黃松茂 白華毅 李光華 于虹漫 冷云 畢保良 王正陽 趙玉姣 張銘梟 孔令富

摘要：秀麗高原鰍（Triplophysa venusta）為云南特有魚類，為闡明促性腺激素釋放激素類似物和左旋多巴對秀麗高原鰍體長、體重和卵巢發(fā)育的影響，本實驗采用生物化學等技術，研究了促性腺激素釋放激素類似物（GnRH-a，0.1 mg/kg/2周，共注射4次）和左旋多巴（L-dopa，100 mg/kg/2周，共注射4次）對體長、體重和卵巢發(fā)育的影響，以期為秀麗高原鰍人工繁育提供理論依據。結果表明：兩種外源激素處理組和對照組間體長、體重變化均無顯著差異，兩種外源激素對秀麗高原鰍體長和體重的影響不明顯;由于個體成熟度差異較大，有的個體卵巢尚未發(fā)育成熟，故無法進行分區(qū)的組間比較，但對少數成熟個體進行了卵巢腺發(fā)育的特征和組織學分期。

關鍵詞：秀麗高原鰍;外源激素;體長、體重;卵巢發(fā)育

中圖分類號：S917? ? ? ? 文獻標識碼：A

文章編號：1006-3188（2021）03-007-06

Abstract： Triplophysa venusta is a fish unique to Yunnan.In order to clarify the effects of gonadotropin-releasing hormone analogues and levodopa on the body length， weight and ovarian development of Triplophysa venusta， this experiment used biochemical techniques to study Gonadotropin-releasing hormone analogues （GnRH-a， 0.1 mg/kg/2 weeks， 4 injections total） and levodopa （L-dopa， 100 mg/kg/2 weeks， 4 injections total） The effects of body length， weight and ovarian development are expected to provide a theoretical basis for the artificial breeding of Triplophysa venusta.The results showed that there was no significant difference in body length and weight between the two exogenous hormone treatment groups and the control group， and the two exogenous hormones had no significant effect on the body length and weight of Triplophysa venusta; due to the difference in individual maturity The ovaries of some individuals are not yet mature， so it is not possible to compare the divisions between groups.However， a few mature individuals were given the characteristics of ovarian gland development and histological staging.

Keywords： Triplophysa venusta; exogenous hormones; body length and weight; ovarian developmentt

秀麗高原鰍（Triplophysa venusta）屬軟骨魚綱（Chondrichthyes）、鯉形目（Cypriniformes） 、條鰍科（Nemacheilidae），為云南省特有品種，僅分布于云南金沙江中、上游干支流和附屬水體（包括湖泊）[1]。秀麗高原鰍為均勻型生長魚類，雌雄個體體長、體重和肥滿度無顯著差異[2]，是一種高蛋白、高脂肪，且富含氨基酸和脂肪酸的營養(yǎng)均衡、肉味鮮美的魚類[3]。幼魚適合生存pH值為4.55～10.15[4]，耗氧率隨溫度降低而減小，晝夜變化不明顯[5]，在人工可控條件下可存活并生長[6]。但關于外源激素對其體長、體重和卵巢發(fā)育的影響尚不明確。

本研究采用腹腔注射促性腺激素釋放激素類似物（GnRH-a）和左旋多巴（L-dopa），通過測量體長、體重和卵巢組織切片分析，研究兩種外源激素對秀麗高原鰍生長發(fā)育的影響，探討了外源激素對秀麗高原鰍體長、體重影響及卵巢發(fā)育特征和組織學分期，以期為秀麗高原鰍人工繁育提供理論依據。

1? 材料與方法

1.1? 實驗材料

2013年3月～12月，從云南省鶴慶縣的龍?zhí)痘蚝恿鞯?個地點采集秀麗高原鰍野生個體，實驗前在室溫和自然光周期下暫養(yǎng)于室內水族箱中。自然光照并控制水溫在20℃左右，24小時通氧和水流循環(huán)過濾，實驗前暫養(yǎng)2周，直到適應新環(huán)境并開口攝食人工餌料為止。

1.2? 研究方法

1.2.1 藥物處理和分組

為減少實驗誤差，將在體實驗秀麗高原鰍隨機分成3組。第一組為對照組，每個個體分別腹腔注射生理鹽水（每2周注射1次，共4次），有效個體數為5;第二組為促性腺激素釋放激素類似物（GnRH-a）組（0.1 mg/kg/2周，共注射4次），有效個體數為6;第三組為左旋多巴（L-dopa）組（100 mg/kg/2周，共注射4次），有效個體數為9。實驗期間，根據實際需要量投喂人工餌料，喂飽為止。

1.2.2? 體長、體重的測量與分析

體長、體重采用人工測量，每2周測量1次。自池中撈出，小心用濕毛巾包裹，用國際標準尺（單位：mm）測量，然后立即放入裝有水的稱重杯中稱重（電子天平，精度0.01 g）并記錄。每次所得體長與體重數據均按組算出平均值后按以下公式計算出相對變化值，并作方差分析。相對變化率=（本次值-初始值）/初始值。

1.2.3? 卵巢發(fā)育的分析

取秀麗高原鰍解剖，獲得性腺樣品，所采集樣品均用pH 7.2的磷酸緩沖液（PBS）清洗，采用Bouin氏液固定，制成25～30 um厚的石臘切片;用Delafield蘇木精-伊紅染色，作顯微攝影，并作卵母細胞時相的劃分。

2? 結果與分析

2.1? GnRH-a和L-dopa對體長生長的影響

由圖1可知，秀麗高原鰍注射NaCl體長相對變化率介于-0.015～0.015，注射GnRH-a體長相對變化率介于0～0.02，注射L-dopa體長相對變化率介于-0.005～0.005。結合表1體長相對變化率單因素方差分析和表2體長相對變化率方差分析，秀麗高原鰍組間體長相對變化率無顯著差異（F0.05）。

2.2? GnRH-a和L-dopa對體重生長的影響

由圖2可知，秀麗高原鰍注射NaCl體重相對變化率介于-0.06～0.06，注射GnRH-a體重相對變化率介于-0.02～0.04，注射L-dopa體重相對變化率介于-0.08～0。結合表3體重相對變化率單因素方差分析和表4體重相對變化率方差分析，秀麗高原鰍組間體重相對變化率無顯著差異（F0.05）。

2.3? 卵巢腺發(fā)育的特征和組織學分期

本次樣品數量少，且由于個體年齡差異大，有的個體卵巢尚未發(fā)育成熟，故無法進行分區(qū)的組間比較，僅對少數成熟個體進行了卵巢腺發(fā)育的特征和組織學分期。根據秀麗高原鰍卵巢發(fā)育過程中濾泡細胞出現的時間、數量、大小和分布狀況以及細胞結構和功能，同時參照Andrade 等[7]、方永強等[8]和張永泉等[9]關于其卵巢腺組織學分期劃分的方法，將濾泡細胞從發(fā)生到退化分成五個時期，分別是零散濾泡膜細胞期、單層扁平濾泡膜細胞期、多層扁平濾泡膜細胞期、顆粒細胞分泌期和顆粒細胞退化期（圖3）。

3? 討論

3.1? 外源激素與體長、體重的關系

體長、體重是魚類重要的經濟指標，魚類生長過程中體長、體重受各種因素影響，實驗過程中體長相對增長率和體重相對相對變化率直接反映了秀麗高原鰍生長發(fā)育狀況。促性腺激素釋放激素類似物是一種人工合成的促性腺激素釋放激素;左旋多巴為多巴胺的前體藥物。研究表明，促性腺激素釋放激素（GnRH）和多巴胺都能和魚類腦垂體生長激素細胞的特異性受體結合而刺激生長激素釋放，并能提高生長速率[10];腹腔注射促性腺激素釋放激素類似物（GnRH-a）（0.001 μg/g體重/周和0.01 μg/g體重/周）能顯著提高草魚魚種相對體重和相對體長生長率[11];注射多巴胺（DA）（100 μg/g體重/周）能刺激鯉魚分泌生長激素（GH）[12];在草魚飼料中添加LHRH-a（1或10 ug/g飼料）5周后，草魚幼魚的生長率顯著提高[13];高水平的左旋多巴（L-dopa）會影響鯉魚對氨基酸的利用[14];左旋多巴（L-dopa）還能延長鰻鱺脊髓損傷后的運動時間并加快脊髓功能的恢復[15]。本研究對秀麗高原鰍腹腔注射促性腺激素釋放激素類似物和左旋多巴，結果顯示秀麗高原鰍組間體長相對增長率和體重相對變化率均無顯著差異，促性腺激素釋放激素類似物和左旋多巴對秀麗高原鰍體長和體重的影響不明顯。

3.2? 外源激素對卵巢發(fā)育的影響

魚類卵巢發(fā)育受多種因素（溫度[16]、人工配合飼料[17]、外源激素[18]等）的影響。相關研究表明，不同的外源激素對卵巢作用不同，人工注射催產激素（LRH-A3 0.20 μg/kg體重和HCG 500 IU/kg體重）能夠促進半滑舌鰨卵巢更快地發(fā)育到下一個時期[19];但類雄激素可以抑制麥穗魚卵巢發(fā)育，抑制程度隨著濃度的變大而增加[20];絨毛膜促性腺激素（HCG）和鯉垂體（PT）對鰻鱺卵巢催熟效果較好，促黃體素釋放激素（LHRH-A2）和丙酸睪丸素（TOP）則無明顯效果[18];促性腺激素釋放激素類似物（GnRH-a）可用于誘導大菱鲆多次產卵[21];多巴胺（DA）通過抑制促性腺激素（GtH）的分泌從而阻斷促性腺激素釋放激素（GnRH）的作用[22]。野生秀麗高原鰍2齡即可達到性成熟，同齡魚中，性腺發(fā)育周期存在一定差異;在個體卵巢發(fā)育過程中，卵細胞發(fā)育具有不同步性，分布有不同發(fā)育時期的卵細胞[23]。研究表明，可以注射外源激素對其繁殖進行人工干預[24]，由于本次樣品數量少，且個體年齡差異大，有的個體卵巢尚未發(fā)育成熟，故無法進行分區(qū)的組間比較。

近年來由于人類活動以及自然條件的影響，秀麗高原鰍棲息環(huán)境遭到破壞，種群數量銳減[25]，在未來100年內的滅絕概率已達54.8%，是一個較脆弱的群體[26]，保護秀麗高原鰍種群資源的工作已刻不容緩。通過外源激素對秀麗高原鰍體長、體重和卵巢發(fā)育影響的探索，為實現秀麗高原鰍人工繁育奠定了基礎。

參考文獻

[1]陳小勇. 云南魚類名錄[J]. 動物學研究，2013，34（04）：281-337.

[2]李光華，武祥偉，于虹漫，等. 秀麗高原鰍生物學性狀與肌肉氨基酸組成分析[J]. 淡水漁業(yè)，2016，46（03）：23-28.

[3]崔麗莉，冷云，繆祥軍，等. 秀麗高原鰍肌肉營養(yǎng)成分分析與品質評價[J]. 水生態(tài)學雜志，2016，37（02）：70-75.

[4]王志飛，鐘文武，左鵬翔，等. 秀麗高原鰍幼魚pH值的耐受性[J]. 浙江農業(yè)科學，2017，58（02）：343-346.

[5]王志飛，左鵬翔，冷云，等. 秀麗高原鰍幼魚窒息點與耗氧率的研究[J]. 黑龍江水產，2019，38（02）：42-45.

[6]梁祥，冷云，李光華，等. 秀麗高原鰍苗種人工培育試驗初報[J]. 水產養(yǎng)殖，2016，37（12）：19-20.

[7]Andrade R F， Bazzoli N， Rizzo E， et al.Continuous gametogenesis in the neotropical freshwater teleost， Bryconops affinis （Pisces： Characidae）[J]. Tissue & Cell， 2001， 33（5）：524-532.

[8]方永強，U.Welsch.文昌魚卵巢中濾泡細胞超微結構及功能的研究[J].中國科學（B輯），1995，25（10）：1079-1085+1121-1122.

[9]張永泉，尹家勝，杜佳，等.哲羅魚（Hucho taimen）卵巢濾泡細胞發(fā)生的超微結構研究[J].海洋與湖沼，2013，44（01）：262-266.

[10]林浩然.神經內分泌因子調控魚類生殖和生長的相互作用[J].動物學研究，2000，21（01）：12-17.

[11]林信偉，林浩然，張慶.促性腺激素釋放激素類似物促進魚類生長激素分泌和生長[J].水產學報，1993，17（04）：282-288.

[12]王黎，林浩然.促黃體素釋放激素類似物和多巴胺對鯉魚幼魚和性成熟雌魚生長激素分泌的作用[J].動物學報，1997，43（03）：303-308.

[13]Lin H R， Lu M， Lin X W， et al.Effects of gonadotropin-releasing hormone （GnRH） analogs and sex steroids on growth hormone （GH） secretion and growth in common carp （Cyprinus carpio） and grass carp （Ctenopharyngodon idellus）[J].Aquaculture， 1995， 135（1-3）：173-184.

[14]Siddhuraju P， Becker K. Effect of phenolic nonprotein amino acid L-dopa（L-3， 4-dihydroxyphenylalanine） on growth performance， metabolic rates and feed nutrient utilization of common carp （Cyprinus carpio L.）[J]. Aquaculture Nutrition，2002，8（1）：69-77.

[15]Doyle L M F， Roberts B L. Functional recovery and axonal growth following spinal cord transection is accelerated by sustained L-DOPA administration.[J]. European Journal of Neuroscience，2015，20（8）：2008-2014.

[16]張敏智，鄧思平，朱春華，等. 溫度對金錢魚卵巢發(fā)育的影響[J]. 中國水產科學，2013，20（03）：599-606.

[17]林永賀，張云，房偉平，等. 投喂小雜魚與人工配合飼料對青石斑魚生長和卵巢發(fā)育的影響[J]. 廣東飼料，2010，19（07）：19-22.

[18]柳凌，郭峰，張潔明，等. 外源激素及環(huán)境因子對日本鰻鱺卵巢發(fā)育的影響[J]. 上海水產大學學報，2003，12（01）：6-11.

[19]張玉祥，杜榮斌，姜海濱，等. 人工注射催產激素對半滑舌鰨卵巢發(fā)育的影響[J]. 煙臺大學學報（自然科學與工程版），2017，30（03）：220-226.

[20]董振宇.類雄激素對麥穗魚卵巢發(fā)育的影響[J].科學養(yǎng)魚，2017，33（11）：55-57.

[21]Mylonas C C， Papandroulakis N， Smboukis A， et al.Induction of spawning of cultured greater amberjack （Seriola dumerili） using GnRHa implants[J].Aquaculture， 2004，237（1-4）：141-154.

[22]Chang J P， Peter R E .Effects of Dopamine on Gonadotropin Release in Female Goldfish， Carassius auratus[J].Neuroendocrinology， 1983，36（5）：351-357.

[23]梁祥，冷云，李光華，等. 秀麗高原鰍繁殖生物學研究[J]. 江蘇農業(yè)科學，2017，45（20）：187-189.

[24]梁祥，鐘文武，冷云，等. 秀麗高原鰍胚胎發(fā)育觀察[J]. 水產科學，2018，37（01）：79-84.

[25]梁祥，冷云，李光華，等. 秀麗高原鰍與長須鮠野生種群生存狀況[J]. 浙江農業(yè)科學，2016，57（08）：1328-1331.

[26]武祥偉，李光華，畢保良，等. 秀麗高原鰍種群生存力分析及最小可存活種群數估算[J]. 水生生物學報，2017，41（03）：543-551.