何 靖，何焜鵬，陸慧珍

（1.廣東省食品工業(yè)公共實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 511442；2.廣東省食品工業(yè)研究所有限公司，廣東廣州 511442；3.廣東省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)站，廣東廣州 511442)

山梨酸、苯甲酸和對(duì)羥基苯甲酸酯類是醬油生產(chǎn)中常用的防腐劑。山梨酸、苯甲酸屬于酸型防腐劑，會(huì)對(duì)其他微生物酶系統(tǒng)的正常運(yùn)轉(zhuǎn)產(chǎn)生一定影響而產(chǎn)生抑菌作用，使微生物的繁殖受到抑制[1]；對(duì)羥基苯甲酸酯（尼泊金酯）屬于酯型防腐劑，酚羥基結(jié)構(gòu)破壞微生物細(xì)胞膜，使細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)變性，可抑制微生物細(xì)胞呼吸酶系與電子傳遞酶系活性，從而達(dá)到抑菌防腐作用[2]，其抑菌作用隨著醇烴基碳原子數(shù)的增加而增加，且碳鏈越長(zhǎng)，毒性越小，用量越少[3]。過(guò)量使用防腐劑會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生一定的傷害，在一定程度上抑制骨骼生長(zhǎng)，危害腎、肝臟的健康[4]。有研究顯示，對(duì)羥基苯甲酸酯類具有弱雌激素活性，損害人體身心健康[5]。我國(guó)食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 2760—2014規(guī)定，醬油中山梨酸、苯甲酸限值均為1.0 g/kg，對(duì)羥基苯甲酸酯類添加量≤0.25 g/kg。

目前，測(cè)定山梨酸、苯甲酸和對(duì)羥基苯甲酸酯的方法眾多，主要有現(xiàn)行的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.28—2016、GB 5009.31—2016和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，包括液相色譜法[6]、氣相色譜法[7]、氣相色譜聯(lián)用質(zhì)譜法[8]、液相色譜聯(lián)用質(zhì)譜法[9]、毛細(xì)管電泳法[10]等。標(biāo)準(zhǔn)方法前處理步驟繁瑣，而且分別采用兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)方法才能完成測(cè)定，耗時(shí)長(zhǎng)，不利于大批量樣品的測(cè)定，所以有必要研究一種同時(shí)檢測(cè)醬油中常用的6種防腐劑的快速方法。本文采用氣相色譜法建立準(zhǔn)確、高效、快速測(cè)定醬油的山梨酸、苯甲酸及4種對(duì)羥基苯甲酸酯的檢測(cè)方法，為實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)和醬油企業(yè)的出廠檢驗(yàn)提供實(shí)際參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器與設(shè)備

島津GC-2010Plus氣相色譜儀配氫火焰離子化檢測(cè)器（FID），島津企業(yè)管理（中國(guó)）有限公司；渦旋振蕩器，德國(guó)IKA公司；高速冷凍離心機(jī)，曦瑪離心機(jī)（揚(yáng)州）有限公司；ME204E/02型電子天平，梅特勒-托利多（上海）有限公司。

1.1.2 材料與試劑

標(biāo)準(zhǔn)品：山梨酸（99.7%，Bepure）、苯甲酸（99.8%，Bepure）、對(duì)羥基苯甲酸甲酯（99.7%，Bepure）、對(duì)羥基苯甲酸乙酯（99.9%，Bepure）、對(duì)羥基苯甲酸丙酯（99.0%，Dr.Ehrenstorfer）和對(duì)羥基苯甲酸丁酯（99.9，ANPLE）。鹽酸（分析純）、乙酸乙酯（色譜純），實(shí)驗(yàn)室用水為Milli-Q一級(jí)超純水，實(shí)驗(yàn)中的樣品均購(gòu)于本地商店。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 溶液與標(biāo)準(zhǔn)品配制

鹽酸溶液（1∶1）：量取250 mL濃鹽酸，與250 mL水混勻配得。

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制：分別稱取山梨酸、苯甲酸、對(duì)羥基苯甲酸甲酯、對(duì)羥基苯甲酸乙酯、對(duì)羥基苯甲酸丙酯和對(duì)羥基苯甲酸丁酯各0.05 g，精確到0.000 1 g，用乙酸乙酯溶解后定容至50 mL，混勻后此時(shí)得1 000 μg/mL的混標(biāo)溶液。

標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的配制：分別準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.25 mL、0.50 mL、1.25 mL、2.50 mL、5.00 mL 于 5個(gè)25 mL容量瓶，用乙酸乙酯稀釋至刻度，得到濃度分別為10 μg/mL、20 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL 和 200 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)混合工作液。

1.2.2 樣品前處理

取均勻的醬油樣品5 g（精確到0.001 g），置于50 mL比色管，加入2 mL 1∶1鹽酸溶液，渦旋1 min，再準(zhǔn)確加入10 mL乙酸乙酯，渦旋3 min。在6 000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心3 min，取上清液過(guò)0.22 μm的有機(jī)濾膜，供氣相色譜分析。

1.2.3 氣相色譜條件

色譜柱：HP-5（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；進(jìn)樣口：溫度240 ℃；進(jìn)樣體積1 μL，分流進(jìn)樣，分流比10∶1，柱流量為1.0 mL/min。柱溫升溫程序：初溫80 ℃保持1 min，以15 ℃/min的速率升到210 ℃，再以20 ℃/min的速率升到240 ℃，保留4 min。氫火焰離子化檢測(cè)器（FID）：溫度280 ℃，氫氣40 mL/min，空氣350 mL/min；載氣：高純氮?dú)?；尾?0 mL/min。

2 結(jié)果與分析

2.1 目標(biāo)化合物的提取溶劑

按照1.2.2的前處理方法，分別選擇乙腈、乙酸乙酯、乙醚、甲醇作為提取溶劑，考慮到6種防腐劑能溶于有機(jī)溶劑，而且樣品中的雜質(zhì)成分不容易被有機(jī)溶劑提取出來(lái)，因此本方法選用這4種溶劑作為考察對(duì)象。結(jié)果表明，乙醚回收率在60%～70%，由于乙醚的沸點(diǎn)較低，提取時(shí)易揮發(fā)，導(dǎo)致回收率不理想。而甲醇與醬油中的水分會(huì)有一定程度的混溶，不易與水相分層，不考慮選用。乙腈和乙酸乙酯提取效果相近，能滿足6種防腐劑的回收率要求?？紤]到乙腈的毒性比乙酸乙酯大，最終選用乙酸乙酯作為理想的提取溶劑。

2.2 色譜柱的選擇

本方法對(duì)2種不同類型的柱子對(duì)6種防腐劑在分離度、響應(yīng)和峰形的方面進(jìn)行評(píng)估比較，用于探究適合該方法檢測(cè)的色譜柱。柱子分別選用HP-5（30 m×0.25 mm×0.25 μm）和HP-1（30 m×0.25 mm×0.25 μm），依照 1.2.3的儀器條件，配置一個(gè)濃度為100 μg/mL的混標(biāo)標(biāo)點(diǎn)，分別用上述兩條柱子上機(jī)檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這兩條柱子都能將6種防腐劑實(shí)現(xiàn)分離；各防腐劑在HP-5柱的響應(yīng)值普遍比在HP-1的高12%；峰形方面，選用HP-1柱的峰形會(huì)出現(xiàn)目標(biāo)峰拖尾的現(xiàn)象，尤其是山梨酸和苯甲酸。HP-5柱得到的目標(biāo)化合物峰形對(duì)稱，基線平穩(wěn)。綜上，決定選用HP-5作為色譜柱進(jìn)行測(cè)定。所得到的6種防腐劑色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 6種防腐劑的氣相色譜圖

2.3 方法的線性范圍及檢出限

以化合物峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，濃度（X）為橫坐標(biāo)，繪制6種防腐劑的標(biāo)準(zhǔn)曲線。其線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)如表1所示。結(jié)果表明，6種防腐劑在10～200 μg/mL的范圍線性關(guān)系良好，線性系數(shù)均在0.999以上；逐級(jí)稀釋標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，以信噪比S/N=3時(shí)的濃度為本方法的檢出限，各防腐劑的檢出限同見(jiàn)表1，均為1 μg/mL。

表1 防腐劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性系數(shù)和檢出限

2.4 樣品加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)和重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

稱取從市場(chǎng)購(gòu)買的醬油樣品，在樣品中分別添加低、中、高3個(gè)梯度濃度水平，以探究6種防腐劑的加標(biāo)回收率，結(jié)果見(jiàn)表2；在同一添加水平下對(duì)樣品進(jìn)行6次平行測(cè)試實(shí)驗(yàn)，探究該方法的精密度情況，如表3所示。6種防腐劑的加標(biāo)回收率在95.7%～102%，RSD為1.3%～3.0%，說(shuō)明該方法的加標(biāo)回收率和精密度良好。

表2 不同添加濃度下6種防腐劑的回收率

表3 精密度實(shí)驗(yàn)（n=6）

2.5 實(shí)際樣品的測(cè)定結(jié)果

從市面上購(gòu)買不同廠家不同等級(jí)的醬油，覆蓋4個(gè)等級(jí)，每個(gè)等級(jí)2個(gè)樣品，共8批樣品，用1.2中方法對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)定，具體測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4，可知不同等級(jí)的醬油各項(xiàng)防腐劑使用量均符合GB 2760—2014的限量規(guī)定，使用總量都在 0.3～ 0.6 g/kg。

表4 不同樣品在同方法下的測(cè)定值（單位：g/kg）

3 結(jié)論

山梨酸、苯甲酸、對(duì)羥基苯甲酸酯類是醬油最常添加的幾類防腐劑。本方法采用氣相色譜儀分析，對(duì)前處理、色譜柱方面進(jìn)行優(yōu)化，解決了標(biāo)準(zhǔn)方法前處理步驟繁瑣，成本高的問(wèn)題，本方法同時(shí)測(cè)定山梨酸、苯甲酸和4種對(duì)羥基苯甲酸酯類，無(wú)需兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)方法分別測(cè)定，節(jié)約了成本和時(shí)間。不僅可以將6種防腐劑實(shí)現(xiàn)分離，而且分析時(shí)間短，實(shí)驗(yàn)過(guò)程簡(jiǎn)便快捷，檢出限低，回收率、精密度、準(zhǔn)確度好，能滿足實(shí)驗(yàn)室的檢驗(yàn)要求，為醬油中防腐劑的測(cè)定提供了一個(gè)高效的測(cè)定方法。