高艷宇， 林 娟， 王 瓊， 閆咨儒

(電子科技大學醫(yī)學院附屬婦女兒童醫(yī)院·成都市婦女兒童中心醫(yī)院產(chǎn)科， 四川 成都 611731)

妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus,GDM)是一種典型的代謝性疾病，臨床表現(xiàn)主要以妊娠期高血糖為首發(fā)癥狀[1]。GDM作為一種極為常見妊娠期并發(fā)癥，嚴重影響母嬰健康，研究證實GDM不僅顯著增加先兆子癇，巨大兒、難產(chǎn)和胎兒窘迫的發(fā)生率，其同樣與不良妊娠結(jié)局如流產(chǎn)、宮內(nèi)死胎和致死性畸形等密切相關(guān)[2,3]。而胰島素抵抗(insulin resistance,IR)是目前多數(shù)學者公認的造成GDM的重要病理機制之一。IR是指一定數(shù)量的胰島素產(chǎn)生的生物效應遠遠低于預期的一種異常狀態(tài)，在妊娠期間，多種激素分泌如孕激素、催乳素、胎盤生長素等均能抵抗胰島素作用[4]。同時，IR還能激活炎癥反應，從而干擾正常妊娠的進展[5]。高遷移率組蛋白1(HMGB1)是一種非組蛋白相關(guān)蛋白，其主要從受損的細胞中釋放，并作為一種慢性炎癥信號參與調(diào)節(jié)炎癥、免疫刺激和趨化等過程[6]。在細胞中，HMGB1主要于與其受體如晚期糖基化終產(chǎn)物(RAGE)、Toll樣受體2(TLR-2)和4(TLR-4)進行結(jié)合，進而激活核因子(NF-κB)信號通路發(fā)揮其生物學效應[7]。近期有研究表明，GDM患者血清HMGB1水平較正常孕婦顯著升高，且與患者的IR具有相關(guān)性，但未進一步明確其具體作用機制[8]。因此，本研究通過體外建立滋養(yǎng)細胞IR模型并使用shRNA沉默HMGB1在滋養(yǎng)細胞中表達，探究其相關(guān)作用及信號通路，以期進一步闡明GDM發(fā)生發(fā)展的相關(guān)機制。

1 材料與方法

1.1細胞系和主要試劑:人絨毛膜滋養(yǎng)細胞系HTR-8/SVneo(HTR-8)購自武漢普若賽生命科技有限公司；RMPI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、0.25%胰蛋白酶(美國Hyclone公司)；胰島素，RIPA細胞裂解液，CCK-8試劑盒、HRP標記的山羊抗兔或大鼠IgG、DAPI染液(北京索萊寶生物科技有限公司)；shRNA-HMGB1和陰性對照序列(NC)由南京金斯瑞生物科技公司合成；BCA蛋白定量試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；葡萄糖含量測定試劑盒(南京建成生物技術(shù)研究所)；Trasnwell小室(8 μm)、PVDF膜(美國Millipore公司)；TNF-α、IL-1β、IL-6的ELISA試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；兔抗HMGB1、GLUT1、GLUT4抗體(美國Pierce Biotech 公司)；兔抗p-IRβ、IRβ、p-p65、p65(美國Cell Signaling公司)；大鼠抗IRS-1、IRS-2(美國CST公司)；大鼠抗p-PI3K、PI3K、p-IκBα、IκBα、β-actin(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)；Opti-MEM(美國Gibico公司)；Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑、基質(zhì)膠(美國Invitrogen公司);Cy3標記的山羊抗兔IgG(美國Affinity公司)；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2細胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染和分組：使用含10%FBS的RMPI-1640培養(yǎng)液進行培養(yǎng)HTR-8細胞，并置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中。待細胞生長融合至80%，0.25%的胰酶常規(guī)消化細胞，調(diào)整細胞密度至1×105個/mL，接種至12孔板中，培養(yǎng)24h后，將培養(yǎng)基更換為Opti-MEM，按Lipofectamine 3000使用說明書方法將shRNA-HMGB1或shRNA-NC轉(zhuǎn)染入HTR-8細胞，進行沉默HMGB1表達，6h后將更換培養(yǎng)基至10%FBS的RMPI-1640培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)染24h后進行后續(xù)相關(guān)實驗；按實驗目的將上述轉(zhuǎn)染后的HTR-8細胞進行分組，Control組為正常培養(yǎng)的HTR-8細胞；胰島素抵抗組(insulin resistance，IR組)為參考相關(guān)文獻[13]使用10～7moL/L胰島素處理48 h后建立的IR的HTR-8細胞；IR+shRNA-HMGB1組為經(jīng)10～7moL/L胰島素處理48 h的轉(zhuǎn)染shRNA-HMGB1的HTR-8細胞；IR+shRNA-NC組為經(jīng)10～7moL/L胰島素處理48h的轉(zhuǎn)染shRNA-NC的HTR-8細胞。

1.3葡萄糖消耗實驗檢測滋養(yǎng)細胞葡萄糖消耗量：取上述各組細胞上清液，1200rpm/min離心5min后，棄沉淀，使用葡萄糖含量測定試劑盒進行檢測，于分光光度計505nm處讀取相應吸光值。

1.4免疫印跡(Western blot)檢測滋養(yǎng)細胞蛋白表達：取上述各組滋養(yǎng)細胞，使用RIPA裂解液和蛋白酶抑制劑PMSF于冰上進行提取細胞中的總蛋白,BCA試劑盒進行檢測蛋白濃度并于沸水中進行加熱變性。取約40 μg變性后的總蛋白加載至SDS-PAGE凝膠上進行電泳分離，濕轉(zhuǎn)法將分離后的蛋白條帶轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%的脫脂奶粉室溫下進行抗體封閉1h后加入一抗，即HMGB1(1∶500)、GLUT1(1∶1000)、GLUT4(1∶1000)、p-IRβ(1∶800)、IRβ(1∶800)、p-p65(1∶1000)、p65(1∶1000)、IRS-1(1∶800)、IRS-2(1∶800)；p-PI3K(1∶1000)、PI3K(1∶1000)、p-IκBα(1∶800)、IκBα(1∶800)、β-actin(1∶20000)于4℃孵育過夜，次日TBST充分洗滌后，加入HRP標記的二抗(1∶10000)于室溫下孵育2h后，加入ECL發(fā)光液使用圖像分析軟件進行掃描，Image J軟件測定條帶灰度值分析計算，以β-actin為內(nèi)參。上述實驗單獨進行3次。

1.5免疫熒光分析滋養(yǎng)細胞HMGB1表達：取上述各組滋養(yǎng)細胞，棄除培養(yǎng)液后，使用4%多聚甲醛固定15min，0.1%Triton X-100透化30min，隨后山羊血清進行封閉15min，加入HMGB1抗體(1∶200)孵育過夜，PBS洗滌后加入Cy3標記的山羊抗兔IgG(1∶200)，孵育1h，最后滴加5μg/mL DAPI染液進行染核10min，防熒光猝滅劑封片后，使用熒光顯微鏡進行觀察分析。上述實驗單獨進行3次

1.6CCK-8檢測滋養(yǎng)細胞的增殖活力：取生長狀態(tài)良好的滋養(yǎng)細胞，調(diào)整細胞濃度，按5×103個/孔接種至96孔板中，按方法1.2進行轉(zhuǎn)染shRNA-HMGB1或shRNA-NC進行沉默細胞中HMGB1表達。轉(zhuǎn)染12h后按上述方法進行處理并分組，建立IR細胞模型。細胞培養(yǎng)箱中孵育48h后，每孔加入10μL的CCK-8試劑，繼續(xù)孵育2h后，用酶標儀于450nm處檢測每孔吸光度值，每組設置5個復孔。

1.7Transwell侵襲實驗檢測滋養(yǎng)細胞侵襲能力：使用RMPI-1640將基質(zhì)膠按1∶8比例進行稀釋，取60μL稀釋后的基質(zhì)膠進行包被Transwell上室底部，取上述各組滋養(yǎng)細胞，調(diào)整細胞比例至1×105個/孔，Transwell上室加入600μL含15%的RMPI-1640培養(yǎng)液。置于上述條件的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，輕輕擦拭上室未穿出的細胞，4%多聚甲醛室溫下固定15min后，0.1%的結(jié)晶紫染色10min，顯微鏡下隨機選取5個視野進行拍照并計數(shù)。實驗單獨進行三次。

1.8ELISA實驗檢測炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6表達：取上述各組細胞上清液，14000rpm/min離心10min，取上清并按照ELISA試劑盒使用說明書方法檢測各組滋養(yǎng)細胞對TNF-α、IL-1β、IL-6的表達水平。上述實驗單獨進行3次。

2 結(jié) 果

2.1滋養(yǎng)細胞IR模型的鑒定和HMGB1的表達水平檢測：葡萄糖消耗實驗的檢測結(jié)果顯示，經(jīng)10～7moL/L胰島素處理48h后，IR組葡萄糖的消耗量較Control組明顯降低(P<0.05)；Western blot實驗結(jié)果表明，與Control組相比，IR組HMGB1蛋白表達水平明顯增加(P<0.05)，見圖1、表1。

圖1 免疫印跡法檢測IR模型中HMGB1蛋白的表達

表1 IR模型中葡萄糖消耗與HMGB1蛋白表達水平

2.2轉(zhuǎn)染shRNA后對IR條件下滋養(yǎng)細胞HMGB1的蛋白表達水平影響：Western blot實驗結(jié)果顯示，與Control組相比，IR組、IR+shRNA-NC組細胞中HMGB1蛋白表達水平均顯著增加(P<0.05)，而IR+shRNA-HMGB1組細胞中無明顯HMGB1蛋白表達(P<0.05或P<0.01)，其中IR組與IR+shRNA-NC細胞中表達無明顯差異(P>0.05)；細胞免疫熒光結(jié)果同樣顯示，HMGB1在IR組、IR+shRNA-NC組滋養(yǎng)細胞中的熒光強度顯著高于Control組(P<0.05)，前兩組表達無明顯差異(P>0.05)，而在IR+shRNA-HMGB1組細胞中無明顯表達(P<0.05或P<0.01)，見圖2、表2。

表2 各組滋養(yǎng)細胞中HMGB1表達的檢測結(jié)果分析

圖2 免疫印跡(A)和細胞免疫熒光染色(B)檢測各組滋養(yǎng)細胞中HMGB1的蛋白表達

2.3沉默HMGB1表達對IR條件下滋養(yǎng)細胞增殖的影響：CCK-8實驗結(jié)果顯示，與Control組(0.77±0.06)相比，IR組(0.35±0.11)、IR+shRNA-NC組(0.31±0.08)和IR+shRNA-HMGB1組(0.51±0.10)的細胞侵襲能力明顯降低(P<0.05)，而與IR組或IR+shRNA-NC組相比，IR+shRNA-HMGB1組細胞的增殖能力顯著增加(P<0.05)，前兩組細胞無明顯差異(P>0.05)，見表3。

表3 CCK-8檢測各組滋養(yǎng)細胞的增殖能力

2.4沉默HMGB1表達對IR條件下滋養(yǎng)細胞侵襲的影響：Transwell實驗結(jié)果顯示，與Control組(93±18)相比，IR組(17±6)、IR+shRNA-NC組(19±4)和IR+shRNA-HMGB1組(52±11)的侵襲細胞數(shù)量明顯降低(P<0.05)，而與IR組或IR+shRNA-NC組相比，IR+shRNA-HMGB1組細胞的侵襲數(shù)量顯著增加(P<0.05)，前兩組細胞無明顯差異(P>0.05)，圖3，表4。

表4 Transwell檢測各組滋養(yǎng)細胞的侵襲能力

圖3 Transwell檢測各組滋養(yǎng)細胞侵襲能力

2.5沉默HMGB1表達對IR條件下滋養(yǎng)細胞炎癥因子表達的影響：ELISA檢測結(jié)果顯示，與Control組滋養(yǎng)細胞相比，IR組、IR+shRNA-NC組和IR+shRNA-HMGB1組細胞上清液中炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表達水平均顯著增加(P<0.05)，而IR+shRNA-HMGB1組細胞較IR組或IR+shRNA-NC組細胞對上述炎癥因子的分泌水平明顯降低(P<0.05)，后兩組細胞之間無明顯差異(P>0.05)，見表5。

表5 各組滋養(yǎng)細胞炎癥因子TNF-α IL-1β IL-6的表達水平

2.6沉默HMGB1表達對IR條件下滋養(yǎng)細胞胰島素敏感性的影響：葡萄糖消耗實驗結(jié)果顯示，與Control組相比，IR組、IR+shRNA-NC組和IR+shRNA-HMGB1組葡萄糖消耗量明顯減少(P<0.05)；而IR+shRNA-HMGB1組細胞較IR組或IR+shRNA-NC組細胞的葡萄糖消耗量顯著增加(P<0.05)，后兩組細胞之間無明顯差異(P>0.05)。Western blot實驗檢測胰島素敏感性相關(guān)蛋白的結(jié)果顯示，與Control組滋養(yǎng)細胞相比，IR組、IR+shRNA-NC組和IR+shRNA-HMGB1組細胞中胰島素相關(guān)蛋白IRβ(p-IRβ/IRβ)和PI3K(p-PI3K/PI3K)的磷酸化水平及ISR-1、ISR-2和葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白GLUT4均明顯增加(P<0.05)，葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白GLUT1表達水平均顯著降低(P<0.05)；而IR+shRNA-HMGB1組細胞較IR組或IR+shRNA-NC組細胞相比，IRβ與PI3K的磷酸化以及ISR-1、ISR-2和GLUT4蛋白表達水平均明顯降低(P<0.05)，GLUT1蛋白顯著增加(P<0.05)，IR組或IR+shRNA-NC組細胞的上述蛋白的表達無明顯變化(P>0.05)，見表6、圖4、表7。

表6 各組滋養(yǎng)細胞中葡糖糖的消耗量

圖4 免疫印跡檢測各組滋養(yǎng)細胞中胰島素敏感性相關(guān)蛋白的表達

表7 各組滋養(yǎng)細胞中胰島素敏感性相關(guān)蛋白的相對表達量

2.7沉默HMGB1表達對IR條件下滋養(yǎng)細胞中NF-κB信號通路的影響:Western blot結(jié)果顯示，與Control組滋養(yǎng)細胞相比，IR組、IR+shRNA-NC組和IR+shRNA-HMGB1組細胞IκBα和p65蛋白磷酸化水平均明顯增加(P<0.01或P<0.05)，而IR+shRNA-HMGB1組細胞較IR組或IR+shRNA-NC組細胞相比，上述蛋白的磷酸化水平均顯著降低(P<0.05)，后兩組細胞之間無明顯差異(P>0.05)，見圖5、表8。

圖5 免疫印跡檢測沉默HMGB1抑制IR條件下滋養(yǎng)細胞中的NF-κB信號通路表達的影響

表8 各組滋養(yǎng)細胞中NF-κB信號通路的相對表達量

3 討 論

近年來隨著生活方式的改變與生育政策的逐步開放，GDM的發(fā)病率也急劇升高，流行病學統(tǒng)計顯示：在過去十年間，我國GDM的患病率占妊娠婦女總數(shù)的9.3%～18.9%，造成沉重的家庭及社會負擔[3]。大量數(shù)據(jù)表明IR是誘發(fā)GDM發(fā)生發(fā)展的病理生理基礎(chǔ)。此外，多數(shù)學者認為GDM不僅是一種代謝相關(guān)疾病，其同樣還是一種持續(xù)存在的低度慢性炎癥狀態(tài)，而這與細胞因子和相關(guān)介質(zhì)的異常表達具有密切關(guān)系。

HMGB1是一種廣泛存在于真核細胞內(nèi)的，分子量為30kb的高度保守的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子[6]。正常情況下，HMGB1在細胞中介導轉(zhuǎn)錄因子與DNA相互作用，而在不良刺激發(fā)生時，其被分泌至細胞外，與相應受體(RAGE、TLR-2、TLR-4)進行結(jié)合后，誘導炎癥反應，促進血管生成等相關(guān)生物學效應[6,7]。近期研究證實HMGB1分泌的增加是促使IR發(fā)生的一個重要原因，其可能的機制為HMGB1與RAGE受體相互作用誘導NF-κB的轉(zhuǎn)錄，從而與炎癥因子TNF-a共同導致胰島素受體底物1和2(ISR-1、ISR-2)的失活，最終產(chǎn)生IR的發(fā)生[9]。此外，HMGB1同樣還能夠刺激胰島素的分泌[10]。而在GDM中，國內(nèi)外均有學者報道HMGB1在GDM患者體內(nèi)的表達水平顯著高于正常妊娠女性，且與IR具有正相關(guān)關(guān)系，進一步分析表明HMGB1能夠作為GDM的一個獨立預測因子[7,8,11]。而在其他妊娠相關(guān)疾病中，有研究證實HMGB1子癇前期(PE)的外周血及胎盤組織中均異常高表達，且能夠通過抑制滋養(yǎng)細胞的增殖，侵襲并誘導細胞發(fā)生凋亡以促進PE的發(fā)生進展[12]。上述研究提示HMGB1不僅能夠誘導IR的發(fā)生，同時還能影響滋養(yǎng)細胞的生物學行為。胎盤作為胰島素信號的重要效應器官，其發(fā)生的IR已被認為是GDM重要特征之一，這使得胎盤成為GDM發(fā)病機制的重點[1,2]，而滋養(yǎng)細胞又在胎盤的形成及功能維持中發(fā)揮重要作用[2]。因此本研究通過參考相關(guān)文獻[9]體外建立滋養(yǎng)細胞HTR-8的IR模型，以探究HMGB1在GDM發(fā)病機制中的作用。實驗結(jié)果表明在IR條件下滋養(yǎng)細胞中的HMGB1蛋白表達顯著升高，通過shRNA沉默IR條件下滋養(yǎng)細胞中HMGB1，驗證其轉(zhuǎn)染效果后，細胞增殖及侵襲實驗結(jié)果顯示沉默HMGB1能明顯促進IR條件下滋養(yǎng)細胞的增殖和侵襲能力。同時，沉默HMGB1表達促進了IR條件下受損的胰島素敏感性，抑制了滋養(yǎng)細胞對促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6的分泌。

葡萄糖攝取被認為是機體細胞存活的主要能量來源，而有效的胰島素分泌和功能對血糖穩(wěn)態(tài)的維持起著至關(guān)重要的作用。既往研究顯示，在IR細胞模型中葡萄糖消耗能力嚴重受損，這進一步說明葡萄糖穩(wěn)態(tài)缺陷與胰島素抵抗之間的相關(guān)性[13]。胰島素受體β(IRβ)是胰島素的膜受體，其磷酸化的狀態(tài)廣泛被認為是胰島素結(jié)合反應的標志。而胰島素受體底物-1和2(ISR-1、ISR-2)是一種銜接蛋白，其主要作用是通過與磷脂酰肌醇激酶(PI3K)的結(jié)合將絡氨酸磷酸化信號轉(zhuǎn)化為脂類激酶信號，并激活下游相關(guān)蛋白的表達。其中，ISR-1與ISR-2蛋白的表達在胰島素效應激活過程中具有重要地位[9]。此外，細胞質(zhì)中葡萄糖轉(zhuǎn)運體的表達水平也控制著葡萄糖的攝取，在本實驗中我們也同樣對葡萄糖轉(zhuǎn)運體1(GLUT1)和4(GLUT4)進行了檢測。HMGB1作為一種慢性炎癥介質(zhì)，其在細胞中主要通過NF-κB信號通路發(fā)揮促炎作用，而有研究證實介導炎癥反應的NF-κB信號通路的激活可導致糖代謝的受損和全身IR，這進一步提示胰島素作用與炎癥反應的相關(guān)性[14]。本實驗結(jié)果表明，沉默HMGB1的表達能夠明顯促進IR條件下滋養(yǎng)細胞中IRβ和PI3K的磷酸化水平及ISR-1、ISR-2和GLUT4的蛋白表達水平，而抑制GLUT1表達。這提示沉默HMGB1改善了IR條件下滋養(yǎng)細胞的胰島素敏感性。最后NF-κB信號通路的檢測結(jié)果顯示，沉默HMGB1的表達能通過抑制IR條件下滋養(yǎng)細胞中IκBα和p65蛋白的磷酸化水平下調(diào)該信號通路的激活水平。

綜上，本實驗發(fā)現(xiàn)HMGB1表達水平在IR條件下的滋養(yǎng)細胞中明顯升高，沉默其表達能夠通過NF-κB信號通路促進滋養(yǎng)細胞的增殖與侵襲能力，改善細胞對胰島素的敏感性，并降低其對促炎因子的分泌。本課題組的研究結(jié)果進一步闡明了HMGB1在IR的發(fā)生和發(fā)展中作用，為改善GDM的治療提供了新的策略。