宋利沙，蔣 妮，張占江，藍(lán)祖栽，白隆華

(廣西壯族自治區(qū)藥用植物園，廣西 南寧 530023)

【研究意義】腫節(jié)風(fēng)(Sarcandraglabra)為金粟蘭科草珊瑚屬多年生草本植物草珊瑚[S.glabra(Thunb.)]的干燥全草，具有活血消斑、清熱涼血、祛風(fēng)通絡(luò)等功效，是中國藥典的收錄品種[1-2]，也是廣西傳統(tǒng)瑤藥“七十二風(fēng)”中的重要風(fēng)藥品種之一[3]。近年來，腫節(jié)風(fēng)在廣西融安、靖西、東蘭等縣市大面積種植，從苗期到成株期均出現(xiàn)由半知菌類刺盤孢屬黑線炭疽菌(Colletotrichumdematium)引起的葉部病害，平均發(fā)生率在50%以上，尤其在融安的林下套種模式下發(fā)病率達(dá)65%[4]。目前，腫節(jié)風(fēng)炭疽病的防治以化學(xué)藥劑為主，但長期使用化學(xué)藥劑容易產(chǎn)生病原菌抗(耐)藥、病害易復(fù)發(fā)及農(nóng)藥殘留等負(fù)面問題[5]。世界上50%的生物活性化合物由放線菌產(chǎn)生，尤其是鏈霉菌產(chǎn)生的多抗霉素、井崗霉素和阿維菌素等抗生素已成為實(shí)際利用的次級(jí)代謝產(chǎn)物[6-8]，并已在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用，但至今利用放線菌防治腫節(jié)風(fēng)炭疽病的研究尚屬空白。因此，篩選拮抗腫節(jié)風(fēng)炭疽病病原菌的放線菌，對(duì)腫節(jié)風(fēng)炭疽病的生物防治具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】鏈霉菌存在于不同類型的土壤和水中，資源豐富，能產(chǎn)生多種抗菌活性的抗生素，已在生物防治上廣泛應(yīng)用[9-10]。牛紅杰等[11]研究顯示，從黃瓜根際土壤分離得到的小鏈霉菌對(duì)黃瓜枯萎病病菌(尖孢鐮刀菌、茄腐鐮刀菌和立枯絲核菌)具有一定的抑制作用。劉琴等[12]研究表明，徹氏鏈霉菌100倍液灌根對(duì)番茄枯萎病的防治效果最佳，達(dá)72.84%。涂璇等[13]、申哲等[14]研究發(fā)現(xiàn)，淡紫灰鏈霉菌對(duì)番茄早疫病菌和灰霉病菌、柑桔炭疽病菌、黃瓜炭疽病菌、玉米彎孢病菌、小麥赤霉病菌、棉花枯萎病菌、辣椒疫病菌、小麥紋枯病菌、棉花立枯病菌、油菜菌核病菌及蘋果樹腐爛病菌等多種植物病原菌均有很強(qiáng)的拮抗作用，具有潛在生防價(jià)值。Dame等[15]研究發(fā)現(xiàn)，從海洋放線菌中分離獲得的4種抗生素(寡霉素a和b、巴馬霉素和棘孢鏈菌素)可抑制葡萄霜霉病病菌(Plasmoparaviticola)孢子游動(dòng)，使其細(xì)胞壁溶解，達(dá)到防治葡萄霜霉病的目的。Sellem等[16]研究認(rèn)為，鏈霉菌發(fā)酵提取物可使腐霉菌(Pythiumultimo)菌絲生長受到抑制及卵孢子畸形扭曲。Phuakjaiphaeo等[17]研究表明，從積雪草(Centellaasiatica)根節(jié)分離得到1株內(nèi)生鏈霉菌，其代謝產(chǎn)生的化合物可導(dǎo)致甘藍(lán)黑斑病菌(Alternariabrassicicola)分生孢子畸形、附著胞不能形成及孢子萌發(fā)延遲。Shrivastava等[18]研究顯示，印度恒河平原土壤中分離得到的嗜鹽放線菌(K20)產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶可溶解菜豆殼球孢菌(Macrophominaphaseolina)的菌絲細(xì)胞壁，從而發(fā)揮明顯的拮抗作用?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】利用生防菌防治植物病害已成為植物病害防治的重要方法之一及國內(nèi)外研究熱點(diǎn)，也是未來綠色中藥材發(fā)展的趨勢，但目前關(guān)于篩選拮抗腫節(jié)風(fēng)炭疽病病原菌放線菌的研究鮮見報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】從健康腫節(jié)風(fēng)植株根系土壤中篩選拮抗腫節(jié)風(fēng)炭疽病病原菌的放線菌菌株，分析確定其分類地位，采用離體葉片刺傷接種法測定所篩選獲得拮抗菌株對(duì)腫節(jié)風(fēng)炭疽病的防效，以期為腫節(jié)風(fēng)炭疽病的生物防治提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

腫節(jié)風(fēng)炭疽病菌(編號(hào)Z1)由廣西壯族自治區(qū)藥用植物園實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定和保存；土壤樣品采自廣西靖西市五嶺林場腫節(jié)風(fēng)健康植株根系土壤。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 無菌發(fā)酵液制備 腫節(jié)風(fēng)健康植株根系土壤取樣時(shí)采取五點(diǎn)取樣法將整株腫節(jié)風(fēng)挖起，用無菌小毛刷刷取植株根系上的土壤，每5株的根系土壤均勻混合為一個(gè)樣品(200 g)，重復(fù)3次，共計(jì)15株，編號(hào)后封存于保鮮袋中帶回實(shí)驗(yàn)室，48 h內(nèi)采用稀釋涂布平板法在高氏一號(hào)培養(yǎng)基上進(jìn)行放線菌分離，并通過平板對(duì)峙試驗(yàn)，計(jì)算分離得到的放線菌對(duì)腫節(jié)風(fēng)炭疽病菌的抑制率，篩選對(duì)黑線炭疽病具有拮抗活性的放線菌[19-22]。將抑制率最高的拮抗菌株用于下一步抑菌譜試驗(yàn)。挑取抑制率最高的拮抗菌株(JT-2F菌株)單菌落接種于不加瓊脂的高氏一號(hào)培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min恒溫振蕩3 d，得到拮抗菌株的發(fā)酵液，用無菌紗布和濾紙過濾后，10 000 r/min離心15 min，取上清液，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，得到拮抗菌株的無菌發(fā)酵液。

1.2.2 JT-2F菌株抑菌譜測定 供試藥用植物病害病原真菌三七灰霉病菌(Botrytiscinerea)、三七根腐病菌(Fusariumsolani)、三七黑斑病菌(Alternariapanax)、三七炭疽病菌(Colltetorrichumgloeosporioides)、羅漢果斑枯病菌(Stagonosporopsiscucurbitacearum)、苦玄參葉斑病菌(Alternariaputuminum)、廣西莪術(shù)葉斑病菌(Phomopsissp.)、豆蔻葉斑病菌(Phyllostictasp.)和艾納香褐斑病菌(Phomasp.)均由廣西壯族自治區(qū)藥用植物園實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定、保存；農(nóng)作物病害病原菌西瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporum)、香蕉炭疽病菌(Colltetorrichumgloeosporioides)、香蕉枯萎病菌(Fusariumoxysporum)、香蕉葉斑病菌(Alternariasp.)和煙草灰霉病菌(Botrytiscinerea)均由廣西大學(xué)植病研究室袁高慶教授提供。

選取1.2.1中對(duì)腫節(jié)風(fēng)炭疽病菌防效較佳的放線菌JT-2F和DT-3F菌株，參照程麗娟等[20]、朱宏建等[21]、張瑾等[22]的平板對(duì)峙法對(duì)上述14種植物病原菌進(jìn)行抑菌譜測定。將直徑為0.5 cm的病原菌組織塊置于PDA平板中心，在其兩側(cè)等距離處分別接種JT-2F和DT-3F菌株組織塊，以單獨(dú)接種病原菌為對(duì)照，每處理3個(gè)重復(fù)。待對(duì)照長滿整個(gè)平皿時(shí)，測量菌落直徑并計(jì)算抑制率。抑制率(%)=(對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑)/對(duì)照菌落直徑×100。

1.2.3 JT-2F菌株離體防治試驗(yàn) 參考刺傷接種法進(jìn)行放線菌對(duì)炭疽病菌離體防效試驗(yàn)[23]。選取大小一致的腫節(jié)風(fēng)葉片，先用自來水沖洗干凈，75%酒精表面消毒，無菌水沖洗、晾干后置于超凈工作臺(tái)，再用無菌接種針在葉片上刺傷一個(gè)直徑為6.0 mm的圓形接種面，然后分別在傷口處涂抹(200 μL)稀釋10、20、50、100和200倍JT-2F菌株的無菌發(fā)酵液及原液，最后在傷口處接種直徑7.0 mm的腫節(jié)風(fēng)炭疽病菌菌餅，以涂抹無菌水為對(duì)照，重復(fù)3次。接種5 d后參考薛應(yīng)鈺等[24]的方法測量并記錄病斑面積，采用十字交叉法測量病斑長度，計(jì)算病斑面積及防效。病斑面積=1/4×π×病斑長徑×病斑短徑；防效(%)=(對(duì)照病斑面積-處理病斑面積)/對(duì)照病斑面積×100，選取防效高的JT-2F菌株進(jìn)行抑菌譜測定、形態(tài)鑒定和分子學(xué)鑒定。

1.2.4 JT-2F菌株鑒定 ①形態(tài)鑒定。用劃線法將JT-2F菌株接種至高氏一號(hào)培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)約10 d，觀察菌體的形態(tài)特征[25]。②分子生物學(xué)鑒定。將培養(yǎng)3 d的JT-2F菌株接種至40 mL不加瓊脂的高氏一號(hào)培養(yǎng)基三角瓶(100 mL)中，于28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)48 h后制成菌體懸浮液，離心收集菌體，采用改良的SDS裂解法用DNA提取試劑盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)提取放線菌基因組DNA。采用放線菌通用引物27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')對(duì)提取的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增(由生工生物工程(上海)股份有限公司完成)。反應(yīng)體系25.0 μL：模板DNA(20～50 ng/μL) 0.5 μL，10×Buffer(含Mg2+) 2.5 μL，dNTPs(2.5 mmol/L) 1.0 μL，酶0.2 μL，上、下游引物各0.5 μL，加雙蒸H2O至25.0 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 60 s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增中利用水代替DNA模板為空白對(duì)照。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，陽性產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行純化測序，測序結(jié)果與GenBank的序列進(jìn)行BLAST比對(duì)。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以MEGA 4.0的Neighbor-Joining法構(gòu)建16S rDNA相似序列系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗放線菌的分離與篩選結(jié)果

從腫節(jié)風(fēng)健康植株根系土壤中共分離得到具有拮抗活性的15株放線菌，其中，3株對(duì)腫節(jié)風(fēng)炭疽病菌抑制率<60.00%，10株抑制率為60.00%～80.00%，2株抑制率>80.00%(編號(hào)分別為JT-2F和DT-3F，表1)。JT-2F菌株對(duì)腫節(jié)風(fēng)炭疽病菌的抑制率最高，為86.75%，顯著高于其他14株菌株(P<0.05，下同)；DT-3F對(duì)腫節(jié)風(fēng)炭疽病菌的抑制率(80.54%)次之，顯著高于除JT-2F和DT-6F外的其他菌株。與正常的炭疽病菌菌絲(圖1-A)相比，在對(duì)峙培養(yǎng)中腫節(jié)風(fēng)炭疽病病原菌菌絲的生長明顯受到JT-2F菌株抑制(圖1-B)；分別挑取培養(yǎng)7 d的對(duì)照組和處理組黑線炭疽菌菌絲在顯微鏡下觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對(duì)照組的菌絲直且粗細(xì)均勻(圖1-C)，而JT-2F菌株處理組的菌絲體發(fā)生畸變，菌絲纏繞扭曲，部分菌絲顏色變深，菌絲體膨大(圖1-D)。說明JT-2F和DT-3F菌株對(duì)腫節(jié)風(fēng)炭疽病菌有很好的抑菌效果(抑制率均在80.00%以上)。

表1 拮抗放線菌對(duì)腫節(jié)風(fēng)炭疽病菌的抑制效果比較

2.2 拮抗菌株對(duì)腫節(jié)風(fēng)炭疽病菌的離體防效

JT-2F菌株的離體防治試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著發(fā)酵液稀釋倍數(shù)的提高防效相應(yīng)降低(圖2)，發(fā)酵液原液的防治效果達(dá)87.32%，且顯著高于其他處理(表2)；當(dāng)發(fā)酵液稀釋至50倍時(shí)，防治效果下降到54.62%，稀釋至100和200倍時(shí)，防效分別下降至30.08%和25.50%，防治效果不理想。

表2 JT-2F菌株發(fā)酵液對(duì)腫節(jié)風(fēng)炭疽病菌的防治效果

2.3 拮抗放線菌抑菌譜

以JT-2F和DT-3F菌株對(duì)14種植物病原菌進(jìn)行抑菌活性測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)JT-2F菌株的平均抑制率達(dá)81.50%，顯著高于DT-3F菌株的平均抑制率(表3)。其中，JT-2F菌株對(duì)農(nóng)作物病原菌的抑制率均在70.00%以上，尤其對(duì)香蕉炭疽病菌的抑制率最高，達(dá)89.41%，對(duì)西瓜枯萎病菌的抑制率雖較低，但仍達(dá)71.18%；JT-2F菌株對(duì)藥用植物病菌艾納香褐斑病菌的抑制率最高，為87.50%，對(duì)豆蔻葉斑病菌的抑制率較低，但仍達(dá)72.94%，對(duì)其他藥用植物病原菌的抑制率均達(dá)到75.00%以上?？梢姡琂T-2F菌株對(duì)腫節(jié)風(fēng)炭疽病具有較好的生防應(yīng)用前景。

表3 JT-2F和DT-3F菌株對(duì)14種植物病原菌的抑菌譜

2.4 拮抗菌株的鑒定結(jié)果

2.4.1 形態(tài)鑒定結(jié)果 JT-2F菌株在高氏一號(hào)培養(yǎng)基上開始呈白色，后期呈灰色菌落，菌落邊緣呈乳白色表面褶皺，孢子卵圓形。菌絲生長旺盛，顏色為白色。

2.4.2 分子生物學(xué)鑒定結(jié)果 JT-2F菌株用通用引物16S rDNA序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測序，獲得1404 bp核苷酸序列。將該序列與NCBI中GenBank的序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)JT-2F菌株與鏈霉菌屬(Streptomyces)同源性很高，相似度達(dá)100.0%(表4)。采用MEGA 4.0對(duì)JT-2F菌株的16S rDNA序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹構(gòu)建，結(jié)果(圖3)表明，JT-2F菌株與S.tsukiyonensisAB184594菌株序列在系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹上處于同一個(gè)分支，屬津島鏈霉菌(S.tsukiyonensis)。根據(jù)菌株的形態(tài)學(xué)特征及16S rDNA分子鑒定結(jié)果，初步鑒定JT-2F菌株為津島鏈霉菌，序列登錄號(hào)MK368447。

表4 系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析中使用的放線菌菌株序列

3 討 論

鏈霉菌屬是放線菌類群中的最大成員之一，具有抗菌防病功能，且抑菌譜廣，可產(chǎn)生多種抗生素[26]，對(duì)開發(fā)生物農(nóng)藥和生物制劑具有潛在應(yīng)用價(jià)值。已有研究表明，纖維黃鏈霉菌(S.celluloflavus)和S.yatensis對(duì)香蕉枯萎病菌菌絲的抑制率分別達(dá)70.12%和54.46%[27]，婁徹氏鏈霉菌(S.rochei)Lj20對(duì)番茄灰霉病菌具有較強(qiáng)的抑制作用[28]，紫黑鏈霉菌(S.vioiaceoniger)對(duì)山藥炭疽病菌具有較好的拮抗作用[29]，殺黃孢鏈霉菌(S.xanthocidicus)對(duì)白色假絲酵母(Candidaalbicaus)CMCC 98001和恥垢分枝桿菌(MycobacteriumSmegmatis)MC2的抗菌活性較強(qiáng)[30]，新種閘坡鏈霉菌(S.zhapoensis)對(duì)花生青枯菌具有較強(qiáng)的拮抗作用[31]，放線菌S.griseinus對(duì)葡萄白腐病菌具有良好的抑制效果[32]，黃暗色鏈霉菌(S.xanthophaeus)Ac16抑制草莓灰霉病菌能力較強(qiáng)[33]，天藍(lán)鏈霉菌放線菌素變種(S.coeruleofuscusvar.actinomycini)屬于對(duì)常見植物病原菌(黃瓜枯萎病菌、辣椒枯萎病菌、西瓜枯萎病菌、小麥赤霉病菌、玉米小斑病菌、蘋果斑點(diǎn)落葉病菌、番茄早疫病菌和棉花黃萎病菌)有較強(qiáng)抑制活性的放線菌[34]。本研究從健康腫節(jié)風(fēng)根際土壤中分離到1株對(duì)腫節(jié)風(fēng)炭疽病菌具有較強(qiáng)拮抗作用的鏈霉菌菌株JT-2F，對(duì)14種供試病原菌(包括香蕉、煙草和西瓜等5種農(nóng)作物病原真菌及三七、艾納香、豆蔻和廣西莪術(shù)等9種藥用植物的病原真菌)均具較強(qiáng)的拮抗作用；通過形態(tài)學(xué)特性和16S rDNA鑒定，JT-2F菌株屬于津島鏈霉菌；離體防效試驗(yàn)結(jié)果顯示，JT-2F菌株發(fā)酵原液對(duì)離體葉片上腫節(jié)風(fēng)炭疽病的防效達(dá)87.32%。但是關(guān)于津島鏈霉菌在生物防治中的作用機(jī)理、在田間的拮抗效果、對(duì)腫節(jié)風(fēng)生長有無促生作用及如何與生物農(nóng)藥和生物制劑配合使用等仍需進(jìn)一步探究。

鏈霉菌發(fā)酵液能產(chǎn)生多種次級(jí)代謝產(chǎn)物[24]，在生物防治中常采用液體發(fā)酵方式產(chǎn)生拮抗活性物質(zhì)以應(yīng)用于植物病害防治。段學(xué)輝等[35]研究發(fā)現(xiàn)，紫黑吸水鏈霉菌(S.violaceoniger-hygroscopicus)的發(fā)酵液對(duì)辣椒疫霉(Phytophthoracapsici)、番茄灰病菌(B.cinerea)和黃瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporum)具有一定抑制作用。李勇等[36]研究顯示，放線菌YIM31249發(fā)酵液粗提物對(duì)灰霉病菌的最小抑制濃度為0.022 mg/mL，表明發(fā)酵液中具有天然抗菌活性物質(zhì)。榮曉瑩等[37]研究發(fā)表明，灰色鏈霉菌(S.griseus)FQ-017 對(duì)苗期番茄灰霉病的防治效果較佳。本研究將JT-2F菌株在不加瓊脂的培養(yǎng)基中發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)其發(fā)酵液原液可使腫節(jié)風(fēng)炭疽病菌菌絲畸形、膨大，表明JT-2F菌株發(fā)酵液中有抗生類物質(zhì)產(chǎn)生，且發(fā)酵液在一定范圍內(nèi)對(duì)腫節(jié)風(fēng)炭疽病菌菌絲生長的抑制效果隨稀釋倍數(shù)增大而減弱，與已報(bào)道的焊灰直絲鏈霉菌(S.chungwhensis)和紫色鏈霉菌(S.spurpureus)的抑菌效果相似[38-39]。

本研究僅將不加瓊脂的放線菌培養(yǎng)液發(fā)酵后應(yīng)用于腫節(jié)風(fēng)炭疽病菌拮抗試驗(yàn)，在今后的研究中還應(yīng)通過單因素和正交試驗(yàn)進(jìn)行鏈霉菌發(fā)酵條件優(yōu)化，以期得到最優(yōu)培養(yǎng)條件用于后期推廣應(yīng)用。

4 結(jié) 論

JT-2F菌株對(duì)腫節(jié)風(fēng)炭疽病菌具有較強(qiáng)的拮抗作用，可使炭疽病菌菌絲膨大、畸變和扭曲，抑制率達(dá)86.75%，且對(duì)14種病原真菌也具有較強(qiáng)的拮抗作用，平均抑制率達(dá)81.50%；其發(fā)酵原液對(duì)腫節(jié)風(fēng)離體葉片上腫節(jié)風(fēng)炭疽病的防效達(dá)87.32%。因此，JT-2F菌株用作腫節(jié)風(fēng)炭疽病菌的生物防治材料具有較大開發(fā)和應(yīng)用潛力。