黃表華 劉燕 黃蘭松 黃照河

【摘要】 目的 通過檢測(cè)心肌缺血再灌注損傷大鼠血清腫瘤壞死因子α（TNFα）、白介素6（IL6）含量以及顯微鏡觀察心肌細(xì)胞病理學(xué)結(jié)構(gòu)，探討龍血竭總黃酮對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷的影響。

方法 將40只SD大鼠隨機(jī)分為4組：空白對(duì)照組（control組）、假手術(shù)組（sham組）、缺血再灌注組（I/R組）、缺血再灌注+龍血竭總黃酮干預(yù)組（SDFI/R組），每組10只。I/R組及SDFI/R組進(jìn)行心肌缺血再灌注損傷造模。所有大鼠均在相應(yīng)處理后通過腹主動(dòng)脈采血留取血清標(biāo)本，通過ELISA法測(cè)定TNFα和IL6含量;留取結(jié)扎梗死相應(yīng)部位心肌組織進(jìn)行HE染色，顯微鏡下觀察其病理變化，并行qPCR檢測(cè)心肌組織TNFα和IL6的mRNA含量。

結(jié)果 大鼠心肌組織病理HE染色示：I/R組的心肌肌纖維有大范圍斷裂，結(jié)構(gòu)最為紊亂，炎癥、水腫最明顯;SDFI/R組心肌細(xì)胞排列較規(guī)整，斷裂較少，組織間隙水腫較輕;control組及sham組差異不大，心肌組織無明顯變性，心肌纖維排列基本規(guī)整，組織間隙水腫最輕，損傷最小。不同組間的TNFα、IL6水平比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;sham組、I/R組及SDFI/R組的TNFα、IL6水平均高于control組（P<0.05），SDFI/R組TNFα、IL6水平均低于I/R組（P<0.05）。不同組間的TNFα、IL6 mRNA 表達(dá)量比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）;sham組、I/R組及SDFI/R組的TNFα、IL6 mRNA水平高于control組（P<0.05），SDFI/R組、I/R組的TNFα、IL6 mRNA水平高于sham組（P<0.05），SDFI/R組的TNFα、IL6 mRNA水平低于I/R組（P<0.05）。

結(jié)論 龍血竭總黃酮可減少心肌缺血再灌注損傷大鼠血清中的炎癥因子TNFα和IL6的釋放，從而保護(hù)心肌細(xì)胞組織。

【關(guān)鍵詞】 心肌缺血再灌注損傷;龍血竭總黃酮;TNFα;IL6

中圖分類號(hào)：R542. 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： DOI：10.3969/j.issn.10031383.2021.06.002

Effects of Sanguis Draconis flavones on serum inflammatory cytokines TNFα and IL6 in myocardial ischemiareperfusion injury rats

HUANG Biaohua1， 2， LIU Yan1， HUNAG Lansong1， 2， HUANG Zhaohe1▲

（1. Department of Cardiology of Affiliated Hospital， 2. Graduate School， Youjiang Medical University for Nationalities， Baise 533000， Guangxi， China）

【Abstract】 Objective To discuss the influence of Sanguis Draconis flavones （SDF） on myocardial ischemiareperfusion injury （MIRI） by detecting the content of serum tumor necrosis factorα （TNFα） and interleukin6 （IL6） in MIRI rats， and by observing pathological structure of cardiomyocytes of them under microscope.

Methods 40 SD rats were randomly divided into four groups： control group， sham group， ischemiareperfusion（I/R）group， and I/R + Sanguis Draconis flavones （SDFI/R） group， with 10 rats in each group. MIRI models were made in the I/R group and the SDFI/R group. Blood sample were collected from the abdominal aorta， and their serum TNFα and IL6 were detected by ELISA. Finally， the rats were sacrificed and their hearts were immediately taken out， the corresponding myocardial tissues were ligated for HE staining， the pathological changes were observed under microscope， and the mRNA content of TNFα and IL6 in myocardial tissues were detected by qPCR.

Results Pathological HE staining of the myocardial tissue of rats showed that myocardial muscle fibers in the I/R group had a wide range of breakage， the most disordered structure， and the most obvious inflammation and edema. In the SDFI/R group， the arrangement of myocardial cells was more regular， the rupture was less， and the interstitial edema was milder. There was no significant difference between the control group and the sham group， no obvious degeneration of the myocardial tissue was found， the arrangement of myocardial fibers was basically regular， the intertissue edema was the mildest， and the injury was the least. Difference of the TNFα and IL6 levels among groups was statistically significant （P < 0.01）， the TNFα and IL6 levels of the sham group， the I/R group， and the SDFI/R group were higher than those of the control group （P < 0.05）， and those in the SDFI/R group were lower than those in the I/R group （P <0.05）. There was statistically significant difference in TNFα and IL6 mRNA expression levels （P < 0.001）. The TNFα and IL6 mRNA levels of the sham group， the I/R group and the SDFI/R group were higher than those of the control group （P <0.05）， those of the SDFI/R group and the I/R group were higher than those of the sham group （P < 0.05）， and those of the SDFI/R group were lower than those of the I/R group （P <0.05）.

Conclusion SDF can reduce the release of inflammatory cytokines TNFα and IL6 in serum of rats with myocardial ischemiareperfusion injury， so as to protect myocardial tissue.

【Key words】 MIRI; SDF; TNFα; IL6

心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemiareperfusion injury，MIRI）是指缺血心肌在恢復(fù)血流再灌注后，反而加重其結(jié)構(gòu)破壞，引起心肌細(xì)胞死亡，導(dǎo)致梗死范圍擴(kuò)大，造成心功能的進(jìn)一步損害并影響急性心肌梗死（AMI）患者的預(yù)后[1]。MIRI是AMI再灌注治療中最棘手的問題，嚴(yán)重影響AMI患者的預(yù)后，是當(dāng)前國內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)擬建立大鼠在體MIRI模型，研究龍血竭總黃酮對(duì)MIRI大鼠炎癥因子的影響;擬為探討中藥防治MIRI拓展新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

SD大鼠40只，7～8個(gè)周齡，體重（250±20）g，雌雄各半，健康狀況良好;由湖南省長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司提供（動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK〔湘〕20140011）;飼料由右江民族醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供;龍血竭粉劑由桂林三金制藥研究所提供。TNFα 定量ELISA試劑盒由武漢華美生物工程有限公司提供;IL6定量ELISA試劑盒由欣博盛生物科技有限公司提供;實(shí)時(shí)定量PCR引物及試劑由武漢賽維爾生物科技有限公司提供。

1.2 分組和給藥

將40只SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表分為4組：空白對(duì)照組（control組）、假手術(shù)組（sham組）、缺血再灌注組（I/R組）、缺血再灌注+龍血竭總黃酮干預(yù)組（SDFI/R組），每組10只。control組不進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前干預(yù);sham組、I/R組每組實(shí)驗(yàn)前分別給予0.9%生理鹽水（10 mL/kg）灌胃;SDFI/R組每天予大鼠龍血竭總黃酮灌胃預(yù)處理（180 mg/kg）[2]。連續(xù)灌胃28天后開始實(shí)驗(yàn)造模。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造模[3～4]

第29天手術(shù)，術(shù)前禁食12小時(shí)。在10%水合氯醛（350 mg·mL-1）[5]腹腔注射麻醉下，仰位固定大鼠，四肢皮下連接標(biāo)準(zhǔn)導(dǎo)聯(lián)心電圖監(jiān)測(cè)，前頸、胸備皮，切開頸前皮膚，鈍性分離出氣管，T型切開氣管，連接氣管插管后，連接小型動(dòng)物用呼吸機(jī)（潮氣量為20～30 mL·kg-1，頻率70～80次·min-1）。在胸骨左緣旁0.3～0.5 cm處縱行切開第3～5肋 ， 小心剪開心包， 暴露心臟， 結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支，造成急性心肌缺血。缺血30 min后，缺血心肌顏色較相鄰區(qū)域變淺或變白，心電圖監(jiān)測(cè)顯示進(jìn)行性心肌缺血變化后Ⅱ?qū)?lián)ST段抬高證明造模成功，剪開縫扎線，進(jìn)行再灌注120 min，造成MIRI模型[6]。假手術(shù)組的動(dòng)物手術(shù)全過程與其他組相同，但只穿線不結(jié)扎冠脈，并在穿線后將心臟放回胸腔，適當(dāng)閉合胸腔切口。空白對(duì)照組不進(jìn)行手術(shù)。

1.4 檢測(cè)各組TNFα和IL6含量

所有大鼠均在相應(yīng)處理后通過腹主動(dòng)脈采血并留取血清標(biāo)本，嚴(yán)格按照ELISA方法規(guī)程步驟進(jìn)行炎癥因子TNFα和IL6含量檢測(cè)，各組間進(jìn)行對(duì)比。

1.5 鏡下觀察心肌細(xì)胞纖維的變化情況

同時(shí)采用腹腔動(dòng)脈放血法處死大鼠后立即取出心臟，留取結(jié)扎相應(yīng)部位心肌組織進(jìn)行HE染色，鏡下觀察心肌細(xì)胞纖維的變化情況[7]。

1.6 檢測(cè)心肌組織TNFα、IL6的mRNA表達(dá)量

對(duì)目標(biāo)心肌組織行qPCR檢測(cè)TNFα、IL6的mRNA表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較用OneWay ANOVA方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多組間兩兩比較采用SNK法，檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05，雙側(cè)檢驗(yàn)。

2 果

2.1 造模大鼠心電生理變化情況

觀察Ⅱ?qū)?lián)的心電圖改變，以造模30分鐘ST段抬高與0分鐘時(shí)比較超過2 mV，再灌注120 min 觀察到高聳的T波下降或者已抬高的ST段下降1/2以上為造模成功（如圖1）。

2.2 鏡下觀察各組大鼠心肌組織HE染色

通過閱片比較I/R組的心肌肌纖維有明顯斷裂，結(jié)構(gòu)最為紊亂，心肌間隙炎癥、水腫最明顯，核周空泡最多，SDFI/R組與I/R組比較顯示排列較規(guī)整，斷裂較少，組織間隙水腫較輕，核周空泡形成較少;control組與sham組差異不大，心肌組織無明顯變性，心肌纖維排列基本規(guī)整，組織間隙無明顯水腫，未見明顯損傷（見圖2）。

2.3 檢測(cè)血清學(xué)TNFα和IL6含量

經(jīng)參照TNFα和IL6的ELISA試劑盒說明書，將已按濃度梯度稀釋后待測(cè)樣品，同標(biāo)準(zhǔn)品一起檢測(cè)，檢測(cè)出標(biāo)準(zhǔn)品OD值與濃度之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線和相應(yīng)公式（如圖3、圖4），將得到的在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍待測(cè)樣品OD值代入相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，再乘以相應(yīng)稀釋的比例，得出各待測(cè)樣品的濃度。

不同組間的TNFα、IL6水平比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;sham組、I/R組及SDFI/R組的TNFα、IL6水平均高于control組（P<0.05），SDFI/R組TNFα、IL6水平均低于I/R組（P<0.05）。見表1。說明了sham組在相應(yīng)的手術(shù)干預(yù)150 min的時(shí)長(zhǎng)后仍出現(xiàn)了與創(chuàng)傷性相應(yīng)的炎癥反應(yīng)。

2.4 qPCR檢測(cè)TNFα、IL6的mRNA表達(dá)量

不同組間的TNFα mRNA、IL6 mRNA 表達(dá)量比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）;sham組、I/R組及SDFI/R組的TNFα mRNA、IL6 mRNA水平高于control組（P<0.05），SDFI/R組、I/R組的TNFα mRNA、IL6 mRNA水平高于sham組（P<0.05），SDFI/R組的TNFα mRNA、IL6 mRNA水平低于I/R組（P<0.05）。見表2。

3 論

《中國心血管病報(bào)告2018》指出，2016 年心血管病病死率仍居首位，高于腫瘤及其他疾病;中國城市和農(nóng)村居民冠心病病死率繼續(xù)保持2012 年以來的上升趨勢(shì)，農(nóng)村地區(qū)冠心病病死率上升趨勢(shì)明顯。最新歐洲心臟調(diào)查顯示：歐洲每年有4萬人死于心血管病，美國每年有90萬人患AMI，其中22.5萬人死亡。世界衛(wèi)生組織“全球疾病負(fù)擔(dān)研究”的統(tǒng)計(jì)數(shù)字預(yù)示，到2020年，中國每年因冠心病死亡的人數(shù)將有可能達(dá)到400萬[8～9]。心肌缺血再灌注損傷的發(fā)病機(jī)制較復(fù)雜，氧化損傷、鈣超載、炎性反應(yīng)等眾多路徑及病理生理過程與之有關(guān)，而心肌缺血再灌注過程中創(chuàng)傷性炎癥的發(fā)生與心肌缺血再灌注損傷密切相關(guān)[10]。TNFα是分子量為17 kDa的可溶性多肽，是一種單核因子（炎癥因子），心肌的巨核細(xì)胞和單核細(xì)胞都可以合成產(chǎn)生TNFα，它具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，參與炎癥反應(yīng)、介導(dǎo)休克、組織損傷的過程，也參與腫瘤細(xì)胞殺傷、調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖以及機(jī)體的免疫代謝等病理生理反應(yīng)[11～12]。IL6是炎癥風(fēng)暴中一個(gè)重要的因子，也是一種多效的細(xì)胞因子，在炎癥反應(yīng)中起著調(diào)節(jié)作用;當(dāng)炎癥急性期時(shí)，其往往起著抗炎的作用，伴隨著炎癥的進(jìn)展，IL6的這種抗炎作用逐步轉(zhuǎn)成促炎效應(yīng)，而出現(xiàn)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生不利的影響。故IL6在急性心肌梗死過程中扮演著非常重要的角色，心肌壞死的面積與血漿中的IL6水平存在著正相關(guān)性[13]。

楊瀟等人[14]對(duì)中醫(yī)藥治療心肌缺血再灌注損傷的進(jìn)展進(jìn)行了總結(jié)，有用地黃多糖、梔子苷、復(fù)方參元丹等中藥進(jìn)行了相關(guān)的研究，結(jié)果提示近年來中藥在防護(hù)心肌缺血再灌注損傷疾病方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，已成為研究熱點(diǎn)。龍血竭為百合科植物劍葉龍血樹 [Dracaena cochinchinensis （Lour.） S.C.Chen]的含脂木材經(jīng)提取得到的樹脂，主產(chǎn)于我國廣西、海南、云南等地，史書上記載具有活血化瘀之功效，同時(shí)還有去腐生肌、止血等功效，目前臨床上常用于斂瘡生肌、外傷止血和治療靜脈炎等。張曉燕等[15]研究表明，龍血竭化學(xué)成分以及藥理作用與進(jìn)口血竭接近，其主要成分為黃酮類、苯丙素類、皂苷類、甾醇類、木脂素類和二苯乙烯類等。而既往有多方面的學(xué)者針對(duì)龍血竭的作用從多方面多領(lǐng)域進(jìn)行了研究，近期林憶龍等[16]對(duì)龍血竭的藥理研究表明，龍血竭具有抗炎、保護(hù)心血管、防輻射、抗纖維化、抑菌、促進(jìn)創(chuàng)面愈合及保護(hù)中樞神經(jīng)等藥理作用。張鵬等人[17]在針對(duì)輻射所導(dǎo)致的神經(jīng)炎的研究中發(fā)現(xiàn)龍血竭的干預(yù)在這一過程發(fā)生中緩解了氧化應(yīng)激水平及相關(guān)的炎癥因子的表達(dá)和線粒體的損傷程度;而張媛等人[18]在對(duì)皮膚病痤瘡的治療中也同時(shí)觀察在動(dòng)物模型上運(yùn)用了龍血竭的中藥干預(yù)后對(duì)TNFα、IL6的水平的調(diào)控作用，證實(shí)了龍血竭在抗炎方面所具備的功效。但龍血竭在心肌缺血再灌注損傷所導(dǎo)致的炎癥風(fēng)暴中的作用尚未見文獻(xiàn)進(jìn)行報(bào)道。結(jié)合實(shí)際診治中龍血竭提取物作為臨床治療常用活血中藥，有改善心肌缺血、抗血栓、抗炎、抗心律失常、調(diào)血脂等作用，特設(shè)計(jì)了本實(shí)驗(yàn)過程及設(shè)想。

本實(shí)驗(yàn)中，結(jié)扎了左前降支的大鼠心電圖在30 min時(shí)出現(xiàn)了ST段較術(shù)前顯著抬高、T波明顯高聳，心電圖提示出現(xiàn)心肌缺血的變化;再灌注120 mim時(shí)心電圖ST段較結(jié)扎30 min時(shí)明顯回落，T波下降超過1/3～1/2，說明左前降支恢復(fù)了血供，提示再灌注成功;有以上變化過程的心電圖顯示則表明造模成功。

大鼠目標(biāo)心肌組織HE染色通過閱片比較各組結(jié)果，I/R組的結(jié)構(gòu)最為紊亂，肌纖維有明顯斷裂，心肌核周空泡化、心肌間質(zhì)水腫最明顯;SDFI/R組與I/R對(duì)比，其心肌排列較規(guī)整，斷裂較少，組織間隙水腫較輕;從病理組織層面上再證實(shí)了造模的效果，同時(shí)從不同組別結(jié)果的比較中，提示了龍血竭總黃酮的預(yù)干預(yù)對(duì)心肌細(xì)胞組織的有效保護(hù)作用。

血清學(xué)的檢測(cè)研究結(jié)果顯示，大鼠在創(chuàng)傷及心肌缺血再灌注時(shí)會(huì)釋放TNFα、IL6，其檢測(cè)結(jié)果與缺血再灌注后的損傷程度呈正相關(guān)，表明了心肌對(duì)損傷應(yīng)激反應(yīng)之一是合成并釋放TNFα、IL6，而TNFα及IL6可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞的凋亡[19]。本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果顯示，缺血再灌注組的血清TNFα、IL6含量明顯高于其他三組;假手術(shù)組的TNFα、IL6檢測(cè)結(jié)果與正常對(duì)照組比較亦有升高，考慮假手術(shù)組在經(jīng)歷了頸部剝離氣管插管、開胸暴露心臟、冠脈左前降支的穿線后的手術(shù)干預(yù)下30 min（對(duì)應(yīng)梗死時(shí)間）+120 min（對(duì)應(yīng)再灌注時(shí)間）觀察期仍出現(xiàn)了可能與創(chuàng)傷性相關(guān)的炎癥反應(yīng)，但其炎癥反應(yīng)水平仍明顯低于結(jié)扎了左前降支而出現(xiàn)心肌梗死的缺血再灌注組和缺血再灌注+龍血竭總黃酮干預(yù)組;與缺血再灌注組比較，龍血竭總黃酮干預(yù)組的炎癥指標(biāo)TNFα、IL6含量明顯減少，提示在心肌缺血再灌注損傷的發(fā)生過程中，龍血竭總黃酮的干預(yù)可減少TNFα、IL6的釋放。實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)TNFα、IL6的mRNA表達(dá)量的結(jié)果顯示，I/R組、SDFI/R組TNFα和IL6的mRNA表達(dá)量均有上升，而SDFI/R組的表達(dá)與I/R組表達(dá)比較有下調(diào)。同時(shí)證實(shí)了心肌缺血再灌注組損傷的大鼠誘發(fā)了炎癥反應(yīng)過程，釋放了大量的腫瘤炎癥因子，其中就有TNFα與IL6;而龍血竭總黃酮的干預(yù)能抑制TNFα、IL6的釋放，結(jié)合病理讀片的結(jié)果，這種干預(yù)機(jī)制保護(hù)了心肌缺血再灌注損傷大鼠的心肌細(xì)胞組織。但其干預(yù)的機(jī)制尚未能明確，是否調(diào)控了腫瘤炎癥因子TNFα、IL6的上游某個(gè)通路，或是對(duì)相應(yīng)下游的通路進(jìn)行抑制，從而使得機(jī)體內(nèi)的腫瘤炎癥因子的釋放或者表達(dá)量下降。

既往的研究已表明，HIF可以通過誘導(dǎo)缺血預(yù)適應(yīng)發(fā)揮心臟保護(hù)作用。缺氧誘導(dǎo)因子2α（Hypoxiainducible factor 2alpha，HIF2α）亞基是調(diào)節(jié)缺氧誘導(dǎo)因子（Hypoxiainducible factor 2，HIF2）活性的功能亞單位。韓永麗等[20]在探討電針內(nèi)關(guān)預(yù)處理對(duì)心肌缺血再灌注大鼠炎性因子TNFα、IL1β與MKK3/6p38MAPK通路的影響實(shí)驗(yàn)中，得出了p38MAPK信號(hào)通路介導(dǎo)了電針內(nèi)關(guān)預(yù)處理對(duì)I/R大鼠心肌組織的保護(hù)作用，并且上游激活物包括參與炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)的各類相關(guān)細(xì)胞因子，參與I/R的保護(hù)效應(yīng)的結(jié)論。在這個(gè)過程中，TNFα作為p38MAPK信號(hào)通路上游激活物的炎癥反應(yīng)因子。沈誠等人[21]曾在離體的心肌缺血再灌注損傷大鼠心臟對(duì)JAK/STAT通路進(jìn)行研究，他們團(tuán)隊(duì)通過使用JAK抑制劑AG490，STAT抑制劑RMP，對(duì)通路蛋白進(jìn)行干預(yù)，從而得出了抑制JAK/STAT通路的活化可下調(diào)心肌組織TNFα和IL6的表達(dá)，這可能有助于減輕缺血再灌注所致心肌損傷的結(jié)論。但這種通過抑制劑干預(yù)方式在臨床上大范圍的開展應(yīng)用具有一定的難度，所以進(jìn)行中醫(yī)藥的干預(yù)研究，是一個(gè)有意義和價(jià)值的探討方向。而龍血竭總黃酮是否會(huì)通過以上類似通路對(duì)心肌缺血再灌注損傷進(jìn)行調(diào)控保護(hù)，仍需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來發(fā)現(xiàn)與證明，因此深入而系統(tǒng)地進(jìn)行研究十分必要。

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（收稿日期：2020-12-03 修回日期：2021-05-31）

（編輯：梁明佩）