)菌存在顯著差異的細(xì)菌屬有鏈球菌屬、纖維菌屬、放線孢菌屬、蓖麻桿菌屬、紅游動(dòng)菌屬、假諾卡氏菌屬等16種。這些屬在兩種根際土壤中的差異顯著，說(shuō)明在石榴枯萎病發(fā)生園區(qū)間作桃樹(shù)改變了枯萎病石榴根際的細(xì)菌多樣性，改善土壤微生態(tài)平衡，對(duì)利用間作桃樹(shù)控制石榴枯萎病的發(fā)生及擴(kuò)散提供了一定的參考。