陳相穎，李夢瑋，王穎，陳權(quán)，徐寒梅

綜 述

小開放閱讀框編碼微肽的研究進(jìn)展

陳相穎，李夢瑋，王穎，陳權(quán)，徐寒梅

中國藥科大學(xué)江蘇省合成多肽藥物發(fā)現(xiàn)與評價工程中心，南京 211198

已有的研究表明，生命體中存在著大量的非編碼RNA (non-coding RNA, ncRNA)，先前被錯誤注釋為ncRNA的分子序列中實際上包含小的開放閱讀框(short open reading frame, sORF)，部分sORF可轉(zhuǎn)錄并翻譯成進(jìn)化保守的微肽(micropeptide)，這些sORF由于序列較短和研究技術(shù)手段的限制而被忽略。迄今為止，已在生命體中發(fā)現(xiàn)一些sORF編碼的功能各異的微肽，它們對生命活動的調(diào)控起著重要作用。本文對近年來發(fā)現(xiàn)的功能性微肽進(jìn)行綜述，介紹了本課題組發(fā)現(xiàn)新型微肽MIAC (micropeptide inhibiting actin cytoskeleton)的過程，同時總結(jié)了研究潛在微肽的相關(guān)技術(shù)，以期為研究人員利用相關(guān)技術(shù)發(fā)現(xiàn)新微肽提供借鑒和參考。

非編碼RNA；小開放閱讀框；微肽

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人們對于生物復(fù)雜性有了更進(jìn)一步的認(rèn)識。中心法則指出，遺傳信息通常經(jīng)歷由脫氧核苷酸轉(zhuǎn)錄到核糖核苷酸再翻譯為蛋白質(zhì)的過程[1]。人類基因組計劃證明，人類基因組的3/4能夠被轉(zhuǎn)錄，但只有約1.5%的基因具有編碼蛋白的能力[2]。這就引發(fā)了人們對基因組中剩余的大量非蛋白編碼基因的思考，這些非蛋白編碼基因是否包含更多的遺傳信息。DNA元件百科全書(ency-clopedia of DNA elements, ENCODE)的數(shù)據(jù)表明，80%的基因具有特定的生物學(xué)功能，而大部分基因處于非蛋白質(zhì)編碼區(qū)域，這部分基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生大量的ncRNA[3]。隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，越來越多的實驗證明ncRNA分子序列上含有小的開放閱讀框序列(short open reading frame, sORF)，可編碼小于100個氨基酸的微小蛋白，被人們稱為微肽(micropeptide)，加工修飾后的微肽可通過與其他蛋白相互作用而發(fā)揮其生理或病生理的作用[4]。研究表明，包括果蠅()、小鼠()、人()在內(nèi)的許多動物基因組中包含數(shù)百萬個sORF，其中一些具有關(guān)鍵的生理或病生理功能，如鈣離子穩(wěn)態(tài)、代謝、成肌細(xì)胞融合和肌肉發(fā)育、胚胎發(fā)育、物質(zhì)降解、癌癥等[5～24]。本文主要介紹了近年來發(fā)現(xiàn)的功能性微肽、本課題組發(fā)現(xiàn)新型微肽MIAC (micropeptide inhibiting actin cytoskeleton)的過程以及研究潛在微肽的技術(shù)，期望為進(jìn)行相關(guān)微肽研究的科研人員提供新思路。

1 sORF和微肽簡介

開放閱讀框(open reading frame, ORF)最初被定義為起始密碼子與終止密碼子間的潛在翻譯序列[25]。可翻譯的ORF通常是指mRNA上的編碼序列(coding sequences, CDS)，該序列翻譯產(chǎn)生具有生物學(xué)功能的蛋白質(zhì)[26]。由于ORF編碼蛋白質(zhì)的可能性隨著其長度的增加而增加，查找ORF的算法大多都以300個密碼子或100個氨基酸為閾值作為最短的檢測長度[27]。sORF在序列長度上區(qū)別于ORF，理論上sORF的大小可以從最低限制的2個密碼子到100個密碼子，sORF由于其極短的長度在最初被認(rèn)為是非編碼的[28]。最近研究發(fā)現(xiàn)，真核基因組中存在數(shù)百萬個sORF序列，并且有些sORF序列可以定位到轉(zhuǎn)錄本，這部分sORF具有編碼并翻譯產(chǎn)生蛋白的能力[28,29]。因此，微肽被定義為長度小于100個氨基酸的蛋白質(zhì)。

根據(jù)果蠅和哺乳動物中sORF的位置、大小、保守性和翻譯方式等特性，sORF可分為五類(圖1)：基因間ORF (intergenic ORF)、上游ORF (upstream ORF, uORF)、長非編碼ORF (long non-coding ORF, lncORF)、短編碼序列(short coding sequence, short CDS)和短同工型ORF (short isoform ORF)。其中，基因間ORF占sORF的96%，但其并不會進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯。uORF位于5′端非翻譯區(qū)(5′ untranslated region, 5′ UTR)，具有較低效率的翻譯功能并能調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄本中下游的ORF。lncORF存在于lncRNA (long non-coding RNA)中，與uORF相似具有較低的翻譯效率。最近發(fā)現(xiàn)，幾種lncRNA可編碼和翻譯為具有生物學(xué)功能的微肽，并且在進(jìn)化中高度保守。短CDS是在單順反子轉(zhuǎn)錄本中發(fā)現(xiàn)的，具有與ORF類似的翻譯效率，在果蠅和哺乳動物中存在著數(shù)百種短CDS。短同工型ORF是sORF中占比最少的一類，由mRNA的選擇性剪接產(chǎn)生[4]。

關(guān)于微肽的翻譯機(jī)制，目前有如下幾種可能的解釋：根據(jù)核糖體的掃描模型，mRNA的5′端帽子結(jié)構(gòu)與核糖體40S小亞基結(jié)合以復(fù)合物形式向3′端掃描，若遇起始密碼子，核糖體40S小亞基便與60S大亞基形成80S核糖體，從而介導(dǎo)5′UTR中sORF的翻譯，遇到終止密碼子時翻譯結(jié)束，大小亞基解離；而40S小亞基則繼續(xù)向前掃描，當(dāng)遇到ORF的起始密碼子時重新結(jié)合核糖體60S大亞基。第二種可能的機(jī)制是只有部分40S小亞基結(jié)合在5' UTR中sORF的起始密碼子處，另一部分繼續(xù)向前掃描至ORF的起始密碼子，這種機(jī)制被稱為核糖體的泄漏掃描[30]。但上述兩種機(jī)制只適用于uORF產(chǎn)生的微肽，關(guān)于其他類型微肽的翻譯機(jī)制還有待研究，還有一種猜想是RNA編輯促成了微肽的翻譯，即在轉(zhuǎn)錄后將A-C/G/A-G修改為A-U-G[31]。未來可以通過基因敲除RNA編輯的關(guān)鍵酶來研究RNA編輯在RNA水平上產(chǎn)生sORF起始密碼子的作用。

2 功能性微肽的發(fā)現(xiàn)

基于生物信息學(xué)及高通量測序技術(shù)對微肽的深入研究，越來越多的微肽被證明在生命活動的許多過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用，包括鈣離子穩(wěn)態(tài)、代謝、成肌細(xì)胞融合和肌肉發(fā)育、胚胎發(fā)育、物質(zhì)降解、癌癥等(圖2)[5～24]。下面將對近年來功能性微肽的發(fā)現(xiàn)進(jìn)行介紹，并將其總結(jié)在表1中。

圖1 sORF的分類

2.1 鈣離子穩(wěn)態(tài)相關(guān)微肽

Ca2+是肌肉收縮的主要調(diào)節(jié)因子，控制著肌肉的生長、代謝和病理重塑[32]。美國德克薩斯大學(xué)西南醫(yī)學(xué)中心Eric N. Olson實驗室的研究結(jié)果顯示，微肽對于Ca2+穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)起重要作用[5,6,8]。肌調(diào)素(myoregulin, MLN)是由骨骼肌特異性lncRNA編碼的46個氨基酸的微肽，它可直接與肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP酶(sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase, SERCA)相互作用以降低SERCA對Ca2+的親和力，從而減少Ca2+攝入肌漿網(wǎng)和肌細(xì)胞的收縮性[6]。因此，將MLN鑒定為骨骼肌中的SERCA抑制性微肽。相反，DWORF (dwarf open reading frame)可解除SERCA抑制性微肽的作用而增強(qiáng)肌漿網(wǎng)攝取Ca2+的能力，它是由心肌特異性lncRNA編碼的34個氨基酸的微肽[8]。隨后，Anderson等[5]在非肌肉細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)兩種SERCA抑制性微肽ELN (endoregulin)和ALN (another-regulin)，這兩種微肽具有與MLN相似的結(jié)構(gòu)和功能，表明Ca2+相關(guān)微肽在不同的細(xì)胞類型中保守，Ca2+穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)對于許多細(xì)胞功能具有重要意義。

另外，Magny等[7]在果蠅的基因中也發(fā)現(xiàn)編碼SERCA抑制性微肽的序列，該微肽可影響果蠅心肌中Ca2+的運(yùn)輸?？缥锓N的氨基酸相關(guān)序列分析表明，Ca2+相關(guān)微肽的結(jié)構(gòu)和功能在果蠅到脊椎動物中具有高度保守性，與其在SERCA中調(diào)節(jié)Ca2+攝取的生物學(xué)功能相關(guān)[5,7]。

2.2 線粒體代謝相關(guān)微肽

線粒體作為一種功能性細(xì)胞器，在新陳代謝及能量供應(yīng)方面起著重要的作用，大量的研究表明線粒體DNA中也存在sORFs[9,33]。Makarewich等[10]在線粒體內(nèi)膜中發(fā)現(xiàn)由lncRNA編碼的微肽MOXI (micropeptide regulator of β-oxidation)，MOXI與催化長鏈脂肪酸氧化的線粒體三功能蛋白(mitochon-drial trifunctional protein, MTP)結(jié)合，可增強(qiáng)脂肪酸的β氧化作用。Stein等[11]在骨骼肌和心臟中發(fā)現(xiàn)由lncRNA編碼的線粒體跨膜蛋白Mtln (mitoregulin)，Mtln作為粘性分子可通過增強(qiáng)線粒體蛋白復(fù)合物的裝配和穩(wěn)定性從而提高線粒體的呼吸效率。此外，在線粒體中還發(fā)現(xiàn)由編碼的16個氨基酸的微肽MOTS-c (mitochondrial open reading frame of the 12S rRNA-c)，它可抑制葉酸循環(huán)及嘌呤核苷酸的從頭合成途徑而導(dǎo)致AMPK (AMP-activated protein kinase)活化，從而調(diào)節(jié)胰島素的敏感性[9]。這些結(jié)果表明，線粒體可通過微肽在細(xì)胞和機(jī)體水平上主動調(diào)控代謝穩(wěn)態(tài)。

圖2 微肽的生理與病生理功能

表1 功能性微肽的發(fā)現(xiàn)

2.3 成肌細(xì)胞融合和肌肉發(fā)育相關(guān)微肽

骨骼肌的形成需要單核成肌細(xì)胞融合形成多核細(xì)胞肌管以產(chǎn)生收縮性肌纖維，Myomaker是成肌細(xì)胞融合所需的肌肉特異性蛋白[34,35]。最近研究發(fā)現(xiàn)，有多種肌肉特異性的微肽在哺乳動物成肌細(xì)胞融合的過程中也起著關(guān)鍵作用[12,13]。Zhang等[12]發(fā)現(xiàn)一種sORF編碼的新微肽Minion (microprotein inducer of fusion)，Minion與Myomaker共表達(dá)可誘導(dǎo)細(xì)胞融合和細(xì)胞骨架的快速重排。Myomixer是長為84個氨基酸的肌肉特異性微肽，可促進(jìn)成肌細(xì)胞融合，Myomixer與Myomaker結(jié)合還可誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞間的融合及成纖維細(xì)胞和成肌細(xì)胞的融合[13]。因此，sORF編碼的微肽對于肌肉發(fā)育過程中的肌纖維形成具有重要調(diào)控作用。

2.4 胚胎發(fā)育相關(guān)微肽

Toddler是在斑馬魚()中發(fā)現(xiàn)的由lncRNA編碼的長為58個氨基酸的微肽，研究發(fā)現(xiàn)它作為APJ/Apelin受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的激活劑，可促進(jìn)原腸胚的形成[14]。先前的研究表明APJ/Apelin受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)在心血管發(fā)育和生理調(diào)節(jié)等多種生物過程中發(fā)揮著重要作用[36]。Pauli等[14]發(fā)現(xiàn)Toddler功能缺失的斑馬魚沒有正常的心臟和血液循環(huán)，這些研究表明Toddler在早期胚胎發(fā)育過程中是不可或缺的。

另外，在果蠅中還發(fā)現(xiàn)與胚胎發(fā)育相關(guān)的微肽[15,16]。Kondo等[15]在果蠅的上皮組織中發(fā)現(xiàn)lncRNA()實際上被轉(zhuǎn)錄成多順反子mRNA，可編碼長為11或32個氨基酸的微肽(Pri)。Pri通過調(diào)節(jié)F-actin在上皮形態(tài)的發(fā)生中起重要作用，而Pri功能的喪失可完全消除果蠅的表皮結(jié)構(gòu)。Galindo等[16]在果蠅中發(fā)現(xiàn)基因()對果蠅的胚胎發(fā)育和形態(tài)發(fā)生至關(guān)重要，可翻譯為短至11個氨基酸的微肽，控制著果蠅的基因表達(dá)和組織折疊。這些結(jié)果表明，極短的sORF具有翻譯功能并在發(fā)育過程中具有重要調(diào)控作用。

2.5 物質(zhì)降解相關(guān)微肽

近年來，在生物技術(shù)的驅(qū)動下，與物質(zhì)降解作用相關(guān)的微肽也不斷被發(fā)現(xiàn)，它們在廢物和毒素的降解方面發(fā)揮著重要的作用[17～19]。SPAR (small regu-latory polypeptide of amino acid response)是由lncRNA編碼的長為90個氨基酸的保守性微肽，定位于晚期內(nèi)體及溶酶體。SPAR與溶酶體表面v-ATPase復(fù)合物的四個亞基相互作用，負(fù)性調(diào)節(jié)mTORC1的活化而抑制肌肉再生[17]。

此外，Pueyo等[18]在果蠅中發(fā)現(xiàn)一個組織特異性的sORF基因，其編碼果蠅巨噬細(xì)胞中長為88個氨基酸的跨膜微肽(Hemotin)。實驗研究表明，Hemotin peptide結(jié)合并抑制銜接蛋白14-3-3ζ，進(jìn)而促進(jìn)磷脂酰肌醇的磷酸化而調(diào)節(jié)吞噬作用中的內(nèi)體成熟。并且，研究人員在脊椎動物中還發(fā)現(xiàn)Hemotin的功能同源物Stannin，表明這種吞噬作用的新型調(diào)節(jié)因子具有物種間保守性[18]。

未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response, UPR)是真核細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum, ER)中的一個基本過程，在ER中只有正確組裝和折疊的蛋白質(zhì)才能分泌到胞外或展示在細(xì)胞表面，而不折疊的蛋白將被內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白所降解[37]。位于線粒體外膜的微肽PIGBOS與ER蛋白CLCC1結(jié)合從而調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的UPR，而PIGBOS的缺失會導(dǎo)致UPR升高和細(xì)胞死亡[19]。由此可見，微肽對細(xì)胞器間的通訊、體內(nèi)的平衡以及細(xì)胞的存亡至關(guān)重要。

2.6 癌癥相關(guān)微肽

微肽在癌癥的發(fā)生發(fā)展中也具有重要的調(diào)控作用[20～24]。CASIMO1 (cancer-associated small integral membrane open reading frame 1)是第一個被發(fā)現(xiàn)具有致癌作用的功能性微肽，它與膽固醇合成的關(guān)鍵酶角鯊烯環(huán)氧化酶(squalene epoxidase, SQLE)相互作用從而調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的代謝穩(wěn)態(tài)，敲低可導(dǎo)致乳腺癌細(xì)胞的增殖減少[20]。在結(jié)腸癌(colon cancer, CRC)方面，Huang等[21]發(fā)現(xiàn)由lncRNA編碼的長為53個氨基酸的保守微肽(HOXB-AS3)的缺失是CRC代謝中的關(guān)鍵致癌因素，HOXB-AS3能抑制結(jié)腸癌的生長。Pang等[22]還發(fā)現(xiàn)由lncRNA編碼的59個氨基酸的微肽SMIM30可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和遷移促進(jìn)肝癌的發(fā)生發(fā)展。Wu等[23]通過對281對男性食管鱗狀細(xì)胞癌(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)組織樣本中l(wèi)ncRNA的差異表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)與癌旁組織相比，在ESCC組織中顯著下調(diào)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)編碼微肽YY1BM (Yin Yang 1 (YY1)-binding micropeptide)，YY1BM可與雄激素受體(androgen receptor, AR)結(jié)合并下調(diào)的表達(dá)從而導(dǎo)致癌細(xì)胞凋亡，由此可見，YY1BM可作為一種潛在的抗癌微肽。另外，Li等[24]證明MIAC能抑制頭頸鱗狀細(xì)胞癌(head and neck squamous cell carcinoma, HNSCC)的生長和轉(zhuǎn)移。此外，還有一些微肽與癌癥并不直接相關(guān)，例如NoBody (-annotated P-dissociating polypeptide)是由編碼的68個氨基酸的微肽，它與mRNA脫帽蛋白相互作用，促進(jìn)無義介導(dǎo)的mRNA衰變(nonsense mediated decay, NMD)，癌細(xì)胞可能利用此過程降解抑制腫瘤的mRNA[38]?？偠灾?，這些新發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄本豐富了腫瘤調(diào)控分子，并為癌癥的臨床診斷和治療提供新的潛在靶標(biāo)。

3 微肽MIAC的發(fā)現(xiàn)

本課題組研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA可能編碼長為51個氨基酸的內(nèi)源性微肽[24]。在驗證這段序列的翻譯編碼能力時，我們通過體外翻譯實驗和體內(nèi)細(xì)胞構(gòu)建實驗加以證明，結(jié)果表明lncRNA能夠編碼一種新型微肽，我們將其命名為MIAC。在微肽MIAC的功能研究中，我們構(gòu)建了MIAC穩(wěn)定過表達(dá)和敲除的CAL27細(xì)胞系，實驗發(fā)現(xiàn)MIAC通過負(fù)調(diào)控癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移而抑制HNSCC的發(fā)生發(fā)展。

接下來，我們對MIAC抑制HNSCC相關(guān)機(jī)制做了進(jìn)一步的研究。通過質(zhì)譜鑒定與MIAC相互作用的蛋白，并結(jié)合50個HNSCC臨床樣本和50個正常樣本中蛋白的表達(dá)情況，最后聚焦于其中的這三種蛋白：水通道蛋白2 (aquaporin 2, AQP2)、ITGB4 (integrin beta 4)和SEPT2 (septin 2)。進(jìn)一步的機(jī)制探究表明MIAC直接與AQP2相互作用，通過調(diào)控SEPT2/ITGB4抑制骨架蛋白重排，最終抑制HNSCC的生長和轉(zhuǎn)移。由此可見，MIAC在HNSCC中具有調(diào)控作用，為開發(fā)治療HNSCC的藥物提供新的研究方向，而AQP2作為MIAC的作用靶點對于研究HNSCC的藥物同樣存在重要意義。

為進(jìn)一步探究MIAC的臨床和治療意義，我們分析TCGA數(shù)據(jù)庫中500個HNSCC臨床樣本和44個正常樣本中MIAC的相對表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)MIAC在HNSCC中呈下調(diào)趨勢，并且MIAC表達(dá)水平的降低與HNSCC患者的整體生存率差呈正相關(guān)。我們進(jìn)一步分析94對HNSCC臨床樣本中MIAC的相對表達(dá)量，分析結(jié)果也與數(shù)據(jù)庫中的情況一致，相比于在正常樣本中，MIAC在HNSCC樣本中的表達(dá)量降低。因此，MIAC是由lncRNA編碼的一種新型內(nèi)源性微肽，對于HNSCC的發(fā)生發(fā)展起著重要的調(diào)控作用。

創(chuàng)新型藥物作為自主研發(fā)和具有自主知識產(chǎn)權(quán)的藥物，對于我國建設(shè)創(chuàng)新型國家的進(jìn)一步發(fā)展具有重要意義。MIAC作為HNSCC的調(diào)控分子，在創(chuàng)新型HNSCC藥物的開發(fā)中具有重大的研究意義：MIAC可作為潛在診斷標(biāo)志物來制備診斷HNSCC的試劑盒，為HNSCC的診斷和預(yù)防提供新的途徑；而MIAC作為調(diào)控HNSCC的小分子多肽，也可通過偶聯(lián)化學(xué)藥物的方式來提高治療HNSCC藥物的靶向性和穩(wěn)定性。此外，MIAC在其他腫瘤和疾病中的意義還有待探究。

4 研究潛在微肽的相關(guān)技術(shù)

當(dāng)前的研究表明，在動物基因組中約1.2%的sORF可被轉(zhuǎn)錄，其中只有約1/3能被翻譯[4]。這些占比很小的功能性sORF理論上也可產(chǎn)生成千上萬個未被表征的微肽，即使這些微肽中只有小部分具有生物活性，仍意味著可能存在數(shù)百甚至數(shù)千種有生物學(xué)功能的微肽。因此，當(dāng)前面臨的挑戰(zhàn)是如何識別具有生物活性的sORF及其微肽。下面將總結(jié)介紹研究潛在微肽的相關(guān)技術(shù)，這些技術(shù)可用于鑒定可能編碼微肽的sORF。

4.1 生物信息學(xué)分析

生物信息學(xué)(bioinformatics)是利用生物數(shù)據(jù)來開發(fā)算法和軟件的交叉學(xué)科，目前運(yùn)用生物信息分析技術(shù)，基于保守序列可從非編碼區(qū)域預(yù)測具有編碼蛋白能力的sORFs，生物信息分析技術(shù)還依據(jù)sORFs序列中的密碼子含量和編碼特征以區(qū)分sORFs編碼區(qū)與非編碼區(qū)[39]。我們可以利用生物信息數(shù)據(jù)庫挖掘相關(guān)數(shù)據(jù)，如ATCG、UCSC等，而常用于預(yù)測sORFs的分析軟件有CPAT、ORFfinder、PhyloCSF、uPEPperoni[40～44]等。Niu等[45]運(yùn)用ORFfinder在人源基因中預(yù)測到一條54個堿基的sORF，后續(xù)實驗證明該sORF可編碼長為17個氨基酸的功能性微肽miPEP155。miPEP155可調(diào)節(jié)抗原呈遞細(xì)胞(antigen-presenting cells, APC)中的抗原轉(zhuǎn)運(yùn)和呈遞，可作為自身免疫性疾病的候選藥物[45]。

4.2 核糖體圖譜分析

核糖體圖譜分析(ribosome profiling)可用來識別具有翻譯潛力的sORF，該技術(shù)的原理是翻譯核糖體可保護(hù)長為20～30個核苷酸的mRNA片段免受核酸酶的消化[46]。然而，Wilson等[47]的研究表明某些sORF雖然與核糖體結(jié)合但并不進(jìn)行翻譯。于是，在Ribo-Seq的基礎(chǔ)上改良而開發(fā)了多聚核糖體分析(Poly-Ribo-Seq)，使用這種技術(shù)可以分離由多個核糖體結(jié)合并被主動翻譯的mRNA，由此可將不進(jìn)行翻譯的單核糖體-mRNA復(fù)合物區(qū)分開[48]。此外，Guttman等[49]還開發(fā)了核糖體釋放分?jǐn)?shù)(ribosome release score, RRS)作為翻譯的度量指標(biāo)，相比于終止密碼子下游的非編碼區(qū)，編碼區(qū)與核糖體具有更高的相關(guān)性，由此可區(qū)分編碼轉(zhuǎn)錄本和非編碼轉(zhuǎn)錄本。Chen等[26]利用核糖體圖譜分析發(fā)現(xiàn)了3455個非經(jīng)典CDS，其中的96%是編碼小于100個氨基酸的微肽。

4.3 質(zhì)譜和蛋白質(zhì)組學(xué)

最近基于質(zhì)譜(mass spectrometry, MS)的蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)也用于發(fā)現(xiàn)和驗證內(nèi)源表達(dá)的微肽。該技術(shù)的基本原理是通過測量氣態(tài)的離子化肽或蛋白質(zhì)的質(zhì)荷比來研究蛋白質(zhì)的表達(dá)和相互作用，因此MS通過檢測從sORF翻譯的微肽，從而直接驗證轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物編碼蛋白質(zhì)的潛力[50]。基于MS的蛋白質(zhì)組學(xué)在研究和鑒定新型微肽方面已取得實質(zhì)性的進(jìn)展，Chen等[26]通過基于MS的HLA-I肽組學(xué)，發(fā)現(xiàn)240個微肽可被HLA-I提呈，表明這些肽會進(jìn)入HLA-I呈遞途徑并可能擁有免疫原性。但MS在技術(shù)上仍然存在一定限制，樣品制備過程中的消化酶決定微肽片段化的方式，片段過小不能產(chǎn)生足夠的檢測信號，片段過大則無法用于MS分析，小片段的微肽在樣品制備過程中還存在丟失的可能[39]。因此，需要進(jìn)一步結(jié)合核糖體圖譜分析等其他分析方法以確定新型微肽的存在。

4.4 蛋白質(zhì)基因組學(xué)

蛋白質(zhì)基因組學(xué)(proteogenomics)是在基于蛋白質(zhì)組學(xué)分析的基礎(chǔ)上結(jié)合基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)的分析方法，通過追溯基因組和轉(zhuǎn)錄本中的蛋白質(zhì)/微肽的預(yù)測序列，來鑒定基因的翻譯和表達(dá)情況[51]。在蛋白質(zhì)基因組學(xué)研究中，Slavoff等[31]從人白血病細(xì)胞系K562細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了86個未報道過的微肽。

4.5 其他相關(guān)技術(shù)

為證實sORF是否具有編碼蛋白產(chǎn)生微肽的能力，可以使用以下幾種方法來進(jìn)行驗證。在理想的狀態(tài)下，可以設(shè)計目的微肽的抗體并通過免疫組化或蛋白質(zhì)印記來驗證其特異性[52]。例如，Li等[24]通過制備MIAC的單克隆抗體以檢測MIAC的內(nèi)源表達(dá)。對于不能產(chǎn)生抗體的目的微肽而言，也可采用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)。該技術(shù)通過同源定向修復(fù)將FLAG/MYC或其他標(biāo)簽添加到預(yù)測的sORF，從而產(chǎn)生融合蛋白，再通過檢測融合蛋白以驗證目的微肽的存在[52]。為確定轉(zhuǎn)錄本中的sORF是否翻譯為微肽，Polycarpou-Schwarz等[20]在CASIMO1編碼序列的C端插入了一個Flag標(biāo)簽，并通過anti-Flag抗體檢測到了CASIMO1-Flag的表達(dá)。此外，還可通過體外翻譯來評估sORF編碼蛋白的能力，通過多方面的驗證以確定sORF是否具有編碼能力。

5 結(jié)語與展望

大規(guī)?；蚪M測序的迅速發(fā)展促進(jìn)人們對基因組的深入研究，揭示sORF序列的復(fù)雜性。微肽的發(fā)現(xiàn)使人們認(rèn)識到這些重要小肽的生物學(xué)作用，它們在生命活動及疾病的發(fā)展進(jìn)程中起著重要調(diào)控作用。微肽可以以配體或信號分子的形式發(fā)揮作用，也可與其他蛋白質(zhì)相結(jié)合，通過遮蔽受體蛋白的關(guān)鍵位點或影響受體蛋白的活性從而發(fā)揮調(diào)控作用，如前所述的HOXB-AS3 peptide[21]通過競爭性結(jié)合hnRNP A1中RGG基序的精氨酸殘基，阻斷精氨酸殘基與丙酮酸激酶M(pyruvate kinase M, PKM)的結(jié)合，從而抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的葡萄糖代謝進(jìn)程。SMIM30[22]與非受體酪氨酸激酶SRC/YES1結(jié)合，驅(qū)動其膜錨定和磷酸化，激活下游絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)信號通路，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和遷移促進(jìn)肝癌的發(fā)生發(fā)展。

然而，對于功能性微肽及其作用機(jī)制的探索仍處于起步狀態(tài)，雖然已經(jīng)存在許多挖掘未知微肽的生物技術(shù)，但由于微肽本身分子量小、表達(dá)豐度低等特點，這些生物技術(shù)的應(yīng)用仍然存在局限性，生命體中仍有大量的微肽等待被發(fā)現(xiàn)。相信在未來的研究中，能克服檢測障礙，進(jìn)一步拓展和優(yōu)化挖掘微肽的技術(shù)與方法。另一方面，還需要進(jìn)行大量的工作以闡明微肽的生物學(xué)作用，并對其作用機(jī)制開展進(jìn)一步的研究，以便應(yīng)用于正常生理功能的探索及疾病的臨床診療。

[1] Crick F. Central dogma of molecular biology., 1970, 227(5258): 561–563.

[2] Djebali S, Davis CA, Merkel A, Dobin A, Lassmann T, Mortazavi A, Tanzer A, Lagarde J, Lin W, Schlesinger F, Xue CH, Marinov GK, Khatun J, Williams BA, Zaleski C, Rozowsky J, R?der M, Kokocinski F, Abdelhamid RF, Alioto T, Antoshechkin I, Baer MT, Bar NS, Batut P, Bell K, Bell I, Chakrabortty S, Chen X, Chrast J, Curado J, Derrien T, Drenkow J, Dumais E, Dumais J, Duttagupta R, Falconnet E, Fastuca M, Fejes-Toth K, Ferreira P, Foissac S, Fullwood MJ, Gao H, Gonzalez D, Gordon A, Gunawardena H, Howald C, Jha S, Johnson R, Kapranov P, King B, Kingswood C, Luo OJ, Park E, Persaud K, Preall JB, Ribeca P, Risk B, Robyr D, Sammeth M, Schaffer L, See LH, Shahab A, Skancke J, Suzuki AM, Takahashi H, Tilgner H, Trout D, Walters N, Wang HE, Wrobel J, Yu YB, Ruan XA, Hayashizaki Y, Harrow J, Gerstein M, Hubbard T, Reymond A, Antonarakis SE, Hannon G, Giddings MC, Ruan YJ, Wold B, Carninci P, Guigó R, Gingeras TR. Landscape of transcription in human cells., 2012, 489(7414): 101–108.

[3] ENCODE Project Consortium. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome., 2012, 489(7414): 57–74.

[4] Couso JP, Patraquim P. Classification and function of small open reading frames., 2017, 18(9): 575–589.

[5] Anderson DM, Makarewich CA, Anderson KM, Shelton JM, Bezprozvannaya S, Bassel-Duby R, Olson EN. Widespread control of calcium signaling by a family of SERCA-inhibiting micropeptides., 2016, 9(457): ra119.

[6] Anderson DM, Anderson KM, Chang CL, Makarewich CA, Nelson BR, McAnally JR, Kasaragod P, Shelton JM, Liou J, Bassel-Duby R, Olson EN. A micropeptide encoded by a putative long noncoding RNA regulates muscle performance., 2015, 160(4): 595–606.

[7] Magny EG, Pueyo JI, Pearl FMG, Cespedes MA, Niven JE, Bishop SA, Couso JP. Conserved regulation of cardiac calcium uptake by peptides encoded in small open reading frames., 2013, 341(6150): 1116–1120.

[8] Nelson BR, Makarewich CA, Anderson DM, Winders BR, Troupes CD, Wu FF, Reese AL, McAnally JR, Chen XW, Kavalali ET, Cannon SC, Houser SR, Bassel-Duby R, Olson EN. A peptide encoded by a transcript annotated as long noncoding RNA enhances SERCA activity in muscle., 2016, 351(6270): 271–275.

[9] Lee C, Zeng J, Drew BG, Sallam T, Martin-Montalvo A, Wan JX, Kim SJ, Mehta H, Hevener AL, de Cabo R, Cohen P. The mitochondrial-derived peptide MOTS-c promotes metabolic homeostasis and reduces obesity and insulin resistance., 2015, 21(3): 443–454.

[10] Makarewich CA, Baskin KK, Munir AZ, Bezprozvannaya S, Sharma G, Khemtong C, Shah AM, McAnally JR, Malloy CR, Szweda LI, Bassel-Duby R, Olson EN. MOXI is a mitochondrial micropeptide that enhances fatty acid beta-oxidation., 2018, 23(13): 3701–3709.

[11] Stein CS, Jadiya P, Zhang XM, McLendon JM, Abouassaly GM, Witmer NH, Anderson EJ, Elrod JW, Boudreau RL. Mitoregulin: a lncRNA-encoded microprotein that supports mitochondrial supercomplexes and respiratory efficiency., 2018, 23(13): 3710–3720.e8.

[12] Zhang Q, Vashisht AA, O'Rourke J, Corbel SY, Moran R, Romero A, Miraglia L, Zhang J, Durrant E, Schmedt C, Sampath SC, Sampath SC. The microprotein Minion controls cell fusion and muscle formation., 2017, 8: 15664.

[13] Bi PP, Ramirez-Martinez A, Li H, Cannavino J, McAnally JR, Shelton JM, Sánchez-Ortiz E, Bassel-Duby R, Olson EN. Control of muscle formation by the fusogenic micro-peptide myomixer., 2017, 356(6335): 323–327.

[14] Pauli A, Norris ML, Valen E, Chew GL, Gagnon JA, Zimmerman S, Mitchell A, Ma J, Dubrulle J, Reyon D, Tsai SQ, Joung JK, Saghatelian A, Schier AF. Toddler: an embryonic signal that promotes cell movementApelin receptors., 2014, 343(6172): 1248636.

[15] Kondo T, Hashimoto Y, Kato K, Inagaki S, Hayashi S, Kageyama Y. Small peptide regulators of actin-based cell morphogenesis encoded by a polycistronic mRNA., 2007, 9(6): 660–665.

[16] Galindo MI, Pueyo JI, Fouix S, Bishop SA, Couso JP. Peptides encoded by short ORFs control development and define a new eukaryotic gene family., 2007, 5(5): e106.

[17] Matsumoto A, Pasut A, Matsumoto M, Yamashita R, Fung J, Monteleone E, Saghatelian A, Nakayama KI, Clohessy JG, Pandolfi PP. mTORC1 and muscle regeneration are regulated by the-encoded SPAR polypeptide., 2017, 541(7636): 228–232.

[18] Pueyo JI, Magny EG, Sampson CJ, Amin U, Evans IR, Bishop SA, Couso JP. Hemotin, a regulator of phago-cytosis encoded by a small ORF and conserved across metazoans., 2016, 14(3): e1002395.

[19] Chu Q, Martinez TF, Novak SW, Donaldson CJ, Tan D, Vaughan JM, Chang TN, Diedrich JK, Andrade L, Kim A, Zhang T, Manor U, Saghatelian A. Regulation of the ER stress response by a mitochondrial microprotein., 2019, 10(1): 4883.

[20] Polycarpou-Schwarz M, Gro? M, Mestdagh P, Schott J, Grund SE, Hildenbrand C, Rom J, Aulmann S, Sinn HP, Vandesompele J, Diederichs S. The cancer-associated microprotein CASIMO1 controls cell proliferation and interacts with squalene epoxidase modulating lipid droplet formation., 2018, 37(34): 4750–4768.

[21] Huang JZ, Chen M, Chen D, Gao XC, Zhu S, Huang HY, Hu M, Zhu HF, Yan GR. A peptide encoded by a putative lncRNAsuppresses colon cancer growth., 2017, 68(1): 171–184.e6.

[22] Pang YN, Liu ZY, Han H, Wang BL, Li W, Mao CB, Liu SR. Peptide SMIM30 promotes HCC development by inducing SRC/YES1 membrane anchoring and MAPK pathway activation., 2020, 73(5): 1155–1169.

[23] Wu SQ, Zhang LY, Deng JQ, Guo BB, Li F, Wang YR, Wu R, Zhang SH, Lu JC, Zhou YF. A novel micropeptide encoded by Y-linkedlinks cigarette smoking and AR signaling in male esophageal squamous cell carcinoma., 2020, 80(13): 2790–2803.

[24] Li MW, Li X, Zhang YN, Wu HM, Zhou HZ, Ding X, Zhang XM, Jin XR, Wang Y, Yin XQ, Li CC, Yang PW, Xu HM. Micropeptide MIAC inhibits HNSCC progression by Interacting with aquaporin 2., 2020, 142(14): 6708–6716.

[25] Sieber P, Platzer M, Schuster S. The definition of open reading frame revisited., 2018, 34(3): 167– 170.

[26] Chen J, Brunner AD, Cogan JZ, Nu?ez JK, Fields AP, Adamson B, Itzhak DN, Li JY, Mann M, Leonetti MD, Weissman JS. Pervasive functional translation of noncanonical human open reading frames., 2020, 367(6482): 1140–1146.

[27] Jackson R, Kroehling L, Khitun A, Bailis W, Jarret A, York AG, Khan OM, Brewer JR, Skadow MH, Duizer C, Harman CCD, Chang L, Bielecki P, Solis AG, Steach HR, Slavoff S, Flavell RA. The translation of non-canonical open reading frames controls mucosal immunity., 2018, 564(7736): 434–438.

[28] Orr MW, Mao YH, Storz G, Qian SB. Alternative ORFs and small ORFs: shedding light on the dark proteome., 2020, 48(3): 1029–1042.

[29] Ladoukakis E, Pereira V, Magny EG, Eyre-Walker A, Couso JP. Hundreds of putatively functional small open reading frames in drosophila., 2011, 12(11): R118.

[30] Andrews SJ, Rothnagel JA. Emerging evidence for functional peptides encoded by short open reading frames., 2014, 15(3): 193–204.

[31] Slavoff SA, Mitchell AJ, Schwaid AG, Cabili MN, Ma J, Levin JZ, Karger AD, Budnik BA, Rinn JL, Saghatelian A. Peptidomic discovery of short open reading frame- encoded peptides in human cells., 2013, 9(1): 59–64.

[32] Dufresne SS, Dumont NA, Boulanger-Piette A, Fajardo VA, Gamu D, Kake-Guena SA, David RO, Bouchard P, Lavergne é, Penninger JM, Pape PC, Tupling AR, Frenette J. Muscle RANK is a key regulator of Ca2+storage, SERCA activity, and function of fast-twitch skeletal muscles., 2016, 310(8): C663– C672.

[33] Gusic M, Prokisch H. ncRNAs: new players in mitochondrial health and disease?, 2020, 11: 95.

[34] Krauss RS, Joseph GA, Goel AJ. Keep your friends close: cell-cell contact and skeletal myogenesis., 2017, 9(2): a029298.

[35] Millay DP, Gamage DG, Quinn ME, Min YL, Mitani Y, Bassel-Duby R, Olson EN. Structure-function analysis of myomaker domains required for myoblast fusion., 2016, 113(8): 2116–2121.

[36] Read C, Nyimanu D, Williams TL, Huggins DJ, Sulentic P, Macrae RGC, Yang PR, Glen RC, Maguire JJ, Davenport AP. International union of basic and clinical pharmacology. CVII. structure and pharmacology of the Apelin receptor with a recommendation that Elabela/Toddler is a second endogenous peptide ligand., 2019, 71(4): 467–502.

[37] Walter P, Ron D. The unfolded protein response: from stress pathway to homeostatic regulation., 2011, 334(6059): 1081–1086.

[38] D'Lima NG, Ma J, Winkler L, Chu Q, Loh KH, Corpuz EO, Budnik BA, Lykke-Andersen J, Saghatelian A, Slavoff SA. A human microprotein that interacts with the mRNA decapping complex., 2017, 13(2): 174– 180.

[39] Makarewich CA, Olson EN. Mining for micropeptides., 2017, 27(9): 685–696.

[40] Li X, Li MW, Zhang YN, Xu HM. Common cancer genetic analysis methods and application study based on TCGA database., 2019, 41(3): 234–242.

李鑫, 李夢瑋, 張依楠, 徐寒梅. 常用腫瘤基因分析方法及基于TCGA數(shù)據(jù)庫的分析應(yīng)用. 遺傳, 2019, 41(3): 234–242.

[41] Wang LG, Park HJ, Dasari S, Wang SQ, Kocher JP, Li W. CPAT: coding-potential assessment tool using an alignment- free logistic regression model., 2013, 41(6): e74.

[42] Hanada K, Akiyama K, Sakurai T, Toyoda T, Shinozaki K, Shiu SH. sORF finder: a program package to identify small open reading frames with high coding potential., 2010, 26(3): 399–400.

[43] Lin MF, Jungreis I, Kellis M. PhyloCSF: a comparative genomics method to distinguish protein coding and non- coding regions., 2011, 27(13): i275–i282.

[44] Skarshewski A, Stanton-Cook M, Huber T, Al Mansoori S, Smith R, Beatson SA, Rothnagel JA. uPEPperoni: an online tool for upstream open reading frame location and analysis of transcript conservation., 2014, 15: 36.

[45] Niu LM, Lou FZ, Sun Y, Sun LB, Cai XJ, Liu ZY, Zhou H, Wang H, Wang ZK, Bai J, Yin QQ, Zhang JX, Chen LJ, Peng DH, Xu ZY, Gao YY, Tang SB, Fan L, Wang HL. A micropeptide encoded by lncRNAsuppresses autoimmune inflammationmodulating antigen pre-sentation., 2020, 6(21): eaaz2059.

[46] Ingolia NT. Ribosome footprint profiling of translation throughout the genome., 2016, 165(1): 22–33.

[47] Wilson BA, Masel J. Putatively noncoding transcripts show extensive association with ribosomes., 2011, 3: 1245–1252.

[48] Aspden JL, Eyre-Walker YC, Phillips RJ, Amin U, Mumtaz MAS, Brocard M, Couso JP. Extensive translation of small open reading frames revealed by Poly-Ribo-Seq., 2014, 3: e03528.

[49] Guttman M, Russell P, Ingolia NT, Weissman JS, Lander ES. Ribosome profiling provides evidence that large noncoding RNAs do not encode proteins., 2013, 154(1): 240–251.

[50] Aebersold R, Mann M. Mass-spectrometric exploration of proteome structure and function., 2016, 537(7620): 347–355.

[51] Menschaert G, Feny? D. Proteogenomics from a bioinformatics angle: a growing field., 2017, 36(5): 584–599.

[52] Housman G, Ulitsky I. Methods for distinguishing between protein-coding and long noncoding RNAs and the elusive biological purpose of translation of long noncoding RNAs., 2016, 1859(1): 31–40.

[53] Yang J, Meng XD, Pan JC, Jiang N, Zhou CW, Wu ZH, Gong ZH. CRISPR/Cas9-mediated noncoding RNA editing in human cancers., 2018, 15(1): 35–43.

Progress on sORF-encoded micropeptides

Xiangying Chen, Mengwei Li, Ying Wang, Quan Chen, Hanmei Xu

Existing research has shown that there are a large amount of non-coding RNAs (ncRNAs) in organisms. Short open reading frames (sORFs) abundantly exist in molecular sequences inaccurately annotated as ncRNAs. Several sORFs can be transcribed and translated into evolutionarily conserved micropeptides, which were ignored in previous studies due to short sequence lengths and the limitations of research techniques. To date, sORF-encoded micropeptides with various functions have been found to play important roles in regulating vital biological activities. This article reviews the functional micropeptides which have been found in recent years, introduces the new micropeptide designated as MIAC that we have discovered and describes the related technologies for mining potential micropeptides, thereby providing insights and references for new micropeptide discovery for researchers.

non-coding RNA; small open reading frames; micropeptides

2021-05-08;

2021-07-06

中國藥科大學(xué)天然藥物活性組分與藥效國家重點實驗(編號：SKLNMZZCX201821, SKLNMZZ202028)，國家科技重大新藥開發(fā)項目(編號：2019ZX09301124, 2019ZX09201001, 2019ZX09301-110)和中國博士后科學(xué)基金資助項目(編號：2017M621884, 2020M681787) 資助[Supported by the Project Program of State Key Laboratory of Natural Medicines (Nos. SKLNMZZCX201821, SKLNMZZ202028), the National Science and Technology Major Projects of New Drugs (Nos. 2019ZX09301124, 2019ZX09201001, 2019ZX09301-110) and China Postdoctoral Science Foundation (Nos. 2017M621884, 2020M681787)]

陳相穎，在讀碩士研究生，專業(yè)方向：微生物與生化藥學(xué)。E-mail: cxy000111@qq.com

徐寒梅，博士，教授，研究方向：多肽類藥物研究與開發(fā)。E-mail: 13913925346@126.com

10.16288/j.yczz.21-167

2021/7/23 16:26:21

URI: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20210723.0937.002.html

(責(zé)任編委: 薛宇)