張傳杰， 田 鶴， 梅晰凡

(1.錦州醫(yī)科大學(xué) 附屬第一醫(yī)院, 遼寧 錦州 121001；2.錦州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 遼寧 錦州 121001)

0 引言

衰老是一種復(fù)雜的生理、病理現(xiàn)象，衰老的個(gè)體不僅生理功能下降而且對(duì)外界環(huán)境變化的應(yīng)激能力明顯減弱。隨著年齡的增加，脊髓出現(xiàn)形態(tài)和功能的改變，影響感覺和運(yùn)動(dòng)[1]。老齡的脊髓椎管變窄，灰質(zhì)中神經(jīng)元數(shù)量減少，神經(jīng)遞質(zhì)合成能力下降，突起數(shù)量減少[2]。鋅是人體內(nèi)含量豐富的微量元素之一，參與多種生理活動(dòng)，也調(diào)控一些疾病的發(fā)生發(fā)展。神經(jīng)元富含鋅離子，10%～15%的鋅離子位于突觸小泡內(nèi)，鋅離子的穩(wěn)態(tài)受鋅結(jié)合蛋白和鋅轉(zhuǎn)運(yùn)體調(diào)控[3]。鋅轉(zhuǎn)運(yùn)體(Zinc transporter,ZnT)家族包括至少10個(gè)成員，即ZnT1-ZnT10，它們負(fù)責(zé)將鋅離子從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外，或者將胞質(zhì)內(nèi)的鋅離子轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞器內(nèi)。研究報(bào)道，ZnT1-ZnT10在脊髓灰質(zhì)前角和后角的神經(jīng)元內(nèi)均有不同程度的表達(dá)[4]。本課題組在之前的研究中證實(shí)鋅離子穩(wěn)態(tài)的失衡以及鋅轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)的改變與脊髓損傷關(guān)系密切，適量補(bǔ)充鋅離子可明顯減少神經(jīng)元的凋亡[5]。本研究旨在通過比較青年小鼠和老年小鼠脊髓組織中鋅轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)和凋亡相關(guān)蛋白含量的差異，為了解脊髓老化的病理、生理機(jī)制提供參考，為指導(dǎo)老齡患者脊髓病變的治療提供思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑

C57BL/6J小鼠，雄性，8～10周齡10只，18～20月齡10只，體重25～30 g。購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，飼養(yǎng)于錦州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境SPF級(jí)，自由食水，自然光暗周期，室溫22～25℃。納入實(shí)驗(yàn)的老年組小鼠血液生化指標(biāo)正常，但行動(dòng)遲緩。本研究過程的所有操作符合動(dòng)物倫理學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)和要求。ZnT1抗體(absin)、ZnT3抗體(proteintech)、ZnT6、ZnT10抗體(biorbyt)、Bax、Bcl-2抗體(CST)、GAPDH抗體(abcam)。免疫組化染色試劑盒(北京中杉金橋生物公司)。DAB顯色劑(碧云天生物公司)。BCA蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒(碧云天生物公司)。羊抗兔二抗(abcam)。PVDF膜(millipore)。ECL發(fā)光液(Thermo Fisher Scientific)。

1.2 標(biāo)本制備

青年和老年組小鼠各5只，3%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉小鼠，預(yù)冷的4%多聚甲醛心臟灌流固定，取出L5-6節(jié)段脊髓組織，4%多聚甲醛固定48 h以上。梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，用于形態(tài)學(xué)觀察。青年組和老年組小鼠各5只，麻醉后快速剝離脊髓組織，凍存于-80℃，用于Westernblot檢測(cè)。

1.3 小鼠脊髓組織HE染色

包埋好的石蠟塊制成5 μm厚的切片。烘干后的切片常規(guī)脫蠟至水。蘇木精染色5 min，鹽酸乙醇分色3 s，流水沖洗，伊紅染色5 min，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光鏡觀察。

1.4 小鼠脊髓組織中ZnT1、ZnT3、ZnT6、ZnT10免疫組織化學(xué)染色

脊髓組織石蠟切片，脫蠟至水，3% H2O2室溫封閉10 min去除內(nèi)源性過氧化物酶活性，高壓修復(fù)抗原，室溫冷卻，山羊血清封閉10 min，滴加一抗(ZnT1 1∶200；ZnT3 1∶150；ZnT6 1∶100；ZnT10 1∶200)，4℃過夜。PBS清洗切片，滴加多聚物，室溫孵育15 min，PBS清洗，滴加二抗，室溫孵育15 min，PBS清洗。DAB顯色，蘇木素染色細(xì)胞核，脫水，透明，中性樹膠封片。顯微鏡下觀察拍照。

1.5 小鼠脊髓組織中ZnT1、ZnT3、ZnT6、ZnT10表達(dá)量的體視學(xué)測(cè)量

每組每種抗體選取5張免疫組化染色圖片，每張圖片按照“S”形選取5個(gè)高倍視野，通過目鏡方格測(cè)試系統(tǒng)、點(diǎn)記數(shù)法，分別測(cè)算ZnT1、ZnT3、ZnT6和ZnT10的體密度值，計(jì)算公式如下：

體密度值：VV=ΣPX/ΣPC

式中，PX為方格測(cè)試系統(tǒng)落在陽(yáng)性表達(dá)部位的點(diǎn)數(shù)；PC為方格測(cè)試系統(tǒng)落在參照系的點(diǎn)數(shù)。

1.6 小鼠脊髓組織中Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)的免疫印跡檢測(cè)

取冷凍待用的脊髓組織，超聲粉碎機(jī)粉碎后加入裂解液，4℃裂解30 min。離心取上清液，BCA法測(cè)總蛋白濃度，加入上樣緩沖液，加熱變性。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉60 min，裁膜后加一抗(Bax 1∶500；Bcl-2 1∶500；GAPDH 1∶2000)，4℃孵育過夜。TBST洗滌，加入羊抗兔IgG (1∶5000)，室溫孵育1 h，TBST洗膜，應(yīng)用ECL試劑顯色，采集條帶圖像，應(yīng)用Image J軟件分析蛋白灰度值，以目的蛋白/GAPDH量化蛋白。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

使用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，應(yīng)用ANOVA檢驗(yàn)和t檢驗(yàn)進(jìn)行組間差異比較，P<0.05表明具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HE染色結(jié)果

脊髓灰質(zhì)中含大量的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，由胞體和突起構(gòu)成，胞體大小不等，形狀各異。如圖1所示，青年小鼠脊髓組織中神經(jīng)元數(shù)量多、結(jié)構(gòu)完整、尼氏體含量豐富。而老年小鼠的脊髓組織中神經(jīng)元數(shù)量較少，突起也較少。

圖1 小鼠脊髓組織HE染色(A，B：青年小鼠脊髓；C，D：老年小鼠脊髓)

2.2 免疫組織化學(xué)染色及體視學(xué)分析結(jié)果

在脊髓灰質(zhì)神經(jīng)元內(nèi)可見到ZnT1、ZnT3、ZnT6和ZnT10的表達(dá)，陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物呈棕褐色。ZnT1表達(dá)于神經(jīng)元的胞膜、胞質(zhì)、胞核和突起中。ZnT3和ZnT6表達(dá)于核周質(zhì)和突起內(nèi)。與青年小鼠比較，老年小鼠脊髓神經(jīng)元內(nèi)ZnT1、ZnT3和ZnT6的體密度值均減弱。ZnT10表達(dá)于胞質(zhì)和細(xì)胞核，老年小鼠脊髓組織中ZnT10的體密度值高于青年小鼠，如圖2和表1所示。

圖2 青年和老年小鼠脊髓組織中ZnTs表達(dá)(SP，scale bar=50μm)

表1 青年和老年小鼠脊髓組織ZnTs體密度值(mm-1)

2.3 免疫印跡檢測(cè)結(jié)果

與青年小鼠比較，老年小鼠脊髓組織中抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)顯著降低(P<0.01)，促凋亡蛋白Bax的表達(dá)明顯升高(P<0.01)，如圖3所示。

圖3 青年和老年小鼠脊髓組織中Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)比較(** P<0.01)

3 討論

目前，人口老齡化的趨勢(shì)日益加劇，據(jù)統(tǒng)計(jì)，到2050年，全球60歲以上的老年人口將達(dá)到21億。衰老是糖尿病、心血管疾病及神經(jīng)退行性疾病的主要危險(xiǎn)因素。近年來，學(xué)者們通過體視學(xué)等研究方法對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的衰老進(jìn)行了深入研究[6]。脊髓受年齡的影響早于腦，隨著年齡的增長(zhǎng),脊髓在形態(tài)學(xué)和生理特性等方面都會(huì)出現(xiàn)相應(yīng)的改變。研究發(fā)現(xiàn)，老年大鼠脊髓神經(jīng)元凋亡增加，線粒體減少，尼氏體減少，突觸數(shù)量減少，谷胱甘肽等生化物質(zhì)代謝改變，膠質(zhì)細(xì)胞增生，感覺和運(yùn)動(dòng)功能下降明顯[7]。本實(shí)驗(yàn)選取自然衰老且運(yùn)動(dòng)遲緩的老年小鼠L5-6節(jié)段的脊髓組織，檢測(cè)神經(jīng)元數(shù)量、形態(tài)和凋亡相關(guān)蛋白。HE染色結(jié)果顯示老年小鼠脊髓灰質(zhì)前角中運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元數(shù)量顯著減少，且尼氏體的含量也下降。神經(jīng)元數(shù)量的減少是運(yùn)動(dòng)遲緩的主要原因。為分析神經(jīng)元數(shù)量減少的原因，本研究應(yīng)用免疫印跡方法檢測(cè)Bcl-2和Bax的表達(dá)情況，Bcl-2和Bax是線粒體細(xì)胞凋亡信號(hào)通路中的重要基因，Bcl-2抑制細(xì)胞凋亡，而Bax則與Bcl-2形成同源或異源二聚體，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[8]。結(jié)果顯示：與青年小鼠比較，老年小鼠脊髓組織中Bcl-2的表達(dá)顯著降低，而Bax的表達(dá)明顯升高，Bax/Bcl-2比例上升。這一結(jié)果提示我們Bax/Bcl-2比例的改變導(dǎo)致線粒體膜通透性增加，激活一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)，引發(fā)神經(jīng)元凋亡，影響小鼠運(yùn)動(dòng)能力[9]。

鋅是人體重要的微量元素，由于咀嚼不充分和藥物的相互作用等原因，老年人血液中鋅離子含量普遍偏低，鋅缺乏是老年人常見病和死亡的一個(gè)重要誘因[10]。脊髓內(nèi)的神經(jīng)元富含鋅離子，鋅離子穩(wěn)態(tài)失衡與脊髓損傷和肌萎縮側(cè)索硬化等疾病關(guān)系密切。鋅離子不能自由通過細(xì)胞膜,鋅的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝需要特定的轉(zhuǎn)運(yùn)體和膜通道。目前的研究發(fā)現(xiàn)鋅轉(zhuǎn)運(yùn)體(ZnT)家族至少有10個(gè)成員，它們結(jié)構(gòu)相似，含豐富的組氨酸，可與鋅離子結(jié)合。ZnTs的主要功能是將鋅離子運(yùn)出細(xì)胞或聚集到細(xì)胞器內(nèi)，降低胞質(zhì)內(nèi)的鋅濃度。ZnT1-ZnT10在脊髓中均有表達(dá)，ZnT1、ZnT3、ZnT6和ZnT10在脊髓相關(guān)疾病中研究較多。ZnT1的主要作用是將胞質(zhì)中的鋅離子運(yùn)到細(xì)胞間隙中[11]；ZnT3能將胞質(zhì)內(nèi)的鋅離子轉(zhuǎn)運(yùn)到突觸小泡內(nèi)[12]；ZnT6將胞質(zhì)中的鋅離子轉(zhuǎn)運(yùn)到高爾基體內(nèi)[13]；ZnT10調(diào)控鋅和錳的排出[14]。本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色和體視學(xué)分析檢測(cè)老年和青年小鼠脊髓內(nèi)ZnT1、ZnT3、ZnT6和ZnT10的表達(dá)變化。結(jié)果顯示：ZnT1在神經(jīng)元的細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均有表達(dá)；ZnT3和ZnT6表達(dá)于胞質(zhì)內(nèi)；ZnT10表達(dá)于胞質(zhì)和核，與青年組比較，老年組小鼠ZnT1、ZnT3和ZnT6的表達(dá)減弱，但ZnT10的表達(dá)升高。這一結(jié)果提示，老年小鼠脊髓組織中鋅轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)異常，這與衰老機(jī)體鋅離子水平下降有一定的關(guān)系，而鋅轉(zhuǎn)運(yùn)體的異常也會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)元內(nèi)鋅離子的分布改變，穩(wěn)態(tài)失衡，胞質(zhì)內(nèi)鋅離子的異常聚集會(huì)誘導(dǎo)形成淀粉樣斑塊，進(jìn)而影響神經(jīng)元的狀態(tài)和生存，影響感覺和運(yùn)動(dòng)功能。

本研究證明，衰老小鼠脊髓組織內(nèi)鋅轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)異常，影響神經(jīng)元的功能和生存，同時(shí)衰老也影響B(tài)cl-2和Bax蛋白的表達(dá)，從線粒體途徑誘發(fā)神經(jīng)元凋亡[8]，影響小鼠的運(yùn)動(dòng)能力。今后的研究中，我們會(huì)對(duì)鋅離子代謝進(jìn)行干預(yù)，運(yùn)用更先進(jìn)的研究手段深入探討脊髓老化的病理生理機(jī)制，為老齡患者脊髓病變的治療提供更多的靶點(diǎn)。