樊 英,王曉璐,劉吉丹,劉洪軍**,王友紅,蓋春蕾,許 拉,葉海斌,吳海一,麻丹萍,張 濤
(1.山東省海洋科學(xué)研究院,山東省海水養(yǎng)殖病害防治重點實驗室/山東省海水健康養(yǎng)殖技術(shù)工程技術(shù)研究中心,山東青島 266104;2.中國海洋大學(xué),山東青島 266100;3.山東省濱州市無棣縣海洋發(fā)展和漁業(yè)局,山東濱州 251900)
非洲斑節(jié)對蝦(Penaeusmonodon),又稱金剛斑節(jié)對蝦、斑節(jié)王,分類學(xué)上隸屬于節(jié)肢動物門(Arthropoda)甲殼綱(Crustacea)十足目(Decapoda)對蝦科(Penaeidae)對蝦屬(Peneus),是對蝦屬中的大型種。非洲斑節(jié)對蝦原產(chǎn)于非洲莫桑比克等地,相對于目前國內(nèi)養(yǎng)殖的斑節(jié)對蝦而言,其體表特征表現(xiàn)為體色較深、頭胸甲較為厚實、體長側(cè)扁、略呈梭形、體色鮮亮等。非洲斑節(jié)對蝦養(yǎng)殖的適合水溫為25-32℃,適應(yīng)鹽度在30左右,適宜環(huán)境為沙底質(zhì),對飼料蛋白含量要求相對較低,屬于雜食性動物,抗病能力強,適宜工廠集約化、池塘等多種養(yǎng)殖模式[1]。
養(yǎng)殖環(huán)境因子中的鹽度是影響水產(chǎn)養(yǎng)殖動物生長最直接、最重要的生態(tài)因子之一[2],自然環(huán)境(如雨天、旱天)的變化可直接或間接地影響?zhàn)B殖水體的鹽度,進而對動物機體生理狀態(tài)產(chǎn)生影響[3-8]。目前,關(guān)于鹽度對對蝦養(yǎng)殖的影響報道較多,且集中表現(xiàn)在凡納濱對蝦方面。李娜等[9]研究發(fā)現(xiàn)隨著鹽度升高,凡納濱對蝦的存活率、相對增重率、特定生長率、餌料轉(zhuǎn)化率等指標皆表現(xiàn)出降低趨勢,而攝食率、血漿滲透壓及Na+-K+-ATPase活力逐漸升高。董甜甜等[10]從生長、代謝和抗氧化酶活力方面研究高鹽脅迫對凡納濱對蝦的影響,結(jié)果表明高鹽度不適宜對蝦的生長和存活,但可以激活其抗氧化能力和脂類代謝。趙玉超等[11]研究發(fā)現(xiàn),隨著鹽度增加,凡納濱對蝦仔蝦生長日增率和存活率顯著降低,而酸性磷酸酶ACP、堿性磷酸酶AKP、超氧化物歧化酶SOD和過氧化氫酶CAT等部分非特異性免疫酶活性被激發(fā),機體滲透調(diào)節(jié)能力增強。Gao等[12]研究表明,低鹽度環(huán)境下凡納濱對蝦生長性能和存活率顯著降低,激活了對蝦鰓Na+-K+-ATPase α亞基、碳酸酐酶轉(zhuǎn)錄水平,但抑制了肝胰臟糜蛋白酶、胰蛋白酶的轉(zhuǎn)錄水平。李華等[13]研究顯示,低鹽可激活凡納濱對蝦血淋巴超氧化物歧化酶SOD活性。目前,關(guān)于鹽度脅迫(包括高鹽度和低鹽度)對非洲斑節(jié)對蝦的研究報道較少,因此,本實驗以非洲斑節(jié)對蝦為研究對象,分析低、高鹽度脅迫對非洲斑節(jié)對蝦生長、代謝、抗氧化及消化指標的影響,擬豐富對蝦生物學(xué)基礎(chǔ)知識,同時為非洲斑節(jié)對蝦健康養(yǎng)殖及抗環(huán)境脅迫預(yù)警提供理論參考。
實驗用非洲斑節(jié)對蝦初始體質(zhì)量為(1.5±0.2) g,暫養(yǎng)于玻璃鋼桶(500 L)中。暫養(yǎng)期間所用海水鹽度為30,pH值為8.0±0.5,溫度為(28±0.5)℃,24 h充氣泵充氧,溶氧量為(7.5±0.5) mg/L,水體總氨氮低于0.5 mg/L。每天飼料投喂量為體質(zhì)量的8%-10%,每天5次投喂(6:00、10:00、14:00、18:00、22:00),根據(jù)當(dāng)日天氣、殘餌和飼養(yǎng)條件調(diào)整具體投喂量。養(yǎng)殖過程中每天上午10:00換水1次,換水量為總水體的30%。暫養(yǎng)7 d后,每天以5個鹽度的速度由鹽度30馴化至實驗設(shè)計鹽度梯度。海水鹽度由淡水、天然海水與鹵水(濱州友發(fā)有限公司)調(diào)配而成。
2020-04-17-2020-5-30,在山東省濱州市北海經(jīng)濟開發(fā)區(qū)友發(fā)水產(chǎn)有限公司工廠化車間進行為期35 d的對蝦養(yǎng)殖試驗。實驗設(shè)置20,30,40,50 共4個鹽度梯度,其中30鹽度組作為對照。每個鹽度組設(shè)3個平行,每個平行放入大小均勻、健康的非洲斑節(jié)對蝦400尾。日常投喂、管理同暫養(yǎng)期。每隔7 d,從每個平行組隨機取30尾對蝦取血、鰓和肝胰腺組織樣品。
試驗過程的第3,7,14,35天,采用1.0 mL一次性無菌注射器從對蝦心臟采集血液,與抗凝劑按照1∶1比例混合置于Eppendorf管中(每個平行取30尾蝦,混合成一個樣品), 4℃過夜后于4 000 r/min離心10 min,取上清,-80℃保存,備測。
試驗過程的第3,7,14,35天,采用無菌鑷子及剪刀獲取鰓絲樣品(每個平行取30尾蝦,混合成一個樣品),經(jīng)剪刀剪碎,稱取一定質(zhì)量后置于勻漿管中,加入9倍體積的生理鹽水,勻漿后經(jīng)冷凍離心機4℃條件下3 000 r/min離心15 min,取上清液備測。
試驗過程的第3,7,14,35天,在冰盤中獲取肝胰腺組織置于Eppendorf離心管中(每個平行取30尾蝦,混合成一個樣品),混合后迅速投入液氮中,再轉(zhuǎn)移到-80℃保存?zhèn)溆谩7Q取一定質(zhì)量肝胰腺組織置于勻漿管中,加入9倍體積的生理鹽水,勻漿后經(jīng)冷凍離心機4℃ 條件下3 000 r/min離心15 min,取上清液備測。
1.4.1 生長指標
35 d的投喂試驗結(jié)束后,停食1 d,稱量每個平行組非洲斑節(jié)對蝦的體質(zhì)量,計算增重率(Weight Gain Rate,WGR)、特定生長率(Specific Growth Rate,SGR),統(tǒng)計成活率(Survival Rate,SR)。計算公式: WGR =(末均重-初均重) /初均重×100%,SGR=(ln末均重-ln初均重) /試驗天數(shù)×100%,SR=(終末活對蝦尾數(shù)/初始活對蝦尾數(shù)) ×100%。
1.4.2 滲透調(diào)節(jié)指標測定
采用南京建成生物工程研究所的試劑盒測定非洲斑節(jié)對蝦鰓絲組織中總ATPase及Na+-K+-ATPase活力??侫TPase酶活定義為每小時每毫克組織蛋白中的ATP酶分解ATP產(chǎn)生1 μmol無機磷的量為一個酶活力單位。Na+-K+-ATPase酶活定義為每小時每毫克組織蛋白的組織中ATP酶分解ATP產(chǎn)生1 μmol無機磷的量為一個酶活力單位。
1.4.3 抗氧化相關(guān)酶活性測定
采用南京建成生物工程研究所的試劑盒測定非洲斑節(jié)對蝦血清樣品總抗氧化能力(T-AOC)、過氧化氫酶(CAT) 、超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)含量、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性。其中,T-AOC定義為在37℃時,每分鐘每毫升血清使反應(yīng)體系的吸光度(OD)值增加0.01為一個總抗氧化能力單位;CAT酶活定義為每毫升血清每秒鐘分解1 μmol H2O2的量為一個活力單位;SOD酶活定義為在本反應(yīng)體系中SOD抑制率達50%時所對應(yīng)的酶量為一個活力單位(U);MDA含量定義為每毫升血清在95℃及酸性環(huán)境中與硫代巴比妥酸(Thiobarbituric Acid,TBA)縮合,形成紅色MDA-TBA加合物的量;GSH-Px酶活定義為每0.1 mL血清在37℃反應(yīng)5 min,扣除非酶促反應(yīng)作用,使反應(yīng)體系中GSH濃度降低1 μmol/L為一個酶活力單位。
1.4.4 消化酶活性測定
采用南京建成生物工程研究所的試劑盒測定非洲斑節(jié)對蝦肝胰腺組織樣品胃蛋白酶(Pepsin)、脂肪酶 (Lipase)和淀粉酶(Amylase) 活性。胃蛋白酶活力定義為在37℃條件下每毫克組織蛋白每分鐘分解蛋白生成1 μg氨基酸相當(dāng)于一個酶活力單位。脂肪酶活力定義為在37℃條件下每毫克組織蛋白每分鐘水解生成1 μmol脂肪酸為一個酶活力單位。淀粉酶活力定義為組織中每毫克蛋白在37℃與底物作用30 min,水解10 mg淀粉為一個酶活力單位。
試驗所得數(shù)據(jù)均表示為平均值±標準誤(n=3);對數(shù)據(jù)進行SPSS 19.0單因素方差分析(one-way ANOVA)和Duncan比較分析,以P<0.05作為差異的顯著性水平。
由表1可知,實驗期間各鹽度組非洲斑節(jié)對蝦的成活率不同,其中20,30鹽度組成活率均為100%,40鹽度組成活率為97.67%,50鹽度組成活率僅為72.00%。投喂實驗結(jié)束后,鹽度脅迫組對蝦終末體質(zhì)量均低于對照組,50鹽度組差異最顯著(P<0.05),增重率僅為30.23% (P<0.05);其次是20鹽度組。特定生長率所受影響同步于終末體質(zhì)量和增重率,鹽度脅迫組SGR均顯著低于對照組(P<0.05)。
表1 鹽度脅迫對非洲斑節(jié)對蝦生長指標的影響(n=3)
由圖1可知, 鹽度脅迫對非洲斑節(jié)對蝦鰓絲ATPase和Na+-K+-ATPase活性影響顯著(P<0.05)。如圖1a所示,實驗第3天,20鹽度組ATPase活性顯著下降,而40,50鹽度組相反,活性顯著升高;隨著時間的延長,各鹽度組ATPase活性均表現(xiàn)出適應(yīng)鹽度脅迫環(huán)境;第35天,與對照組比較,20,40,50鹽度組均無顯著差異(P>0.05)。圖1b顯示,實驗第3,7天,20,40,50鹽度組Na+-K+-ATPase活性均比對照組升高,且差異顯著(P<0.05),其中40鹽度組尤為突出;第35天,20鹽度組與對照組無顯著差異(P>0.05),而40,50鹽度組較對照組高,差異顯著(P<0.05)。
圖中不同小寫字母表示同一時間各組之間存在顯著性差異(P<0.05)
由圖2可知,鹽度脅迫對非洲斑節(jié)對蝦抗氧化應(yīng)激系統(tǒng)產(chǎn)生明顯的影響。圖2a結(jié)果顯示,實驗第3天,20,40,50鹽度組T-AOC活性均比對照組顯著提高(P<0.05),但脅迫組間無顯著差異(P>0.05);第7,14,35天,20鹽度組T-AOC活性較對照組低,但無顯著差異(P>0.05);第7,14天,40,50鹽度組較對照組高(P>0.05),而第35天,40,50鹽度組較對照組低(P>0.05)。圖2b結(jié)果顯示,整個實驗過程中,各鹽度組CAT活性均比對照組低,且第35天呈現(xiàn)適應(yīng)狀態(tài),脅迫組與對照組間以及各脅迫組間均無顯著差異(P>0.05);實驗過程中,20鹽度組與50鹽度組間無顯著差異(P>0.05)。圖2c結(jié)果顯示,實驗第3天,50鹽度組SOD活性顯著低于對照組及其他鹽度組(P<0.05);隨著時間延長,50鹽度組SOD活性有所提升,且第14,35天與對照組之間差異顯著(P<0.05)。圖2d結(jié)果顯示,20鹽度組MDA含量較對照組稍低,但無顯著差異(P>0.05);實驗第3天,40,50鹽度組MDA含量較對照組顯著提高(P<0.05),第7天仍比對照組高但無顯著差異(P>0.05);隨時間延長,第35天MDA含量比對照組稍低(P>0.05)。圖2e結(jié)果顯示,實驗第3天,20,40,50鹽度組GSH-Px活性均顯著高于對照組 (P<0.05);隨著時間延長,20鹽度組GSH-Px活性有所降低,第14天與對照組之間存在顯著差異(P<0.05);第7天,40鹽度組GSH-Px活性顯著高于對照組 (P<0.05),第14天,50鹽度組活性最高(P>0.05);第35天,各脅迫組間以及脅迫組與對照組之間均無顯著差異(P>0.05)。
圖中不同小寫字母表示同一時間各組之間存在顯著性差異(P<0.05)
由圖3可知,鹽度脅迫對非洲斑節(jié)對蝦消化酶活性產(chǎn)生了不同程度的影響。如3a所示,實驗期間各鹽度組胃蛋白酶活性均比對照組降低,20鹽度組第7天胃蛋白酶活性有所提升,仍比對照組低,但無顯著差異(P>0.05);而40,50鹽度組在整個實驗期間一直與對照組存在顯著差異 (P<0.05)。圖3b結(jié)果顯示,實驗第3,14天,各鹽度組脂肪酶活性均顯著低于對照組顯著(P<0.05),各鹽度脅迫組之間差異不顯著 (P>0.05);第7天,20鹽度組脂肪酶活性升高,與對照組無顯著差異(P>0.05),但40,50鹽度組仍顯著降低(P<0.05);第35天,20,40鹽度組脂肪酶活性較前期有所提升,與對照組間無顯著差異(P>0.05),但50鹽度組仍顯著低于對照組 (P<0.05)。圖3c結(jié)果顯示,實驗第3天,20鹽度組淀粉酶活性顯著高于對照組 (P<0.05),40,50鹽度組與對照組無顯著差異(P>0.05);第7,35天,各鹽度組與對照組之間均無顯著差異(P>0.05);第14天,40,50鹽度組顯著高于對照組 (P<0.05),20鹽度組與對照組無顯著差異(P>0.05)。
本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),低鹽度、高鹽度脅迫均對非洲斑節(jié)對蝦生長產(chǎn)生了抑制,增重率、特定生長率和成活率均呈現(xiàn)降低的趨勢,尤其是50鹽度組,說明鹽度脅迫導(dǎo)致對蝦生長環(huán)境遠離其等滲點,從而在生長過程中需要更多的能量來維持機體滲透平衡,這就導(dǎo)致其代謝加快,物質(zhì)積累不足,因此生長緩慢,成活率甚至僅有72.0%。非洲斑節(jié)對蝦與凡納濱對蝦可能會因為品種差異、個體差異、餌料種類、水中理化因子及其他生態(tài)環(huán)境等多種因素導(dǎo)致鹽度適應(yīng)性存在差異,但基本原理一致。如研究報道,凡納濱對蝦具有廣鹽性,其最適鹽度范圍是18-35[14,15],然而對蝦的等滲點一般處于24-26。當(dāng)環(huán)境鹽度不適應(yīng)自身滲透壓時,凡納濱對蝦會自我調(diào)節(jié)滲透壓平衡,其同化率在適宜的鹽度環(huán)境下會隨鹽度降低而降低,從而抑制生長代謝。Bary等[16]研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)鹽度從25上升到35時,凡納濱對蝦的生長特征趨于緩慢,當(dāng)鹽度再升高至49時,對蝦的生長明顯受到抑制。李二超等[17]研究結(jié)果表明,鹽度從25到35時,凡納濱對蝦生長緩慢,且成活率降低。Panikkar[18]研究滲透調(diào)節(jié)和環(huán)境鹽度之間的適應(yīng)性時發(fā)現(xiàn),高鹽度環(huán)境中,對蝦需要將體內(nèi)多余鹽分排除,保持機體內(nèi)正常水分;而低鹽度環(huán)境中,對蝦即需要獲取更多鹽分,排除機體內(nèi)多余水分,在這調(diào)控過程中,機體需要消耗能量,因而降低了其他必需的能量代謝,降低了生長效能。
圖中不同小寫字母表示同一時間各組之間存在顯著性差異(P<0.05)
鹽度通過調(diào)節(jié)滲透壓來影響對蝦的生理功能。為適應(yīng)不同生長環(huán)境,對蝦在滲透調(diào)節(jié)和離子調(diào)節(jié)時又伴隨著能量代謝,ATPase、Na+-K+-ATPase活性可反映機體滲透調(diào)節(jié)甚至生長代謝等狀況[11,19-22]。眾多研究已探討鹽度和ATPase、Na+-K+-ATPase之間的調(diào)節(jié)或維持效應(yīng)。Liu等[23]對中華絨螯蟹進行鹽度適應(yīng)性研究,結(jié)果顯示隨著鹽度的升高,中華絨螯蟹血漿滲透壓升高,Na+-K+-ATPase活力也逐漸升高。Wilder等[24]在對羅氏沼蝦的研究中也發(fā)現(xiàn),鹽度的提高刺激了蝦鰓中Na+-K+-ATPase酶活力。潘魯青等[25]研究發(fā)現(xiàn),養(yǎng)殖環(huán)境中鹽度變化時,凡納濱對蝦鰓絲中Na+-K+-ATPase活力逐漸升高,且鹽度越低酶活力越大。然而,甲殼動物對蝦主要依靠鰓上皮細胞膜上的Na+-K+-ATPase參與主動運輸Na+和K+,維持機體的Na+、K+離子平衡和調(diào)節(jié)血淋巴滲透壓[26],高鹽脅迫條件下,鰓絲Na+-K+-ATPase活力有所增強[11]。本研究也呈現(xiàn)相似結(jié)果,急性鹽度脅迫時Na+-K+-ATPase活力升高,40鹽度組尤為顯著,且隨時間延長,與對照組仍呈現(xiàn)顯著差異。這可能是因為在高鹽度環(huán)境下,非洲斑節(jié)對蝦體內(nèi)滲透壓增高,細胞內(nèi)外極性也增加,為提供轉(zhuǎn)運、吸收動力導(dǎo)致鰓上皮細胞活躍,機體為維持滲透平衡需消耗大量能量;但Na+-K+-ATPase轉(zhuǎn)運Na+的能力有限,需要在適宜鹽度下才達到最大轉(zhuǎn)運能力。也有研究認為,由于滲透壓的長期調(diào)節(jié),基因表達量隨刺激情況發(fā)生變化,進而調(diào)節(jié)Na+-K+-ATPase位點數(shù)量,從而影響酶活力,表現(xiàn)為升高現(xiàn)象[27]。本研究中,ATPase活力在急性鹽度脅迫第3天表現(xiàn)出顯著差異,50鹽度組差異最顯著;隨時間延長,各鹽度脅迫組活力有所回復(fù),第35天與對照組無顯著差異,趨于穩(wěn)定,推測認為ATPase酶活力變化可能與Ca2+、Mg2+轉(zhuǎn)運有關(guān),具體原因還需進一步研究證實。
在鹽度脅迫環(huán)境中,對蝦體內(nèi)自由基會不斷積累,若未能及時清除,積累到一定程度會對對蝦機體產(chǎn)生脅迫,引起機體氧化應(yīng)激反應(yīng),相關(guān)抗氧化酶活力隨之發(fā)生變化[28]。不同指標其功能不同,對鹽度脅迫的敏感度也不同[28,29]。T-AOC是反映機體總抗氧化水平的重要指標之一;SOD是最重要的活性氧消除酶,在平衡氧化和抗氧化過程中通過2O2-+2H+→H2O2+O2反應(yīng)清除體內(nèi)過量氧自由基;CAT與SOD協(xié)同作用,在活性氧消除系統(tǒng)中將過氧化氫轉(zhuǎn)變?yōu)樗?,保護機體免受氧自由基損傷而發(fā)生正常代謝;GSH-Px是一種重要的過氧化物分解酶,保護機體細胞膜不受過氧化物的損害;當(dāng)機體內(nèi)氧自由基過量發(fā)生損傷時會促進脂質(zhì)過氧化反應(yīng),脂質(zhì)過氧化物丙二醛MDA含量通過過氧化程度間接反映機體抗氧化能力[30-33]。本研究中,高鹽脅迫下T-AOC活力升高,CAT活力發(fā)生不同程度的降低,SOD活力變化與對照組差異不顯著,而MDA含量明顯增加,GSH-Px活力顯著提高。低鹽脅迫影響效應(yīng)則不同:急性脅迫第3天T-AOC活性顯著提升,隨著時間延長,酶活力比對照組稍低,且GSH-Px活力變化相同;SOD活力和MDA含量與對照組無顯著差異;CAT活力較對照組顯著降低,隨時間延長呈現(xiàn)適應(yīng)狀態(tài)。推測產(chǎn)生這些結(jié)果的原因可能是,急性鹽度脅迫使非洲斑節(jié)對蝦體內(nèi)氧自由基變化未發(fā)生急劇積累,抗氧化酶協(xié)同作用維持了機體的正常水平,但脂質(zhì)過氧化物的增加對機體產(chǎn)生了一定的損傷,為保護體內(nèi)細胞不受嚴重傷害而誘導(dǎo)了GSH-Px活力,分解過量的過氧化物質(zhì),從而實現(xiàn)對環(huán)境改變的適應(yīng)性。
當(dāng)環(huán)境鹽度發(fā)生變化時,機體為克服負面影響改變其生理功能,調(diào)控能量代謝,滲透壓平衡所需能量多,消化代謝能量便被消耗,因此抑制生長[34,35]。本研究中,高鹽、低鹽脅迫均降低了肝胰腺消化酶活性,50鹽度組尤為顯著;20鹽度組淀粉酶在第3天急劇提升,隨后與對照組無顯著差異,推測可能是因為不同鹽度環(huán)境中不同消化酶底物的含量不同,因此誘導(dǎo)酶活性產(chǎn)生了差異,具體原因需要更深層次的研究。胃蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活性變化趨勢不同,推測可能是非洲斑節(jié)對蝦應(yīng)對鹽度脅迫時,糖類代謝不是主要的功能調(diào)節(jié)來源,故淀粉酶活性隨時間延長未發(fā)生顯著改變,而蛋白質(zhì)和脂類代謝在生長過程中參與較多,因此鹽度改變時嚴重抑制了肝胰腺中胃蛋白酶及脂肪酶活性,從而降低了對蛋白質(zhì)及脂類的消化能力。Babkin等[36]研究發(fā)現(xiàn),消化酶具有一定的整體效應(yīng),即其中一種酶活性提高時,其他消化酶的活性也同時提高;而當(dāng)其中一種酶活性減弱時,其他消化酶的活性也隨之減弱,本研究中胃蛋白酶和脂肪酶活性變化也呈現(xiàn)出這一現(xiàn)象。另外,消化酶活性與生長具有一定的相關(guān)性,鹽度脅迫下非洲斑節(jié)對蝦生理狀況不佳,代謝水平降低,呈現(xiàn)較低消化酶活力,吸收轉(zhuǎn)化遲鈍,從而抑制機體生長,陳曉瑛等[37]、荊冰妍等[38]的研究也體現(xiàn)了這一相關(guān)性。
綜上所述,鹽度脅迫(高鹽、低鹽)會影響非洲斑節(jié)對蝦的生長指標,鹽度越高,對蝦的滲透調(diào)節(jié)酶活性被激發(fā),同時調(diào)節(jié)其抗氧化能力,降低消化酶活性,其生長越緩慢,存活率越低。鹽度脅迫時,滲透壓調(diào)節(jié)需要更多能量,非洲斑節(jié)對蝦會釋放消化及代謝能量以維持自身生理需求。本研究為后續(xù)研發(fā)鹽度調(diào)控技術(shù)提供數(shù)據(jù)支撐,為進一步探討非洲斑節(jié)對蝦生理機制提供基礎(chǔ)。