余緒明，余世榮，石金敏，龔杰，王佳

[十堰市人民醫(yī)院(湖北醫(yī)藥學院附屬人民醫(yī)院)藥學部，十堰 442000]

核受體NR4A1 ( nuclear receptor subfamily 4 group A member 1，也稱為Nur77)是孤兒核NR4A亞家族重要成員之一，可被多種復雜的細胞信號所誘導，作為分子開關在基因的表達調(diào)控中發(fā)揮重要作用，主要參與代謝、免疫調(diào)控、細胞應激、記憶、胰島素敏感性和心臟穩(wěn)態(tài)的調(diào)控等。NR4A1主要在腦組織中表達[1]。NR4A1與炎癥的關系緊密。DIATCHENKO等[2]報道，NR4A1是單核細胞內(nèi)核因子-κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)信號通路中最強的抑制基因之一。LI等[3]研究揭示Nur77是NF-κB介導的炎癥反應中的重要制動因素。Nur77敲除的小鼠對細菌脂多糖易感，且Nur77可通過阻斷p65與其κB元件的結合從而抑制NF-κB的活性，進而抑制促炎細胞因子的產(chǎn)生。研究表明，激活的小膠質(zhì)細胞內(nèi)Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)信號通路介導了脂多糖抑制Nur77的表達，特殊的TLR4拮抗劑CLI-095可以抑制BV2細胞內(nèi)Nur77的下調(diào)作用[4]。然而，脂多糖誘導的TLR4信號通路中Nur77下調(diào)的具體分子機制仍未闡明。

芳烴受體(aryl hydrocarbon receptor，AhR)屬于螺旋-環(huán)-螺旋/Per-Arnt-Sim同源超家族(basic helix-loop-helix/Per-Arnt-Sim homology superfamily)成員之一，是一種在脊椎動物細胞中廣泛表達的配體依賴性轉錄因子[5]。其激活后，AhR與芳烴受體核轉位蛋白(aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator，ARNT)一起進入細胞核參與其靶基因表達的調(diào)控。AhR的生物學功能包括化學和微生物防御，器官發(fā)育，免疫和炎癥的調(diào)節(jié)，繁殖和NAD+依賴的能量代謝等[6]。WANG等[7]和ZHOU[8]報道了配體依賴的AhR的激活抑制了腸道炎癥反應。AhR -配體軸在各種類型的炎癥反應[9]和骨穩(wěn)態(tài)[10]中發(fā)揮關鍵作用。目前研究聚焦在尋找人源AhR的靶基因以及與之串聯(lián)的轉錄因子[6]。NR4A1是否是AhR的下游靶基因，二者之間是否存在串聯(lián)以及是否參與了脂多糖誘導的TLR4信號通路中Nur77的下調(diào)過程，筆者尚未檢索到國內(nèi)外相關報道。

本研究對體外神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞系U251細胞給予外源性脂多糖，構建炎癥細胞模型，探究AhR是否參與了脂多糖誘導的TLR4信號通路中Nur77的下調(diào)過程，及其可能的分子機制。

1 材料與方法

1.1材料 胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS，杭州四季青生物公司，批號：2104)；達爾伯克高糖培養(yǎng)基(Dulbecco's minimum essential medium，DMEM)(Thermofisher公司，美國，批號： 10569044)；青鏈霉素溶液(Thermofisher公司，美國，批號： 15140122)；opti-MEM培養(yǎng)基(Gibco公司，美國，批號：31985-070)；脂質(zhì)體 (Invitrogen公司，美國，批號：11668-027)；裂解液(Invitrogen公司，美國，批號：15596018)；脂多糖 (Invitrogen公司，美國，批號： 00-4976-93)；TLR4抑制劑CLI-095(InvivoGen公司，美國，批號：tlrl-cli95)；髓樣分化因子抑制劑ST 2825(Medchem Express，公司，美國，批號：HY-50937)；DH5α感受態(tài)(Tianfen公司，批號：CB101)；酵母提取物(Invitrogen公司，美國，批號： 18180059)；蛋白胨(Invitrogen公司，美國，批號：LP0043B)；氨芐西林鈉(Amresco公司，批號：0339)；T4DNA連接酶( Invitrogen公司，美國，批號： IVGN2104)、快速限制性內(nèi)切酶XhoI( Thermo Scientific公司，美國，批號：FD0694)和快速限制性內(nèi)切酶HindIII( Thermo Scientific公司，美國，批號：FD0504)；空載pDONR223質(zhì)粒(湖南優(yōu)寶生物公司提供)，人源AhR(湖南優(yōu)寶生物公司，批號： G119772)和人源ANRT(湖南優(yōu)寶生物公司，批號：G116155)cDNA克隆質(zhì)粒；pGL4.11[luc2P]質(zhì)粒(湖南優(yōu)寶生物公司，批號： VT1728 )；DNA 梯度條帶( 碧云天生物公司，批號：D0107)；瓊脂糖(Sigma公司，美國，批號：A9539)；染料法熒光定量試劑盒(TAKARA，批號：DRR041A)；高保真預混液(I-5TM2X High Fidelity Master Mix)(Molecular Cloning Laboratones，批號：I5HM-200)；cDNA合成預混液( Biotool公司，美國，批號：B24403)；雙熒光素酶分析試劑盒(Promega公司，美國，批號：E1910，Lot.220597)；GoldViewⅡ型核酸染色劑(5000×)(Solarbio，批號： G8142 )；膠回收試劑盒( BiomiGA，批號：122131-2)；AxyPrep質(zhì)粒DNA小劑量試劑盒(AxyGEN，批號： AP-MN-P-4)；染色質(zhì)免疫共沉淀試劑盒(Epigentek公司，美國，批號： P-2002-2)；ChIP級單克隆小鼠抗人AhR抗體 (RPT9，Invitrogen公司，美國，批號： MA1-513)； 人膠質(zhì)瘤細胞系U251細胞和人腎上皮細胞系293T細胞(武漢大學基礎醫(yī)學院樂江教授實驗室)。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) U251和293T細胞置于DMEM(含10% FBS，1% 雙抗)的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為37 ℃、5%二氧化碳( CO2)培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)。6孔板內(nèi)細胞密度約為70%時，將完全培養(yǎng)基棄去，PBS沖洗1或2次，更換無血清培養(yǎng)基根據(jù)具體實驗目的加藥處理，繼續(xù)培養(yǎng)至24 h。

1.2.2TLR4 -MyD88抑制性實驗 采用二甲亞砜(DMSO)分別將CLI-095、ST 2825和脂多糖稀釋成1，20 μmol·L-1和1，0.1 μg·mL-1。U251細胞于6孔板中培養(yǎng)，分別給予不同劑量脂多糖(1，0.1 μg ·mL-1)處理24 h。U251細胞給藥分組：對照組(DMSO)、脂多糖組、CLI-095組、CLI-095+脂多糖組、ST 2825組、ST 2825+脂多糖組。其中CLI-095+脂多糖組和ST 2825+脂多糖組中，CLI-095和ST 2825先分別預處理1 h后添加脂多糖(1 μg·mL-1)，連續(xù)培養(yǎng)至24 h，每組設3個復孔[11]。

1.2.3實時熒光定量聚合酶鏈反應(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)檢測 采用Trizol抽提U251細胞總RNA，Nano drop測定其濃度。加入All-in-one cDNA Synthesis SuperMix按如下條件進行RT-PCR擴增得到cDNA樣本，25 ℃，10 min；42 ℃，30 min；85 ℃，5 min。擴增基因，人源NR4A1上游引物GGCTCGGG-GATACTGGATACA，下游引物CTGGCATGAAGCGT-TGTCC；人源AHR上游CAAATCCTTCCAAGCGGCATA，下游引物CGCTGAGCCTAAGAACTGAAAG；人源ARNT上游CTGCCAACCCCGAAATGACAT，下游引物CGCCGC-TTAATAGCCCTCTG；人源GAPDH上游引物CATCACCATCTTCCAGGAGCGAGA，下游引物TGCAGG-AGGCATTGCTGATGATCT；擴增體系為：樣本cDNA 2 μL，熒光染料混合液(SYBR mix)5 μL，正向引物0.3 μL，反向引物0.3 μL，焦碳酸二乙酯處理的超純水2.4 μL；反應條件為95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個循環(huán)。

1.2.4質(zhì)粒構建 ENSEMBL(http：//asia.ensembl.org/index.html)網(wǎng)站上尋找人源NR4A1啟動子片段(距離ATG為0～-2000 bp，NR4A1-003 ENST00000545748.5)。根據(jù)生物信息學方法以及網(wǎng)站(http：//tfbind.hgc.jp)預測NR4A1啟動子上AhR/ARNT的結合位點。依據(jù)評分，最大分值并包含AhR / ARNT位點的片段序列547 bp(距離ATG為-1606 ～-1590 bp)插入到pGL4.11[luc2P]載體中，構建NR4A1啟動子片段的Luc-報告質(zhì)粒(NR4A1 -pGL4.11[luc2P])。構建的上游引物： CCGCTCGAGTTATGTAACCGGGTGTGCCGG(限制性內(nèi)切酶為XhoI)；下游引物：CCCAAGCTTAAAGGCATCC-ACCGAAGAGGG(限制性內(nèi)切酶為HindIII)。

1.2.5瞬時共轉染實驗 U251細胞于6孔板中培養(yǎng)，實驗分組：空載組和AhR/ANRT表達組。采用Lipofectamine 2000轉染試劑盒進行操作，轉染體系為質(zhì)粒DNA濃度1 μg ： 脂質(zhì)體2000 3 μL，分別用 opti-MEI 250 μL優(yōu)化培養(yǎng)稀釋并配置成混合液，室溫孵育放置10～20 min，加入無血清培養(yǎng)基的6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.2.6雙熒光素酶報告(dual-luciferase reporter)分析實驗 293T細胞培養(yǎng)于6孔板，實驗分為對照組和轉染組。對照組轉染空載pDONR223質(zhì)粒+NR4A1-pGL4.11[luc2P]報告質(zhì)粒，轉染組為AhR -pDONR223表達質(zhì)粒+ARNT-pDONR223表達質(zhì)粒+NR4A1-pGL4.11[luc2P]報告質(zhì)粒。按照Lipofectamine2000轉染試劑盒和雙熒光素酶報告實驗試劑盒說明操作，每組平行設3個復孔，ModulusTM單管型多功能檢測儀測定熒光強度，計算相對熒光強度。

1.2.7染色質(zhì)免疫共沉淀(chromatin immuno-precipitation，ChIP)分析 實驗分組：對照組(DMSO)和脂多糖(1 μg·mL-1)組。按照染色質(zhì)免疫共沉淀試劑盒提供的方法進行操作。調(diào)整每皿U251細胞密度為(2×106) ～( 2×107)個·mL-1，按上述分組分別處理，細胞計數(shù)，1%甲醛固定，室溫孵育10 min。加入1.25 mol·L-1甘氨酸1 mL終止交聯(lián)。超聲破碎，將DNA打碎成500～1000 bp的片段。測定染色質(zhì)濃度，將約10%的染色質(zhì)預留作為裂解液處理。10 μg的ChIP級單克隆小鼠抗人AhR抗體和使用正常的小鼠IgG(ChIp試劑盒提供，Epigentek公司，美國)作為陰性對照?；厥彰庖叱恋淼腄NA，使用PCR純化試劑盒純化，使用qRT-PCR擴增裂解液樣本中的DNA以及從沉淀復合物中分離得到的DNA。擴增產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠上分離，使用Auto Chemi成像系統(tǒng)對條帶強度進行定量分析。

2 結果

2.1脂多糖對NR4A1和AhR表達的影響 U251細胞給予不同濃度脂多糖(1和0.1 μg·mL-1)處理24 h。與對照組比較，脂多糖劑量依賴性下調(diào)NR4A1和AhR的表達，脂多糖1 μg·mL-1組分別下調(diào)56%，32%；脂多糖0.1 μg·mL-1組分別下調(diào)38%，19%，見表1。

表1 脂多糖對U251細胞中NR4A1和AhR表達水平的影響

2.2TLR4-MyD88通路介導脂多糖下調(diào)AhR和NR4A1的表達 U251細胞采用脂多糖(1 μg·mL-1)處理24 h后，qRT-PCR結果顯示，與對照組比較，脂多糖顯著下調(diào)了NR4A1和AhR mRNA水平，分別下降了53.78%(t=13.15，P<0.01 )和42.96%(t=8.062，P<0.01)。TLR4特殊的抑制劑CLI-095(1 μmol·L-1)和MyD88拮抗劑ST 2825(20 μmol·L-1)分別預處理1 h，接著給予脂多糖(1 μg·mL-1)處理至24 h。單用CLI-095組和單用ST 2825組與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義，表明二者均不影響NR4A1和AhR mRNA的表達水平。與單用脂多糖組比較，CLI-095+脂多糖組和ST 2825+脂多糖組NR4A1和AhR mRNA水平的下調(diào)作用顯著被逆轉，且CLI-095的逆轉作用更明顯(t=7.467，P<0.01)，ST 2825部分逆轉了其表達的下調(diào)(t=5.485，P<0.05)。提示，在U251細胞內(nèi)脂多糖下調(diào)AhR和NR4A1的表達可能通過TLR4 -MyD88通路實現(xiàn)，見圖1。

A.對照組；B.脂多糖組；C.CLI-095組；D.CLI-095+脂多糖組；E.ST 2825組；F.ST 2825+脂多糖組。①與對照組比較，P<0.01；②與脂多糖組比較，P<0.01；③與對照組比較，P<0.05。

2.3NR4A1作為AhR的下游靶基因，其表達受到AhR的調(diào)控 U251細胞瞬時轉染人源的AhR / ANRT表達質(zhì)粒。qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，轉染組AhR和ARNT表達分別上調(diào)了106.63倍和165.23倍，提示U251細胞成功轉入AhR / ANRT表達質(zhì)粒。qRT-PCR檢測NR4A1的表達，與對照組比較，NR4A1 mRNA水平上調(diào)至2.63倍(t=7.384，P<0.01)，提示AHR作為轉錄因子調(diào)控了下游靶基因NR4A1的表達。

2.4AhR結合到NR4A1啟動子區(qū)域，在轉錄水平上調(diào)控其表達 將預測包含AhR/ARNT結合位點的NR4A1啟動子片段(-1606～-1590 bp)構建入pGL4.11[luc2P]質(zhì)粒中，經(jīng)基因測序，成功構建NR4A1啟動子的luc-報告質(zhì)粒。293T細胞內(nèi)瞬時共轉染實驗，與對照組比較，轉染組熒光強度明顯增加，上調(diào)至19.08倍(t=52.42，P<0.01)，提示AhR與ARNT形成異源二聚體，并結合到NR4A1啟動子區(qū)域，在轉錄水平上調(diào)控其表達。

2.5脂多糖抑制了AhR蛋白與NR4A1啟動子位點的結合 ChIP分析結果顯示，與對照組比較，脂多糖顯著抑制了AhR蛋白與NR4A1啟動子位點的結合，下調(diào)32.7%(t=5.621，P<0.05)，見圖2。

①與對照組比較，P<0.05。

3 討論

本實驗研究發(fā)現(xiàn)U251細胞內(nèi)，脂多糖呈劑量依賴性下調(diào)NR4A1和AhR的表達。TLR4-MyD88信號通路介導了脂多糖抑制AhR和NR4A1的表達；此外，U251細胞高表達AhR和ARNT，同時NR4A1的表達明顯上調(diào)，提示NR4A1是AhR的下游靶基因；熒光素酶分析結果提示，AhR和ARNT形成異源二聚體結合在NR4A1啟動子結合位點，在轉錄水平上調(diào)控其表達。ChIP分析結果表明，在U251細胞內(nèi)脂多糖抑制了AhR蛋白與NR4A1啟動子位點的結合。由此推論，脂多糖通過U251細胞內(nèi)的TLR4-MyD88信號通路抑制了AhR的表達，進而在轉錄水平上減少了AhR和ARNT異源二聚體在下游靶基因NR4A1啟動子上的結合，從而抑制其表達。

近年來的諸多研究表明，神經(jīng)炎癥是神經(jīng)退行性疾病發(fā)生的重要機制之一[12-20]。核受體作為神經(jīng)退行性疾病治療潛在的靶標，在過去的十多年里受到了極大的關注。大量的文獻報道了小鼠神經(jīng)退行性疾病模型以及一些臨床試驗證實了核受體在不同神經(jīng)退行性疾病中發(fā)揮重要作用[21]。有關NR4A1與神經(jīng)炎癥以及帕金森病(Parkinson’s disease，PD)之間關系的報道也較多。在正常條件下，腦內(nèi)的NR4A1主要在多巴胺能神經(jīng)元的靶區(qū)內(nèi)表達，如紋狀體的復合區(qū)和前額葉皮質(zhì)，然而在成年大鼠腦黑質(zhì)以及腹側被蓋區(qū)域(ventral cover area，VTA)內(nèi)NR4A1則呈現(xiàn)低水平表達[22]。ROTHE等[23]報道了NR4A1作為小膠質(zhì)細胞活化的調(diào)制子，成為自身免疫性中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥的潛在治療靶標。MONTAROLO等[24]報道，與健康志愿者比較，PD患者外周血內(nèi)整個NR4A亞家族基因(NR4A1、NR4A2和NR4A3)的表達呈現(xiàn)顯著下調(diào)。此外，研究顯示小膠質(zhì)細胞內(nèi)Nur77的活化衰減了促炎介質(zhì)的產(chǎn)生以及保護了多巴胺能神經(jīng)元免受炎癥誘導的細胞損傷。體外脂多糖激活的小膠質(zhì)細胞內(nèi)以及1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine，MPTP)誘導的小鼠PD模型中Nur77的表達下調(diào)[4]。因此，可以大膽假設NR4A1作為炎癥的一個負向調(diào)控子在神經(jīng)炎癥誘導的神經(jīng)退行性疾病(如PD)中發(fā)揮關鍵保護作用，其可能是PD治療新的潛在分子靶標。

本實驗探討了U251細胞內(nèi)脂多糖抑制NR4A1表達的可能的分子機制，為進一步探究NR4A1的生物學功能，闡明其與炎癥的關系，進而為炎癥誘導的神經(jīng)退行性疾病、腫瘤、代謝性疾病等病理過程的逆轉提供參考，同時為尋找針對PD的靶標開發(fā)治療藥物提供實驗依據(jù)。此外，實驗還證實了NR4A1是AhR的下游靶基因，這對于遴選人源AhR的靶基因以及細胞內(nèi)串聯(lián)的轉錄因子至關重要。NR4A1是否像AhR緊密耦聯(lián)的轉錄因子靶基因AHRR(aryl hydrocarbon receptor repressor)和核因子Nrf2(nuclear factor，erythroid 2 like 2，NFE2L2)一樣發(fā)揮AhR依賴的生物學功能[25-28]，仍需進一步探討。然而，實驗僅從mRNA水平上進行了考察，缺乏蛋白水平的證據(jù)。課題組將進一步在U251細胞內(nèi)從蛋白水平探究這一論斷，并且在U251細胞內(nèi)敲高NR4A1，以便探究NR4A1的生物學功能，諸如是否抗炎、抗線粒體氧化應激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，以及是否參與脂質(zhì)代謝相關基因表達的調(diào)控等。同時，脂多糖誘導的在體PD模型中通過慢病毒包裝NR4A1質(zhì)粒，使其感染黑質(zhì)-紋狀體區(qū)域，并使NR4A1呈現(xiàn)高水平表達，以探究NR4A1的抗PD作用。