彭 勃，關(guān)樺楠，薛 悅，吳巧艷，龔德?tīng)?，?娜，劉曉飛

(哈爾濱商業(yè)大學(xué) 食品工程學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150076)

無(wú)花果(FicuscaricaLinn.)是木蘭綱(Magnoliopsida)蕁麻目(Urticales)?？?Moraceae)榕屬(Ficus)落葉灌木，高3～10 m，原產(chǎn)地中海沿岸，分布于土耳其至阿富汗，在我國(guó)唐代時(shí)從波斯傳入，現(xiàn)南北均有栽培，新疆南部尤多。無(wú)花果蛋白酶(ficin)是一種從無(wú)花果樹(shù)的乳膠和不成熟的果實(shí)乳汁中分離出的植物蛋白酶，其酶學(xué)性質(zhì)與木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶類(lèi)似，屬于巰基蛋白酶[1-2]。無(wú)花果蛋白酶具有較強(qiáng)的蛋白水解能力、凝乳、解脂和溶菌活力[3]，與動(dòng)物蛋白酶或微生物蛋白酶相比，無(wú)花果蛋白酶是可以從無(wú)花果樹(shù)乳膠中直接分離出的植物蛋白酶，其具有來(lái)源豐富、成本低、安全可靠、無(wú)毒副作用的優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用于食品、醫(yī)藥、畜牧業(yè)及生命科學(xué)研究等領(lǐng)域[4]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)對(duì)無(wú)花果蛋白酶的研究取得了可喜的進(jìn)展，研究人員發(fā)現(xiàn)無(wú)花果蛋白酶除了具有上述特征和功能外，還具有與辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)催化性質(zhì)相似的過(guò)氧化物模擬酶性質(zhì)，能夠催化H2O2產(chǎn)生羥自由基(·OH)，氧化一系列過(guò)氧化物酶底物，如3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺(3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine，TMB)、2,2′-聯(lián)氮-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽[2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate)，ABTS]、鄰苯二胺(o-phenylenediamine，OPD)，發(fā)生顯色反應(yīng)[5-8]。無(wú)花果蛋白酶作為天然植物蛋白酶，兼顧了生物催化劑和模擬酶的優(yōu)點(diǎn)，具有更加廣泛的應(yīng)用前景。

維生素C又稱(chēng)抗壞血酸，在人體各種氧化還原代謝反應(yīng)中起調(diào)節(jié)作用[9]。作為有效的抗氧化劑，維生素C可以去除體內(nèi)的活性氧和一些自由基，保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷，具有增強(qiáng)免疫功能，預(yù)防維生素C缺乏病、感冒、癌癥等功效[10-14]。維生素C不能在人體內(nèi)直接合成，必須從食物中攝入，而水果蔬菜的食用是人體維生素C的重要來(lái)源[15]。維生素C在果蔬貯存和加工中所具有的變化情況對(duì)人們的健康具有重要的影響，因此維生素C的檢測(cè)分析逐漸在食品營(yíng)養(yǎng)分析中占據(jù)著重要地位[16]。目前常規(guī)的維生素 C 的測(cè)定方法包括液相色譜法[17-18]、電化學(xué)法[19]、熒光法[20]和分光光度法[21-22]等，其中大多數(shù)方法都有昂貴精密設(shè)備和高昂成本的限制，而比色分析由于可通過(guò)肉眼識(shí)別，靈敏度高、成本低、簡(jiǎn)單、快速、實(shí)用性強(qiáng)等特點(diǎn)越來(lái)越受到人們的青睞，更適于實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)分析和快速檢測(cè)[23]。

本研究首先驗(yàn)證無(wú)花果蛋白酶的過(guò)氧化物酶模擬酶特性，再利用其模擬過(guò)氧化物酶活性構(gòu)建維生素C的檢測(cè)方法。如圖1，無(wú)花果蛋白酶具有良好的模擬過(guò)氧化物酶活性，能催化H2O2產(chǎn)生·OH，從而氧化底物ABTS，產(chǎn)生典型的綠色反應(yīng)。而維生素C具有的抗氧化性可清除自由基，從而誘導(dǎo)綠色ABTS+·還原為無(wú)色的ABTS，隨著維生素C含量的增加，綠色體系逐漸趨近于無(wú)色，依此原理建立了一種靈敏快速比色檢測(cè)維生素C的方法，為維生素C的檢測(cè)提供了一種新思路，拓寬了其在食品安全和食品分析中的應(yīng)用范圍。

圖1 無(wú)花果蛋白酶模擬過(guò)氧化物酶反應(yīng)原理Fig.1 Reaction mechanism of ficin mimetic peroxidase

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

無(wú)花果蛋白酶(50萬(wàn)U/g)，分析純，安徽酷爾生物工程有限公司；過(guò)氧化氫溶液，分析純，蘇州達(dá)江精細(xì)化工有限公司；2,2′-聯(lián)氮-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)，分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；醋酸，分析純，蘇州達(dá)江精細(xì)化工有限公司；醋酸鈉，分析純，蘇州達(dá)江精細(xì)化工有限公司；抗壞血酸，分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；維生素C泡騰片，購(gòu)自哈爾濱人民同泰醫(yī)藥連鎖。

UV2250型紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì)，上海圣科儀器設(shè)備有限公司；HWS26型電熱恒溫水浴鍋，上海向帆儀器有限公司；FA1204T型電子天平，廈門(mén)雄發(fā)儀器儀表有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1單因素優(yōu)化檢測(cè)方法

將500 μL不同濃度的H2O2溶液(1.5、1.0、0.5、0.1、0.05 mol/L)，100 μL不同濃度的無(wú)花果蛋白酶溶液(0.05、0.1、0.5、5、10 μg/mL)，200 μL ABTS(5 mmol/L)溶液和3 mL HAc-NaAc緩沖溶液(pH=4.4)依次加入具蓋離心管中，充分混勻后，將反應(yīng)體系放置于不同溫度的水浴鍋中(30、40、50、60、70 ℃)，水浴30 min后(水浴過(guò)程中每過(guò)1 min溫和倒轉(zhuǎn)1次)取出，靜置1 min，吸取上清液3 mL，以蒸餾水為空白，測(cè)定420 nm處吸光度。在反應(yīng)體系分別加入100 μL 維生素C溶液(0.5 mmol/L)，孵育不同時(shí)間間隔(10、20、30、60、120 s)再測(cè)定420 nm處吸光度。

體系指標(biāo)ΔA見(jiàn)式(1)。

ΔA=A0-A。

(1)

式(1)中，A0為不加入維生素C時(shí)420 nm處的吸光度值，A為加入維生素C后420 nm處的吸光度值，ΔA越大表示檢測(cè)效果越明顯，結(jié)果越好，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.2.2正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化檢測(cè)方法

選擇L9(34)正交設(shè)計(jì)表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，確定影響因素的主次順序及優(yōu)選方案。依次將500 μL H2O2(濃度為單因素優(yōu)化結(jié)果)，100 μL無(wú)花果蛋白酶溶液(質(zhì)量濃度為單因素優(yōu)化結(jié)果)，200 μL ABTS溶液(5 mmol/L)和3 mL的HAc-NaAc緩沖溶液加入具蓋離心管中，混勻后，將反應(yīng)體系放置于水浴鍋中(溫度為單因素優(yōu)化結(jié)果)，水浴30 min后(水浴過(guò)程中每過(guò)1 min溫和倒轉(zhuǎn)1次)取出，靜置1 min，吸取上清液3 mL，以蒸餾水為空白，測(cè)定420 nm處吸光度。在反應(yīng)體系中分別加入100 μL維生素C溶液(0.5 mmol/L)，孵育一段時(shí)間(孵育時(shí)間為單因素優(yōu)化結(jié)果)后再測(cè)定420 nm處吸光度，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.2.3檢測(cè)方法工作曲線(xiàn)、檢出限、回收率和選擇性的測(cè)定方法

在較優(yōu)條件下，將500 μL H2O2溶液，100 μL的無(wú)花果蛋白酶溶液，200 μL的ABTS(5 mmol/L)溶液和3 mL的HAc-NaAc緩沖溶液依次加入具蓋離心管中，充分混勻，水浴30 min后(水浴過(guò)程中每過(guò)1 min溫和倒轉(zhuǎn)1次)，靜置1 min，吸取上清液3 mL，以蒸餾水為空白，測(cè)定420 nm處吸光度。依次在體系中加入100 μL不同濃度的維生素C溶液(0.080、0.060、0.040、0.020、0.010、0.008、0.005、0.001 mmol/L)，孵育30 s后再測(cè)定420 nm處吸光度，根據(jù)不同濃度維生素C與吸光度差值繪制工作曲線(xiàn)，計(jì)算最低檢出限，并與天然酶催化方法進(jìn)行比較[24]。選擇濃度為0.005、0.010、0.050 mmol/L的維生素C標(biāo)準(zhǔn)液加入上述檢測(cè)體系，測(cè)定其吸光度值，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，結(jié)果取平均值帶入工作曲線(xiàn)方程，測(cè)定其回收率。

比色檢測(cè)方法的一個(gè)重要指標(biāo)就是檢測(cè)其選擇性，評(píng)估模擬酶檢測(cè)抗壞血酸體系的特異性。研究其他可能與維生素C共存物質(zhì)對(duì)檢測(cè)系統(tǒng)的影響，在體系中添加食品中常見(jiàn)的鹽類(lèi)、糖類(lèi)和氨基酸代表物質(zhì)作為干擾物質(zhì)，包括氯化鈉、氯化鈣、氯化汞、甘氨酸、葡萄糖和蔗糖，干擾物質(zhì)工作濃度為維生素C濃度的20倍(維生素C濃度為0.05 mmol/L，干擾物質(zhì)濃度為1.00 mmol/L)，ΔA作為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.4實(shí)際樣品檢測(cè)

將一片市售維生素C泡騰片溶于去離子水中，定容至100 mL，然后用去離子水將溶液稀釋10倍，檢測(cè)步驟與上述溶液檢測(cè)實(shí)驗(yàn)相同。加入不同濃度的維生素C標(biāo)準(zhǔn)液，重復(fù)測(cè)定3次，考察檢測(cè)方法的加標(biāo)回收率，并評(píng)價(jià)檢測(cè)方法的精確度和重復(fù)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 無(wú)花果蛋白酶的模擬過(guò)氧化物酶活性分析

研究表明，過(guò)氧化物酶可以利用H2O2為電子受體催化底物氧化，引起體系顏色發(fā)生變化。反應(yīng)體系中，模擬酶能夠催化H2O2與底物ABTS反應(yīng)產(chǎn)生綠色產(chǎn)物[7-8]。為了證明無(wú)花果蛋白酶具有模擬過(guò)氧化物酶的活性，本實(shí)驗(yàn)設(shè)置了不同組分的催化反應(yīng)體系，并進(jìn)行對(duì)比分析，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 無(wú)花果蛋白酶模擬過(guò)氧化物酶催化活性Fig.2 Catalytic activity of ficin mimetic peroxidase

結(jié)果表明，ficin+ABTS體系(曲線(xiàn)a)、ficin+H2O2體系(曲線(xiàn)b)、H2O2+ABTS體系(曲線(xiàn)c)溶液體系均沒(méi)有出現(xiàn)特征吸收峰，所對(duì)應(yīng)的溶液體系顏色也均為無(wú)色，說(shuō)明當(dāng)體系中只有H2O2和ABTS存在時(shí)，ABTS不會(huì)被氧化，彼此之間沒(méi)有發(fā)生任何還原反應(yīng)，而當(dāng)無(wú)花果蛋白酶分別與H2O2和ABTS存在時(shí)，也不發(fā)生任何反應(yīng)；與此同時(shí)，ficin+H2O2+ABTS體系(曲線(xiàn)d)溶液體系卻呈現(xiàn)出綠色，且ficin+H2O2+ABTS體系在波長(zhǎng)420 nm處具有明顯的特征吸收峰，該峰是由于無(wú)花果蛋白酶催化H2O2產(chǎn)生·OH從而將ABTS氧化成ABTS+·所形成的。綜上所述，只有在無(wú)花果蛋白酶、H2O2和ABTS共同存在的條件下，無(wú)花果蛋白酶可以發(fā)生模擬過(guò)氧化物酶的催化反應(yīng)。說(shuō)明無(wú)花果蛋白酶有過(guò)氧化物模擬酶的催化活性，可以專(zhuān)一的催化H2O2與底物ABTS產(chǎn)生顯色反應(yīng)。

2.2 不同因素對(duì)檢測(cè)方法的影響

無(wú)花果蛋白酶模擬過(guò)氧化物酶的催化活性受H2O2濃度、無(wú)花果蛋白酶質(zhì)量濃度、溫度和孵育時(shí)間影響，依據(jù)1.2.1節(jié)實(shí)驗(yàn)方案，進(jìn)行條件優(yōu)化，結(jié)果如圖3。由圖3(a)可知，H2O2濃度在0.05～0.5 mol/L范圍內(nèi)時(shí)，隨H2O2濃度的增加吸光度差值呈快速增加趨勢(shì)；添加量在0.5～1.5 mol/L范圍內(nèi)時(shí)，隨H2O2濃度的增加，吸光度差值逐漸下降。溶液中過(guò)量的H2O2會(huì)與維生素C發(fā)生反應(yīng)，影響自由基清除體系的響應(yīng)效果，考慮到檢測(cè)的靈敏度和精確度，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選擇0.5 moL/L H2O2進(jìn)行維生素C檢測(cè)，且在正交試驗(yàn)中選擇H2O2濃度為0.1、0.5、1.0 mol/L。

由圖3(b)可知，考察無(wú)花果蛋白酶質(zhì)量濃度對(duì)催化活性的影響。無(wú)花果蛋白酶質(zhì)量濃度在0.05～0.5 μg/mL范圍內(nèi)時(shí)，隨濃度的增加吸光度差值呈快速增加趨勢(shì)；在0.5～10 μg/mL范圍內(nèi)時(shí)，隨質(zhì)量濃度增加吸光度差值變化緩慢平穩(wěn)上升。因此選擇0.5、5、10 μg/mL參與之后的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

由圖3(c)可知，當(dāng)溫度在30～60 ℃范圍內(nèi)時(shí)，隨著催化的溫度不斷升高，吸光度差值呈上升趨勢(shì)，說(shuō)明在較寬的溫度范圍內(nèi)，模擬酶具有較好的催化效果；當(dāng)溫度在60～70 ℃范圍內(nèi)，出現(xiàn)下降趨勢(shì)，表明溫度過(guò)高會(huì)使活性減弱。在接下來(lái)的正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中，溫度取50、60、70 ℃較為適合。

由圖3(d)可知，孵育時(shí)間在10～30 s范圍內(nèi)反應(yīng)速度很快，說(shuō)明該方法具有快速的維生素C檢測(cè)響應(yīng)能力。孵育時(shí)間在30～120 s時(shí)，催化活性呈下降趨勢(shì)。結(jié)果表明，孵育時(shí)間為30 s時(shí)催化體系反應(yīng)效果基本達(dá)到最優(yōu)，且過(guò)長(zhǎng)的反應(yīng)時(shí)間不利于模擬酶催化體系應(yīng)用于快檢研究。故在正交優(yōu)化設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)時(shí)選擇孵育時(shí)間為20、30、60 s。

圖3 不同因素對(duì)無(wú)花果蛋白酶模擬酶催化活性的影響Fig.3 Effect of different factors on mimetic enzyme catalytic activity of ficin

2.3 正交試驗(yàn)優(yōu)化影響因素分析

設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)，各因素取3個(gè)合適的水平，分別以H2O2濃度為A因素，無(wú)花果蛋白酶質(zhì)量濃度為B因素，溫度為C因素，孵育時(shí)間為D因素，考察它們對(duì)反應(yīng)體系的影響。進(jìn)行正交試驗(yàn)，將波長(zhǎng)420 nm處的吸光度差值ΔA設(shè)為參考指標(biāo)，選擇L9(34)正交試驗(yàn)表，利用極差分析，獲得無(wú)花果蛋白酶模擬酶檢測(cè)維生素C體系的因素優(yōu)選方案，結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，極差分析表明影響因素由大到小依次為孵育時(shí)間、H2O2濃度、無(wú)花果蛋白酶質(zhì)量濃度、溫度。通過(guò)極差分析確定的較優(yōu)方案組合為A2B1C2D3，即H2O2濃度0.5 mol/L，無(wú)花果蛋白酶質(zhì)量濃度0.5 μg/mL，溫度50 ℃，孵育時(shí)間30 s。以正交結(jié)果較優(yōu)方案進(jìn)行維生素C檢測(cè)，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，吸光度差值平均值為0.636，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.17%。

表1 正交試驗(yàn)結(jié)果分析Tab.1 Analysis of orthogonal experiment results

2.4 檢測(cè)方法工作曲線(xiàn)的構(gòu)建與檢出限分析

配置不同濃度的維生素C溶液，在最優(yōu)反應(yīng)條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可知，吸光度差值與體系中維生素C濃度成正比。維生素C濃度在0.001～0.080 mmol/L范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線(xiàn)性關(guān)系，線(xiàn)性回歸方程為y=7.381x+0.109 1，相關(guān)系數(shù)R2值為0.992 3，檢出限為0.43 μmol/L，說(shuō)明此基于無(wú)花果蛋白酶模擬酶性質(zhì)檢測(cè)維生素C的檢測(cè)方法靈敏度高。

插圖中反應(yīng)瓶由左至右是建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)選取的8個(gè)由低到高維生素C樣品濃度的測(cè)試結(jié)果。圖4 維生素C檢測(cè)方法工作曲線(xiàn)Fig.4 Working curve of vitamin C detection method

2.5 維生素C檢測(cè)方法抗干擾性研究

比色檢測(cè)方法的一個(gè)重要指標(biāo)就是檢測(cè)其抗干擾性，評(píng)估模擬酶檢測(cè)維生素C體系的特異性和選擇性。研究其他可能與維生素C共存物質(zhì)對(duì)檢測(cè)系統(tǒng)的影響，體系中添加干擾物質(zhì)包括葡萄糖、蔗糖、甘氨酸、氯化鈉、氯化鈣和氯化汞，ΔA作為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果見(jiàn)圖5。由圖5可知，當(dāng)維生素C存在時(shí)，吸光度強(qiáng)度有顯著變化，而其他干擾物質(zhì)工作濃度為維生素C濃度的20倍，卻不能產(chǎn)生任何明顯的吸光度變化，這是因?yàn)榫S生素C能將綠色ABTS+·還原為無(wú)色的ABTS。因此，基于比色系統(tǒng)檢測(cè)維生素C的方法具有極好的選擇性。

圖5 維生素C檢測(cè)方法的選擇性Fig.5 Selectiveness of vitamin C detection method

2.6 檢測(cè)方法回收率與實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果

以最優(yōu)工藝條件，選擇濃度為0.005、0.010、0.050 mmol/L的維生素C溶液進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)，得出回收率分別為95.59%、104.88%和90.05%，反映出所創(chuàng)建的方法對(duì)維生素C檢測(cè)精確度高、重現(xiàn)性和穩(wěn)定性好。雖然該檢測(cè)系統(tǒng)在測(cè)定維生素C標(biāo)準(zhǔn)溶液時(shí)具有較高的精確度，為驗(yàn)證其對(duì)較復(fù)雜的真實(shí)樣品中維生素C的準(zhǔn)確測(cè)量，探究其對(duì)樣品中不同濃度維生素C的加標(biāo)回收率和精密度，通過(guò)測(cè)定維生素C泡騰片濃度，進(jìn)一步評(píng)價(jià)了該方法的可靠性。通過(guò)在維生素C泡騰片溶液中加入標(biāo)準(zhǔn)維生素C溶液，進(jìn)行了維生素C的回收實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，平均回收率在95%～105%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差低于2.57%，表明此法可以快速、可靠地應(yīng)用于大量樣品的分析。構(gòu)建的檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)成本低，為維生素C檢測(cè)提供了一種新思路，具有很大的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

3 結(jié) 論

無(wú)花果蛋白酶作為過(guò)氧化物模擬酶，能夠催化ABTS+H2O2的顯色反應(yīng)，而維生素C的強(qiáng)抗氧化性能清除自由基，使溶液由綠色變回?zé)o色。基于無(wú)花果蛋白酶的過(guò)氧化物模擬酶性質(zhì)建立維生素C的比色法檢測(cè)方法，反應(yīng)過(guò)程不需要復(fù)雜的合成和修飾過(guò)程，不用引入有機(jī)溶劑或重金屬，綠色環(huán)保，可視化分析結(jié)果。該方法靈敏度高，選擇性好，且適用于實(shí)際樣品中維生素C的測(cè)定，表明無(wú)花果蛋白酶在檢測(cè)維生素C含量方面潛在的應(yīng)用價(jià)值，有利于促進(jìn)無(wú)花果蛋白酶模擬酶性質(zhì)在食品分析、醫(yī)藥診斷和生物化學(xué)方面的應(yīng)用。