殷麗青,邵雅東,李青竹,張永春,孫 翊,蔡友銘?

(1上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院,上海201403;2長江大學(xué)園藝園林學(xué)院,荊州434025)

石蒜是石蒜科石蒜屬球根花卉,是優(yōu)良的觀賞和藥用植物,有時(shí)石蒜也會(huì)特指其中一個(gè)最為常見的種——紅花石蒜(Lycoris radiata)。我國作為石蒜的主要產(chǎn)地,已有1 500多年的石蒜栽培歷史,在全球已發(fā)現(xiàn)的20多種石蒜屬植物中,有12種為我國特有[1-4]。

石蒜是一種重要的園林植物,花型優(yōu)美,花色有紅色、白色、黃色及復(fù)色,具耐濕、耐旱、耐陰等優(yōu)良特性。此外,石蒜鱗莖中含有大量的石蒜堿,具有抗菌、保護(hù)心血管、抗病毒和抑制腫瘤的效應(yīng),而石蒜鱗莖中的加蘭他敏對(duì)阿爾茲海默癥和小兒麻痹癥具有特殊的療效[5-6],因此藥物市場(chǎng)對(duì)石蒜成株的需求日益增加。

在自然栽培中,石蒜依靠鱗莖分球和種子進(jìn)行繁殖,自然繁殖能力弱,石蒜野外資源的采集已遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足市場(chǎng)的需求[1]。組織培養(yǎng)技術(shù)是解決植物繁殖困難最為有效的方法之一。有關(guān)石蒜屬植物的組織培養(yǎng)研究國內(nèi)外已有一些報(bào)道,并取得了一定的進(jìn)展,但主要集中在石蒜(即紅花石蒜)[7-8]和忽地笑[9-10]這2個(gè)種,在其他石蒜種如換錦花[11]、乳白石蒜[12-13]、中國石蒜[14-15]、長筒石蒜[16-17]等也有少量報(bào)道,然而多種石蒜屬植物的組織培養(yǎng)快速繁殖還存在著一定的困難。本文對(duì)石蒜屬植物組織培養(yǎng)研究進(jìn)展進(jìn)行回顧與總結(jié),重點(diǎn)探討植物生長調(diào)節(jié)劑對(duì)石蒜屬植物組織培養(yǎng)不同階段的作用及影響,對(duì)存在的問題及解決方法進(jìn)行分析,并對(duì)其組織培養(yǎng)研究的前景和發(fā)展方向提出展望,旨在為石蒜屬植物的組織培養(yǎng)研究、分子育種工程及其產(chǎn)業(yè)化發(fā)展提供參考。

1 石蒜屬植物組織培養(yǎng)研究概況

我國石蒜屬植物組織培養(yǎng)成功獲得再生植株的研究最早報(bào)道于1986年,魯雪華等[18]以忽地笑(Lycoris aurea)未成熟的種胚進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)得到再生植株。數(shù)年后,董慶華等[19]以紅花石蒜的鱗芽進(jìn)行組織培養(yǎng)獲得成功;此后,姚麗娟等[11]、郭兆武等[20]報(bào)道了不同種石蒜的組織培養(yǎng),比較了不同外植體及植物生長調(diào)節(jié)劑的配比對(duì)石蒜組培的影響。在前人的努力下,石蒜屬植物組織培養(yǎng)研究獲得了較大的進(jìn)展(表1)。

表1 石蒜屬植物組織培養(yǎng)名錄Table 1 List of tissue culture of Lycoris

(續(xù)表1)

2 基因型和外植體對(duì)石蒜屬植物組織培養(yǎng)的影響

基因型是影響石蒜屬植物組培成功與否的重要因素,從已有報(bào)道分析,紅花石蒜和忽地笑(因開黃花,一些文獻(xiàn)中稱其黃花石蒜)組培相對(duì)容易,已有較多成功的報(bào)道[9,27]。此外,中國石蒜、乳白石蒜、換錦花、長筒石蒜和稻草石蒜等也有少量組培研究初步成功的報(bào)道。石蒜屬植物組培一般選用鱗莖或雙鱗片作為外植體,也有一些研究使用花器官、葉片或種胚作為外植體。外植體的選擇對(duì)誘導(dǎo)效果具有顯著的影響,也是提高誘導(dǎo)率的關(guān)鍵因素之一,外植體的類型、取材部位、生理狀況及生長時(shí)期都會(huì)影響誘導(dǎo)的成功率。有報(bào)道顯示,石蒜屬植物種胚培養(yǎng)效果最好[15,29,34],中國石蒜、換錦花種胚的培養(yǎng)效果顯著優(yōu)于鱗莖和葉片組織,其不定芽誘導(dǎo)率最高可達(dá)100%。但是,石蒜屬植物的種胚來源有限,鱗莖或鱗片取材相對(duì)容易,使用其鱗莖或鱗片進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)也可獲得良好效果[13,16,28]。其次,石蒜屬植物葉片也是不錯(cuò)的外植體選擇[17,29],相對(duì)于其他外植體而言,葉片取材方便,消毒容易,幼嫩組織具有較強(qiáng)的分生能力,比成熟組織更加適合作為外植體。時(shí)劍等[29]用幼嫩葉段進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)獲得了良好的效果,后續(xù)培養(yǎng)還獲得了不定芽和小鱗莖。此外,花絲、花藥、雌蕊、花軸、花被、花梗和子房等花器官也可作為外植體。陳菁玨[24]以花梗作外植體進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng),獲得88.89%的愈傷組織誘導(dǎo)率;穆紅梅等[14]以花軸為外植體進(jìn)行小鱗莖誘導(dǎo)培養(yǎng),誘導(dǎo)率接近90%?？梢?石蒜屬植物的花軸也是其組織培養(yǎng)的優(yōu)選外植體之一?？傊?在石蒜屬植物組培中,外植體選擇除常用的鱗莖或鱗片外,一些幼嫩的葉片和花器官也可作為外植體進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng),以葉片作外植體的誘導(dǎo)快繁更具有應(yīng)用價(jià)值,其不損傷鱗莖,在珍稀種質(zhì)保存與擴(kuò)繁中具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。

3 植物生長調(diào)節(jié)劑對(duì)石蒜屬植物組織培養(yǎng)的影響

植物生長調(diào)節(jié)劑在培養(yǎng)基中含量極低,但對(duì)植物組培成功與否至關(guān)重要,其對(duì)植物生長、發(fā)育具有顯著作用,可直接影響外植體的分化和再生。石蒜屬植物組織培養(yǎng)過程中,不同階段對(duì)植物生長調(diào)節(jié)劑的種類和濃度需求不同。

3.1 植物生長調(diào)節(jié)劑對(duì)石蒜屬植物愈傷組織誘導(dǎo)的影響

植物組織培養(yǎng)中誘導(dǎo)愈傷組織最常用的植物生長調(diào)節(jié)劑是2,4-D。前人研究表明[15,35-36],以黃花石蒜種胚為外植體,培養(yǎng)于MS+2,4-D 2.0 mg∕L培養(yǎng)基中,誘導(dǎo)愈傷組織效果良好,誘導(dǎo)率達(dá)80%;如果以鱗莖為外植體,使用相同的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)時(shí),其誘導(dǎo)率僅為66.6%,這可能是由于鱗莖對(duì)單一施用2,4-D的響應(yīng)較弱造成的。因此,以鱗莖為外植體進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)時(shí),需要不同植物生長調(diào)節(jié)劑的聯(lián)合使用才能獲得較好的效果。研究表明,6-BA(0.5—5.0 mg∕L)和2,4-D(0.5—2.0 mg∕L)聯(lián)合使用對(duì)鱗莖的誘導(dǎo)效果較好,中國石蒜的雙鱗片(帶基盤)誘導(dǎo)愈傷組織的最佳培養(yǎng)基是MS+6-BA 0.5 mg∕L+2,4-D 2.0 mg∕L,愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)78.66%,而乳白石蒜采用前述相同材料誘導(dǎo)愈傷組織的最佳培養(yǎng)基是MS+6-BA 1.0 mg∕L+2,4-D 2.0 mg∕L,誘導(dǎo)率達(dá)75.03%[13]。周建輝等[23]以紅花石蒜鱗片誘導(dǎo)愈傷組織,不同濃度的6-BA和2,4-D聯(lián)合使用均能誘導(dǎo)出愈傷組織,而MS+6-BA 1 mg∕L+2,4-D 1 mg∕L聯(lián)合使用最佳。對(duì)比培養(yǎng)時(shí)間,使用MS+2,4-D 2.0 mg∕L培養(yǎng)基進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)30 d后可進(jìn)行統(tǒng)計(jì),而6-BA(0.5—5.0 mg∕L)和2,4-D(0.5—2.0 mg∕L)聯(lián)合使用培養(yǎng)40—45 d可進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。筆者分析認(rèn)為,隨著培養(yǎng)時(shí)間的推移,石蒜愈傷組織誘導(dǎo)率會(huì)有所提高,但后期(培養(yǎng)1個(gè)月以后)形成的愈傷組織質(zhì)量差于前期(培養(yǎng)1個(gè)月內(nèi))。目前,未見相同植物生長調(diào)節(jié)劑條件下,進(jìn)行不同培養(yǎng)時(shí)間的對(duì)比試驗(yàn)?？傮w上說,不同植物生長調(diào)節(jié)劑的聯(lián)合使用比單一植物生長調(diào)節(jié)劑的使用效果更好。6-BA和2,4-D的復(fù)合效應(yīng)對(duì)不同的外植體誘導(dǎo)愈傷組織也具有較大的差異。研究表明,6-BA和2,4-D聯(lián)合使用誘導(dǎo)率以種胚最高,其在MS+2,4-D 1.0 mg∕L+6-BA 1.0 mg∕L培養(yǎng)基上培養(yǎng)20 d后,愈傷組織誘導(dǎo)率可達(dá)82.4%;鱗莖次之,為26.1%;而葉片在最適的MS+2,4-D 2.0 mg∕L+6-BA 1.0 mg∕L培養(yǎng)基上最高誘導(dǎo)率僅為5.0%[37]。此外,換錦花和忽地笑的花梗、子房、花被、花絲和雌蕊分別接種在MS+6-BA+2,4-D培養(yǎng)基上培養(yǎng)8周后,均可以誘導(dǎo)愈傷組織,換錦花愈傷組織誘導(dǎo)效果最好的是MS+6-BA 1 mg∕L+2,4-D 1 mg∕L培養(yǎng)基,其中花梗作外植體效果最好,愈傷組織誘導(dǎo)率最高為64.7%;忽地笑愈傷組織誘導(dǎo)效果最好的為MS+6-BA 2 mg∕L+2,4-D 2 mg∕L培養(yǎng)基,4種外植體(除雌蕊外)均可以誘導(dǎo)出愈傷組織,其中花梗和子房的愈傷組織誘導(dǎo)率大于60.0%[38]?？梢?6-BA和2,4-D的聯(lián)合使用并不適用于所有外植體。因此,其他外源激素也成為研究重點(diǎn),將苯基脲類衍生物(TDZ)應(yīng)用于石蒜屬植物的組織培養(yǎng),以葉片為外植體誘導(dǎo)培養(yǎng),獲得了較高的愈傷組織誘導(dǎo)率[17],但愈傷組織非胚性,質(zhì)量較差,不能獲得小鱗莖或不定芽。在石蒜屬植物的組織培養(yǎng)中,僅有較高的愈傷組織誘導(dǎo)率是不夠的,應(yīng)該更關(guān)注愈傷組織的質(zhì)量,其中胚性愈傷組織的比例和顆粒性對(duì)其分化再生植株具有較大的影響。根據(jù)筆者多年經(jīng)驗(yàn),在植物組織培養(yǎng)中,獲得良好的愈傷組織后應(yīng)及時(shí)轉(zhuǎn)接分化,否則會(huì)影響其質(zhì)量,失去胚性而影響分化率。在具體研究中,可以通過植物生長調(diào)節(jié)劑種類濃度及配比的篩選、增加微量元素含量、提高培養(yǎng)基糖濃度等途徑改善愈傷組織狀態(tài),提高胚性愈傷組織的比例和顆粒性,從而提高植株再生率[39]。

3.2 植物生長調(diào)節(jié)劑對(duì)石蒜屬植物不定芽或小鱗莖形成的影響

石蒜屬植物不定芽的形成主要有2種途徑,即外植體直接誘導(dǎo)產(chǎn)生或通過愈傷組織分化形成。不定芽誘導(dǎo)主要以MS作基本培養(yǎng)基,常見的植物生長調(diào)節(jié)劑組合為6-BA和NAA,6-BA常用質(zhì)量濃度范圍為1.0—5.0 mg∕L,NAA常用質(zhì)量濃度范圍是0.1—2.0 mg∕L。不同種的石蒜對(duì)植物生長調(diào)節(jié)劑的響應(yīng)具有較大的差異,姚麗娟等[11]研究表明,紅花石蒜、忽地笑、換錦花3個(gè)種誘導(dǎo)不定芽的最適植物生長調(diào)節(jié)劑組合分別是6-BA 3 mg∕L+NAA 0.2 mg∕L、6-BA 6 mg∕L+NAA 0.2 mg∕L和6-BA 5 mg∕L+NAA 0.1 mg∕L,不定芽誘導(dǎo)率分別達(dá)78.0%、76.9%和55.6%,其中紅花石蒜所需6-BA濃度最低,而不定芽誘導(dǎo)率最高。楊曦[13]以中國石蒜與乳白石蒜帶基盤鱗片為外植體進(jìn)行相關(guān)研究認(rèn)為,中國石蒜與乳白石蒜誘導(dǎo)不定芽的最適植物生長調(diào)節(jié)劑組合分別是6-BA 1.0 mg∕L+NAA 0.2 mg∕L和6-BA 1.0 mg∕L+NAA 0.1 mg∕L,培養(yǎng)45 d后,其不定芽誘導(dǎo)率分別達(dá)88.3%和96.7%。劉志高等[12]以乳白石蒜鱗莖為材料進(jìn)行不定芽誘導(dǎo),培養(yǎng)50 d后,其結(jié)果與楊曦[13]相似,最高不定芽誘導(dǎo)率達(dá)100%。由此可見,在培養(yǎng)時(shí)間較一致時(shí),不定芽誘導(dǎo)所需植物生長調(diào)節(jié)劑濃度和配比受基因型影響較大。此外,外植體種類不同,所需的植物生長調(diào)節(jié)劑最適濃度與配比也不同,一般認(rèn)為,幼嫩組織對(duì)于外源激素的敏感性強(qiáng)于成熟組織。郭兆武等[20]以黃花石蒜為材料,以不同外植體進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)時(shí)發(fā)現(xiàn),不同外植體對(duì)植物生長調(diào)節(jié)劑濃度的響應(yīng)不同,其最適濃度的誘導(dǎo)率也具有一定差異,其中帶底盤雙內(nèi)層鱗片、帶底盤雙中層鱗片的培養(yǎng)效果在MS+NAA 5.0 mg∕L+6-BA 10.0 mg∕L和MS+NAA 10.0 mg∕L+6-BA 5.0 mg∕L兩種培養(yǎng)基上較其他外植體好。穆紅梅等[14]等報(bào)道,以中國石蒜的花軸為外植體進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)時(shí),MS+6-BA 5.0—7.0 mg∕L+NAA 0.5 mg∕L培養(yǎng)基的誘導(dǎo)率最高,近90%。除常用的6-BA和NAA之外,還有少量報(bào)道采用其他植物生長調(diào)節(jié)劑誘導(dǎo)石蒜屬植物不定芽的發(fā)生,如2,4-D、IAA及KT。有學(xué)者以紅花石蒜的鱗莖為外植體,在MS+IAA 0.1 mg∕L+6-BA 10.0 mg∕L+KT 0.1 mg∕L培養(yǎng)基上誘導(dǎo)不定芽的產(chǎn)生,培養(yǎng)6周后,其誘導(dǎo)增殖率達(dá)3.88[8]。紅花石蒜通過愈傷組織分化不定芽,在MS+6-BA 1.0 mg∕L+2,4-D 1.0 mg∕L培養(yǎng)基上效果最好,不定芽分化率為76.2%[37]?？傊?石蒜屬植物不定芽培養(yǎng)適宜的植物生長調(diào)節(jié)劑種類和濃度配比因基因型和外植體種類不同而異,一般選用6-BA和NAA聯(lián)合應(yīng)用。也有報(bào)道認(rèn)為,外植體可直接誘導(dǎo)獲得小鱗莖,如稻草石蒜在MS+6-BA 5.0 mg∕L+NAA 0.1 mg∕L上誘導(dǎo)培養(yǎng)效果最好,小鱗莖誘導(dǎo)率為75%[31]。

3.3 植物生長調(diào)節(jié)劑對(duì)石蒜屬植物繼代增殖的影響

增殖系數(shù)(增殖率)是體現(xiàn)植物組織培養(yǎng)效率的最關(guān)鍵指標(biāo)之一,在植物繼代增殖過程中,在一定濃度范圍內(nèi),其增殖系數(shù)隨著植物生長調(diào)節(jié)劑濃度增加而提高,但濃度過高容易形成玻璃苗或發(fā)生變異。石蒜屬植物繼代增殖培養(yǎng)常用的基本培養(yǎng)基為MS,植物生長調(diào)節(jié)劑組合是6-BA+NAA或6-BA+2,4-D,也有少數(shù)報(bào)道用其他植物生長調(diào)節(jié)劑如KT、IAA和TDZ。前人研究表明,NAA和2,4-D的濃度差異會(huì)顯著影響球根類花卉組織培養(yǎng)的效果[40]。石蒜和中國石蒜以帶基盤雙鱗片為外植體誘導(dǎo)的小鱗莖,增殖培養(yǎng)的最適植物生長調(diào)節(jié)劑是6-BA 0.5 mg∕L+2,4-D 1.0 mg∕L,增殖率分別可達(dá)543%和515%[34];紅花石蒜以鱗莖誘導(dǎo)的不定芽進(jìn)行增殖培養(yǎng)的適宜植物生長調(diào)節(jié)劑是6-BA 8.0 mg∕L+NAA 2.0 mg∕L,增殖率高達(dá)550%[24];香石蒜不定芽增殖的適宜植物生長調(diào)節(jié)劑是6-BA 5.0 mg∕L+NAA 0.5 mg∕L,增殖系數(shù)為3.3[32]。綜上,NAA與2,4-D在石蒜增殖培養(yǎng)時(shí),其效應(yīng)并沒有明顯的差異。此外,KT、IAA和TDZ在石蒜屬植物增殖培養(yǎng)方面也有應(yīng)用,裸體石蒜鱗莖增殖的適宜植物生長調(diào)節(jié)劑是6-BA 1.5 mg∕L+IAA 1.5 mg∕L,增殖系數(shù)為3.0[30]。長筒石蒜的不定芽培養(yǎng)于含6-BA 5.0 mg∕L+NAA 0.1 mg∕L和6-BA 5.0 mg∕L+ZT 0.5 mg∕L的MS培養(yǎng)基進(jìn)行增殖培養(yǎng),增殖率分別高達(dá)480%和454%[16]。馬建軍[41]研究發(fā)現(xiàn),在含NAA 1 mg∕L的MS培養(yǎng)基上,添加0.5—2.0 mg∕L的TDZ進(jìn)行石蒜和中國石蒜鱗莖的增殖培養(yǎng),鱗莖增殖系數(shù)隨著TDZ濃度的提高而提高,石蒜最佳增殖培養(yǎng)的植物生長調(diào)節(jié)劑組合是6-BA 3.0 mg∕L+TDZ 0.5 mg∕L+NAA 1 mg∕L,中國石蒜最佳增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA 4.0 mg∕L+TDZ 0.5 mg∕L+NAA 1 mg∕L,兩者的增殖系數(shù)分別為2.69和2.77。綜上所述,石蒜屬植物增殖培養(yǎng)使用的培養(yǎng)基為MS,不同組織的增殖培養(yǎng)需要的生長調(diào)節(jié)劑濃度具有較大差異,復(fù)合應(yīng)用植物生長調(diào)節(jié)劑的效果優(yōu)于單一使用,而使用TDZ等其他植物生長調(diào)節(jié)劑與6-BA、2,4-D和NAA相比,沒有顯著優(yōu)勢(shì)。

3.4 植物生長調(diào)節(jié)劑對(duì)石蒜屬植物生根培養(yǎng)的影響

已有研究顯示,石蒜屬植物的生根培養(yǎng)一般以MS或1∕2MS為基本培養(yǎng)基,應(yīng)用的植物生長調(diào)節(jié)劑為NAA或IBA,也有兩者聯(lián)合應(yīng)用,還有復(fù)合應(yīng)用NAA或IBA添加低濃度6-BA的。前人研究表明[11,25],紅花石蒜的小鱗莖或不定芽在含有NAA 0.5—2.0 mg∕L的培養(yǎng)基上生根率較高,根多且粗壯。朱景存等[22]和何樹蘭等[8]分別報(bào)道,在含適量NAA(0.8—1.0 mg∕L)的MS培養(yǎng)基中添加6-BA 0.5 mg∕L對(duì)紅花石蒜不定芽誘導(dǎo)生根培養(yǎng)可獲得較好的生根效果;乳白石蒜小鱗莖在含6-BA 1.0 mg∕L+NAA 2.0 mg∕L的MS培養(yǎng)基上能形成發(fā)達(dá)根系[12],表明外源激素的聯(lián)合使用可以有效增加紅花石蒜的生根率。陳娜等[42]以MS為基本培養(yǎng)基,比較了IBA和NAA聯(lián)合應(yīng)用于石蒜小鱗莖誘導(dǎo)生根的效果,結(jié)果顯示NAA 0.5 mg∕L+IBA 1 mg∕L比NAA 0.5 mg∕L+IBA 0.5 mg∕L組合生根率高,且不定根生長狀態(tài)較好,與NAA同時(shí)使用較高濃度的IBA會(huì)降低石蒜小鱗莖根系誘導(dǎo)率,表明石蒜類植物對(duì)于生長素類物質(zhì)的聯(lián)合使用較為敏感,需要控制生長素類用量。石蒜屬植物對(duì)NAA的響應(yīng)一般高于IBA,使用的NAA濃度一般較低便可誘導(dǎo)生根。朱錦等[7]比較了相同培養(yǎng)時(shí)間下(2—4周)NAA和IBA對(duì)石蒜生根的影響,發(fā)現(xiàn)NAA比IBA的誘導(dǎo)生根效果更為顯著,低濃度的IBA對(duì)石蒜的生根誘導(dǎo)較差,而小鱗莖對(duì)NAA的濃度要求不嚴(yán)格。黃花石蒜的小鱗莖在MS+IBA 2.0 mg∕L培養(yǎng)基進(jìn)行生根培養(yǎng)后,其根系生長健壯,質(zhì)地較好[10],而野生石蒜不定芽使用MS+NAA 0.5 mg∕L進(jìn)行生根誘導(dǎo)時(shí),生根率達(dá)92%,根多且粗壯[33]。此外,楊曦[13]以中國石蒜和乳白石蒜為材料,比較了KT和6-BA與NAA聯(lián)合應(yīng)用于生根的效果,發(fā)現(xiàn)小鱗莖在含KT 0.5 mg∕L+NAA 0.5 mg∕L MS培養(yǎng)基上的生根效果優(yōu)于6-BA 0.5 mg∕L+NAA 0.5 mg∕L培養(yǎng)基,具體表現(xiàn)為生根時(shí)間短、生根多、根系健壯?？傊?石蒜屬植物可利用MS或1∕2MS培養(yǎng)基進(jìn)行生根培養(yǎng),生長調(diào)節(jié)劑使用質(zhì)量濃度以0.5—2.0 mg∕L為多。較低質(zhì)量濃度(0.5 mg∕L)的細(xì)胞分裂素類(KT或6-BA)與生長素類(NAA)聯(lián)合應(yīng)用也可用于部分石蒜屬植物的生長及誘導(dǎo)生根,效果良好。

4 其他影響石蒜屬植物組織培養(yǎng)的因子

4.1 再生途徑

植物組織培養(yǎng)離體再生類型有器官發(fā)生途徑和體細(xì)胞胚發(fā)生途徑兩種,石蒜屬植物的離體再生主要以器官發(fā)生較為常見。器官發(fā)生途徑又分為直接途徑和間接途徑,直接發(fā)生途徑是外植體直接誘導(dǎo)形成不定芽和不定根的過程;間接發(fā)生途徑是外植體先脫分化形成愈傷組織,愈傷組織經(jīng)過再分化形成不定芽的過程。石蒜屬植物組培的直接發(fā)生途徑是近年來的研究重點(diǎn)[27-28],由種胚或帶鱗莖盤的鱗片通過直接發(fā)生途徑比間接途徑形成不定芽或小鱗莖更高效,且不容易產(chǎn)生變異。

4.2 預(yù)處理

污染是組織培養(yǎng)中常見的問題,鱗莖是石蒜屬植物組織培養(yǎng)的主要外植體之一,其自帶病菌多而雜,是造成污染的主要原因之一,在消毒前應(yīng)徹底清洗后再流水沖洗。組織培養(yǎng)中常用的外植體消毒劑主要有酒精、升汞、過氧化氫和次氯酸鈉等。0.1%的升汞滅菌效果最好,且與吐溫吸附劑聯(lián)合使用效果更佳,然而升汞殺傷力強(qiáng),易造成植株死亡,需要根據(jù)外植體幼嫩程度和帶菌情況把握消毒時(shí)間。使用熱處理和低溫冷藏對(duì)外植體進(jìn)行預(yù)處理對(duì)減少或控制病菌也具有一定效果[24]。此外,在接種前將球莖放入冰箱冷藏,也有利于提高外植體的分化能力,提高成活率[43]。

4.3 培養(yǎng)條件

石蒜屬植物組培一般采用1∕2MS或MS為基本培養(yǎng)基,pH 5.3—5.8,添加3%蔗糖和0.7%瓊脂進(jìn)行培養(yǎng)。不同的蔗糖濃度對(duì)石蒜屬植物組織培養(yǎng)的效果也有一定影響。姚麗娟等[11]研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)蔗糖濃度為3%—6%時(shí),紅花石蒜小鱗莖質(zhì)量隨蔗糖濃度的提高而增加,在蔗糖濃度為6%時(shí),獲得最高倍數(shù)的生長量,繼續(xù)提高蔗糖濃度小鱗莖質(zhì)量逐漸下降。除蔗糖外,其他有機(jī)成分也具有十分重要的研究價(jià)值,在培養(yǎng)基中附加硅藻土和酵母粉對(duì)黃花石蒜的出芽具有促進(jìn)作用,而加入土豆、香蕉、水解酪蛋白和活性炭后出現(xiàn)抑制作用,其中活性炭的抑制作用較為顯著[27],但在生根培養(yǎng)基中加入活性炭,有利于促進(jìn)小鱗莖生根[21],這可能與活性炭會(huì)吸附部分營養(yǎng)物質(zhì)和植物生長調(diào)節(jié)劑,降低了培養(yǎng)基的外源激素水平有關(guān)。此外,光照條件對(duì)石蒜屬植物不定芽的形成也有一定調(diào)節(jié)作用。呂玉華等[27]研究發(fā)現(xiàn),紅花石蒜在800—1 200 lx光照條件下培養(yǎng)16 h比24 h全黑暗條件下出芽率更高,且出芽較早;但是光照下的外植體極易褐變,而采用暗培養(yǎng)可有效降低褐變率[29]。此外,溫度也是影響石蒜屬植物組培效率的因子之一,石蒜屬植物常規(guī)的組織培養(yǎng)適宜溫度為25℃左右,目前未見不同培養(yǎng)溫度對(duì)石蒜屬植物組織培養(yǎng)影響的報(bào)道。筆者在研究中發(fā)現(xiàn),稍低溫度(22—24℃)條件下形成的愈傷組織生長速度低于稍高溫度(26—28℃)條件,但前者形成的愈傷組織質(zhì)地優(yōu)于后者。此外,有研究顯示,低溫處理有利于外植體的分化,鱗莖在4—8℃下冷藏6—8周,褐化率降低,誘導(dǎo)率提高[8,11,43]。

5 存在的問題及解決方法

5.1 外植體消毒困難,污染率高

外植體的無菌化處理是影響植物組織培養(yǎng)成功與否的首要因素。石蒜屬植物組培中常用的外植體是鱗莖,采用花器官、葉片及種胚等作為外植體的研究較少[2],而鱗莖常年生長于土壤中,帶有數(shù)量較高和種類眾多的微生物,很難進(jìn)行消毒處理,尤其是霉菌類微生物很難徹底滅菌。采用以下方法可提高外植體滅菌效果,降低污染率:根據(jù)外植體的幼嫩程度選擇適宜的消毒劑種類,并依據(jù)外植體帶菌情況確定消毒劑的濃度及消毒時(shí)間;土壤中的鱗莖類外植體,開始消毒前進(jìn)行較長時(shí)間(2—4 h)的流水沖洗;在消毒劑中添加吐溫可以提高消毒劑的滲透率;培養(yǎng)基中添加抗生素有利于控制微生物的發(fā)生;將鱗莖進(jìn)行低溫冷藏可降低其攜帶的微生物的活力,提高殺菌的效果;采用多次消毒法、在植物生長旺盛期取材等措施對(duì)控制外植體污染也有一定效果[22,35]。此外,鱗莖類外植體不同部位的帶菌數(shù)量差異較大,內(nèi)層鱗片＜中層鱗片＜外層鱗片,滅菌效果也從強(qiáng)至弱;稍嫩的葉片和花器官等外植體帶菌率較低,無菌化處理相對(duì)比較容易,有利于提高外植體無菌化處理的效率。

5.2 繁殖系數(shù)低,小鱗莖生長緩慢

在石蒜屬植物組織培養(yǎng)中,還存在著繁殖系數(shù)低,小鱗莖生長緩慢的問題[44]。提高其繁殖系數(shù)和促進(jìn)小鱗莖的膨大是提高石蒜屬植物組織培養(yǎng)效率的關(guān)鍵。適當(dāng)提高培養(yǎng)基中植物生長調(diào)節(jié)劑濃度,并將細(xì)胞分列素類與生長素類聯(lián)合使用,對(duì)提高增殖系數(shù)具有一定作用。此外,葉面噴施氯吡苯脲(CPPU)、氯化膽堿(CC)、水楊酸(SA)等植物生長調(diào)節(jié)劑,對(duì)小鱗莖膨大均有一定促進(jìn)作用[45]。在石蒜屬植物的組織培養(yǎng)中也可嘗試在培養(yǎng)基中添加上述植物生長調(diào)節(jié)劑促進(jìn)小鱗莖的膨大。蔗糖是植物組織培養(yǎng)中應(yīng)用最廣泛的碳源[46],適當(dāng)提高蔗糖濃度對(duì)石蒜屬植物小鱗莖膨大也有一定的促進(jìn)作用。此外,劉志高等[12]研究發(fā)現(xiàn),在乳白石蒜的小鱗莖增殖時(shí),通過適當(dāng)切割小鱗莖可以縮短培養(yǎng)周期且不影響增殖效果。

6 展望

石蒜屬植物作為一種獨(dú)特的兼園林景觀和藥用于一體的多功能花卉,其野生資源遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足市場(chǎng)需要,種球的增殖技術(shù)是該類植物產(chǎn)業(yè)化開發(fā)的關(guān)鍵。利用組織培養(yǎng)技術(shù)快速繁殖石蒜屬植物優(yōu)質(zhì)種苗是目前盡快滿足市場(chǎng)需求的有效途徑,組培技術(shù)是種質(zhì)保存(超低溫保存)、誘變育種及遺傳轉(zhuǎn)化的基礎(chǔ)。有關(guān)石蒜屬植物的遺傳工程研究已有少量報(bào)道,虞劍平等[47]使用農(nóng)桿菌將nos基因轉(zhuǎn)入石蒜花莖幼嫩部位,并成功檢測(cè)到胭脂堿,但相關(guān)的轉(zhuǎn)基因研究未見報(bào)道,僅有部分遺傳分析和基因表達(dá)的研究[48-50]。在百合等其他球根花卉上的基因標(biāo)記分類、基因表達(dá)和獲得轉(zhuǎn)基因植株等方面已有較為深入的研究[51-52],這也是日后石蒜屬植物研究的方向之一,而建立完善的組培再生體系是石蒜屬植物遺傳轉(zhuǎn)化研究的基礎(chǔ)?；谑鈱僦参锟捎糜谒幬镩_發(fā)的巨大前景,加快其組織培養(yǎng)技術(shù)和工廠化育苗體系的建立,可促進(jìn)藥用植物資源的規(guī)模化和標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)。今后在石蒜屬植物組培的研究中應(yīng)積極開展組培未獲成功種的探索,在外植體選擇上不局限于常見的石蒜外植體,通過改變消毒方法和培養(yǎng)條件,同時(shí)在植物生長調(diào)節(jié)劑種類與濃度配比上進(jìn)行更深入的研究,以提高石蒜屬植物組培的成功率和增殖系數(shù)。通過更加深入的石蒜組培體系研究,加速石蒜屬植物組培快繁體系的建立、完善和優(yōu)化,為其產(chǎn)業(yè)化開發(fā)奠定基礎(chǔ)。