梁新波 張 晨 張冠初丁 紅徐 揚李澤倫石書兵*張智猛*

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院,新疆 烏魯木齊 830052;2.山東省花生研究所,山東 青島 266100)

我國幅員遼闊,干旱半干旱地區(qū)面積占國土面積的52.5%,其中半干旱地區(qū)占22.0%,干旱地區(qū)占30.5%[1]。我國70%以上的花生集中產(chǎn)區(qū)分布于干旱半干旱地區(qū)的古河故道、丘陵坡地等處,花生雖是抗旱耐瘠固氮和中度耐鹽堿作物,但干旱缺水、肥力瘠薄、土壤鹽堿脅迫仍是制約花生持續(xù)發(fā)展和提高產(chǎn)量效益的主要因子,是我國花生生產(chǎn)上分布最廣、危害程度最大的限制因素。受干旱半干旱區(qū)氣候條件、地下水埋深、土壤特性、礦化度等自然條件和諸如灌溉、施肥和種植方式等人為不合理利用、干預等諸多因素影響,耕作土壤次生鹽漬化風險較高[2-3]。

花生是我國重要的油料作物和經(jīng)濟作物,其總產(chǎn)量和出口量均居世界首位[4]。因常年干旱引起的受害面積達266.7萬hm2,減產(chǎn)率平均在20%以上,是花生生產(chǎn)必須著重解決的關(guān)鍵問題之一[5]。同時,隨著國民生活水平和健康理念的發(fā)展,高質(zhì)量食用植物油需求和供應矛盾凸顯,花生油因其較高的不飽和脂肪酸含量受到廣大消費者的認可和青睞。然而,干旱和土壤鹽漬化嚴重威脅干旱半干旱區(qū)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和種植業(yè)結(jié)構(gòu)優(yōu)化的同時,也影響著花生產(chǎn)業(yè)的持續(xù)發(fā)展,在繼續(xù)提高花生產(chǎn)量的基礎(chǔ)上,擴大種植面積是緩解食用植物油需求和糧棉油爭地矛盾的重要途徑。因此,高效利用干旱半干旱地區(qū)溫光熱和耕地資源、開發(fā)墾殖利用次生鹽漬化和鹽漬化土地,可極大地提高干旱半干旱地區(qū)脆弱農(nóng)業(yè)種植結(jié)構(gòu)的抗風險能力。

根際微環(huán)境是構(gòu)建植物與土壤交流溝通的橋梁,也是植物遭受脅迫時優(yōu)先作出響應的區(qū)域[6]。根際微生物對植物的生長發(fā)育、養(yǎng)分獲取及病害防御起著至關(guān)重要的作用[7-8],同時,植物也通過根系對根際微生物群落結(jié)構(gòu)和功能加以馴養(yǎng)和塑造[9-11]。以往多是分別進行水和鹽脅迫條件對根際土壤中微生物的影響研究,主要從根際土壤養(yǎng)分與酶活性[12]、微生物數(shù)量與分布特點[13-14]、土壤微生物群落組成[15]以及土壤微生物功能代謝[16]等方面,很少有人探究水鹽共同作用下根際土壤微生物的響應,尤其在次生鹽漬化和較輕度鹽堿脅迫的干旱半干旱農(nóng)業(yè)生產(chǎn)地區(qū)更顯重要

本試驗模擬干旱、鹽堿脅迫條件,研究花生根際微生物群落結(jié)構(gòu)的組成及變化,旨在從花生根際細菌群落結(jié)構(gòu)的角度闡述干旱和鹽脅迫對花生根際細菌菌群的影響及與根際微生物之間的相互作用,為根際生態(tài)系統(tǒng)調(diào)節(jié)機理及生產(chǎn)上科學施肥調(diào)控提供理論支持和參考。

1 材料方法

1.1 試驗材料

以花育22號(HY22)為試驗材料。供試土壤采用山東省花生研究所萊西試驗站0～20 cm 表層土,其基本理化性質(zhì):土壤有機質(zhì)含量12.37 g/kg,全氮1.63 g/kg,全磷(P2O5)0.91 g/kg,全鉀(K2O)11.13 g/kg,水解氮(N)95.2 mg/kg,速效磷(P2O5)12.4 mg/kg,速效鉀(K2O)112.2 mg/kg,土壤pH 7.2,土壤含水量8.97%。

1.2 試驗設(shè)計

試驗于山東省花生研究所試驗站防雨干旱棚中進行,土壤風干、過篩(1 cm)后裝入底部直徑36 cm,高為26 cm 的塑料盆中,每盆裝土18 kg。選取飽滿均勻的種子,每盆播種7粒種子,播深均為3.5 cm,留5株長勢一致的幼苗。

設(shè)對照(土壤相對含水量75%～80%,CK)、鹽脅迫(含鹽量1.5 g/kg NaCl下保持土壤相對含水量75%～80%,S)、中度干旱脅迫(土壤相對含水量45%～50%,D)和旱鹽同時脅迫(1.5 g/kg NaCl+土壤相對含水量45%～50%,SD)4個處理,6次重復,隨機排列。土壤水分和鹽分控制均貫穿于花生全生育期。鹽脅迫處理以NaCl形式于裝盆前均勻混入土壤,土壤含水量采用質(zhì)量法控制澆水量。

于飽果期以處理和重復為單位,采用多點混合采樣法采集根際土壤樣本。采集根際土壤樣本時將植株小心地從盆中取出,去除根際附著不緊密的土壤,然后用無菌刷收集附著緊密的土壤,混合每盆中的植株根際土壤,每2盆根際土壤樣品混合為1個生物學樣本重復,每處理均獲取3個生物學重復,封入無菌袋,置于冰盒帶回實驗室,保存于-80℃冰箱備用。相關(guān)測試工作由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成,數(shù)據(jù)計算與制圖均在美吉生物云平臺進行。

1.3 土壤DNA 提取

收集所得土壤樣品利用OMEGA土壤總DNA提取試劑(OMEGA soil DNA kit)盒進行提取。所得DNA 采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop 2000分光光度計檢測DNA的純度和濃度。

1.4 16S rRNA 文庫構(gòu)建及高通量測序

稀釋后的基因組DNA 利用引物340F:CCTACGGGNBGCASCAG 以及805R:GACTACNVGGGTATCTAATCC 對16S rRNA 基 因的V3～V4區(qū)進行擴增。擴增程序如下:95℃預變性3 min;30 個循環(huán)包括(95℃,30 s;50℃,30 s;72℃,60 s);72℃,7 min。PCR 產(chǎn)物使用1.5%濃度的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測;根據(jù)PCR 產(chǎn)物濃度進行等濃度混樣,充分混勻后使用0.5×TBE濃度1.5%的瓊脂糖膠電泳純化PCR 產(chǎn)物,割膠回收目標條帶。產(chǎn)物純化試劑盒使用的是QIAGEN 公司的MinElute膠回收試劑盒。最后使用HiSeq2500進行250PE測序。

1.5 生物信息學分析

對花生根際土壤微生物的多樣性和豐富度進行Alpha多樣性和樣本間Beta多樣性分析,同時進行群落結(jié)構(gòu)統(tǒng)計分析和基于OTUs的物種組成聚類,分析挖掘樣本間物種組成差異和生物功能分析。

2 結(jié)果分析

2.1 根際微生物群落測序數(shù)據(jù)分析

供試的12個樣本共檢測出細菌47個門、154個綱、352個目、555個科、1003個屬和2024個種。獲得有效序列257 154條,以干旱脅迫處理的有效序列數(shù)最大72 154.67條,CK 有效序列數(shù)最小,僅55 306.3條。樣本序列長度在215.7～511.7 bp,但多數(shù)樣本序列平均長度在414.4～415.5 bp之間(表1)。Venn圖分析表明,CK、S、D、SD各處理中共有OTUs數(shù)2876個,單獨存在于各處理中的分別為155、149、129和108個,其中S、D和SD三個處理共有OTUs數(shù)較高,為360個,而CK、D和SD三個處理共有OTUs數(shù)較少,為210個。表明各處理樣本細菌組成相似,鹽脅迫、干旱脅迫對花生根際土壤樣本的物種組成影響不顯著(圖1)。

圖1 不同處理花生土壤樣本中OTU 數(shù)量維恩圖Fig.1 Venn diagram representing the total numbers of OTUs in the soil samples of peanut under different treatments

表1 各處理花生根際微生物群落測序數(shù)據(jù) (剔除可疑序列后)Table 1 Sequencing quantity of each sample after removing doubtful sequences

2.2 Alpha多樣性分析

2.2.1 Rank-Abundance曲線和稀釋曲線

Rank Abundance分析用于解釋物種的均勻度和豐富度。稀釋曲線反映各樣本在不同測序數(shù)量時的微生物多樣性,判斷本次測序數(shù)據(jù)量是否足夠。圖2所示,各樣本中物種OTU 數(shù)量以2000為分界點,小于2000時,曲線下降較為迅速、不平緩,表明樣本中對應物種相對豐度較高而均勻度較低。當OTU 數(shù)量大于2000時曲線平緩,表明對應的物種在根際土壤樣本中相對豐度較低,分布較均勻,不同樣本之間的物種均勻度差異不大(圖2左)。Shannoneven指數(shù)曲線顯示,當各樣本在測序量達到5000時,曲線趨于平緩,說明測序深度足夠,結(jié)果覆蓋所測樣本中的所有物種(圖2右)。

圖2 Rank-Abundance曲線和稀釋曲線Fig.2 Rank-Abundance curve and rarefaction curve

2.2.2 多樣性指數(shù)分析

表2表明,無論是反映群落多樣性(Community diversity)的Shannon、Simpson指數(shù),反映群落均勻 度(Community evenness) 的Simpsoneven、Shannoneven指數(shù),還是反映群落覆蓋度(Community coverage)的coverage指數(shù),其各處理間均無顯著差異,僅干旱脅迫下的群落豐富度(Community richness)chao和ace指數(shù)與對照間表現(xiàn)出顯著差異。說明干旱脅迫使花生根際細菌群落豐富度提高。

表2 各處理根際土壤樣本Alpha多樣性指數(shù)Table 2 Alpha diversity index of rhizosphere soil samples under the treatments

2.3 物種群落組成分析

2.3.1 門水平群落組成

門水平上,各處理樣本重復間取均值且others合并<0.01、相對豐度值5.00%以上的為優(yōu)勢菌門。圖3可見,各處理優(yōu)勢菌門均為放線菌門(Actinobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、酸桿菌門(Acidobacteria)和擬桿菌門(Gemmatimonadota)。無論干旱脅迫還是鹽脅迫均使優(yōu)勢菌門中變形菌門(Proteobacteria)和酸桿菌門(Acidobacteria)相對豐度降低,降幅分別為-7.73%～14.50%、6.20%～36.38%。干旱和鹽脅迫均使花生根際非優(yōu)勢菌門藍藻菌門(Cyanobacteria)的相對豐度較CK分別提高0.25倍和15.9倍,但干旱和鹽同時脅迫則使其相對豐度降低60.0%。

圖3 門水平各樣本菌落結(jié)構(gòu)柱狀圖Fig.3 Percentage of microbial community abundance at the phylum level in peanut rhizosphere

2.3.2 目水平群落組成

目水平上,各處理樣本重復間取均值且others合并<0.025、相對豐度值在5.00%以上的為優(yōu)勢菌目。圖4可見,各處理樣本的優(yōu)勢菌目為微球菌目(Micrococcales)、Vicinamibacterales、丙酸桿菌目(Propionibacteriales)、根瘤菌目(Rhizobiales)、鞘脂單胞菌目(Sphingomonadales)和伯克氏菌目(Burkholderiales)。無論是干旱鹽單獨脅迫還是同時脅迫,Vicinamibacterales、根瘤菌目(Rhizobiales)和鞘脂單胞菌目(Sphingomonadales)的相對豐度均明顯降低,三脅迫處理下的鞘脂單胞菌目(Sphingomonadales)較CK 降低均在40%以上,而丙酸桿菌目(Propionibacteriales)的相對豐度在干旱、鹽及旱鹽同時脅迫處理下均表現(xiàn)升高,升幅在5.38%～24.95%。非優(yōu)勢菌目藍藻菌目(Cyanobacteriales)相對豐度在鹽脅迫下極顯著升高,較CK升高102.5 倍,而SD 處理則使小單孢菌目(Micromonosporales)相對豐度較CK提高3.3倍。

圖4 目水平各樣本菌落結(jié)構(gòu)柱狀圖Fig.4 Percentage of microbial community abundance at the order level in peanut rhizosphere

2.4 Beta多樣性分析

2.4.1 樣本聚類分析和PLS-DA 分析

基于Weighted UniFrac距離,對所有樣本進行層級聚類分析,結(jié)果表明,依照花生根際微生物物種組成可將樣本劃分為4個不同類群,干旱脅迫、鹽脅迫、旱鹽同時脅迫和對照各處理樣本分別聚為一類,表明鹽脅迫、干旱脅迫和旱鹽同時脅迫處理下,花生根際細菌群落組成有明顯不同(圖5),即鹽脅迫和干旱脅迫非生物脅迫因素影響花生根際細菌群落組成。

偏最小二乘法判別分析(Partial Least Squares Discriminant Analysis,PLS-DA)結(jié)果表明,各處理樣本可明顯區(qū)分并分別聚成4個不同的類群,鹽脅迫、干旱脅迫和旱鹽雙重脅迫均使花生根際細菌群落組成分異較大,鹽脅迫和干旱脅迫均是影響花生根際細菌群落組成的重要因素(圖5右)。

圖5 Beta多樣性分析Fig.5 Beta diversity analysis

2.4.2 PcoA 分析

PCoA 分 析(Principal co-ordinates analysis)即主坐標分析,可用來研究樣本群落組成的相似性或差異性?；趗nweighted unifrac距離的PCoA 分析(圖6)表明,鹽脅迫、旱鹽雙重脅迫和對照樣本菌群組成差異不明顯,而干旱脅迫處理樣本與鹽脅迫、旱鹽雙重脅迫及對照樣本菌群間存在明顯差異。相較于輕度鹽脅迫,干旱脅迫對花生根際細菌群落組成有更大影響,說明花生根際細菌群落受根際微域環(huán)境的影響并隨其變化而重新響應。

圖6 PCoA 分析Fig.6 Principal co-ordinates analysis

2.5 物種差異分析

LEfSe采用線性判別分析(LDA)來估算每個組分(物種)豐度對差異效果影響的大小。通過LEfSe分析(LDA閾值為2)發(fā)現(xiàn),不同脅迫處理顯著影響的微生物類群,其樣本富集的物種類型存在較大差異(圖7)。與對照組、干旱脅迫處理組和鹽脅迫處理組相比,旱鹽同時脅迫處理的花生根際樣本中富集更多的Symbiobacteriia、腈降解菌目(Nitriliruptorales)、Thalassobaculales等,干旱脅迫處理富集全噬菌綱(Holophagae)、Subgroup_7、Diplorickettsiales等,鹽脅迫則使Kapabacteriales、Bradymonadales、未分類的藍藻菌門(unclassified_p_Cyanobacteria)、未分類的變形菌門(unclassified_c_Alphaproteobacteria)等物種富集。旱鹽同時脅迫處理和干旱脅迫處理均使得unclassified_c_Actinomarinales富集。

圖7 LEfSe物種差異分析Fig.7 Species diversity analysis of LEfSe

2.6 16S功能預測

圖8表明,干旱脅迫使花生根際細菌功能基因豐度值明顯升高,旱鹽同時脅迫則使其明顯降低。干旱脅迫使各類功能基因豐度值均最大,而SD 處理下的各類功能基因豐度值均最低,并以能源生產(chǎn)與轉(zhuǎn)化、氨基酸轉(zhuǎn)運和代謝、碳水化合物的運輸和代謝、轉(zhuǎn)錄和僅通用功能預測等5類功能基因豐度值升高明顯,干旱脅迫下5類功能基因豐度值較CK 提高均在10%以上,旱鹽同時脅迫處理的5類功能基因豐度值較CK 均降低10%以上,且降幅最大的無機離子的運輸與代謝類達15.69%。這與花生具有較強抗旱能力有關(guān),但重度干旱對花生根際微生物功能基因的影響有待深入研究。輕度鹽脅迫條件下,除次生代謝產(chǎn)物的生物合成、轉(zhuǎn)運和分解代謝豐度稍有降低外,其余類功能基因豐度均略有升高。適度的鹽脅迫對作物生長的促進作用有待深入研究。

圖8 土壤微生物菌群功能預測Fig.8 Prediction on the microbial functional features of Orthologous Groups (COG)

3 討論與結(jié)論

土壤微生物與環(huán)境間的關(guān)系極為復雜,不僅受土壤性質(zhì)、周圍非生物因素等環(huán)境條件的制約,還受植物種類、自身生物特性的影響[17]。土壤微生物在干旱、鹽漬化的惡劣環(huán)境中,須緩解各種非生物脅迫以生存定殖[18-19]。已有研究證實,土壤水鹽條件對根際土壤微生物活性有顯著影響,其中水分含量與微生物活性呈正相關(guān),鹽分含量與微生物活性呈負相關(guān)[20-21]。當鹽脅迫強度低于1.5 g/kg時,干旱脅迫對花生根際細菌群落組成有更大影響。也有研究結(jié)果認為,干旱對土壤微生物的多樣性影響不大,但是對群落組成有顯著影響[22-25]。干旱條件對細菌群落的影響強于根際?；哪珊抵参镄∪~錦雞兒根際土壤細菌群落主要由Firmicutes、Actinobacteria、Proteobacteria、Acidobacteria、Chloroflexi、Bacteroidetes 和Planctomycetes 構(gòu)成,Lactococcus、Bacillus、Pseudarthrobacter、Solibacillus和Pseudomonas為優(yōu)勢屬[17],干旱脅迫使Proteobacteria、Planctomycetes 和Acidobacteria豐度和數(shù)量降低[26]。驅(qū)動根際土壤微生物群落季節(jié)性分布的關(guān)鍵因子是季節(jié)變化引起的土壤養(yǎng)分、含水率和溫度變化[17,27]。

對黃河三角洲鹽堿地不同植物類型和土地利用方式下根際土壤微生物群落組成研究結(jié)果表明,根際微生物優(yōu)勢菌門相同,均為變形菌門、放線菌門、酸桿菌門、擬桿菌門、綠彎菌門和芽單胞菌門為優(yōu)勢物種[28-30]。中度耐鹽植物根際環(huán)境中含有較多的變形菌門和厚壁菌門細菌,輕度耐鹽植物根際環(huán)境中含有較多的酸桿菌門和芽單胞菌門細菌[29]。控制條件下的2.0 g/mg NaCl鹽脅迫和中度干旱脅迫強度下,花生根際土壤微生物群落均以變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、Saccharibacteria、綠彎菌門(Chloroflexi)和藍藻菌門(Cyanobacteria)等6 種菌門為主[31]。干旱和鹽脅迫均不同程度地降低了變形菌門(Proteobacteria)和放線菌門(Actinobacteria)的相對豐度,但顯著提高了藍藻菌門(Cyanobacteria)的含量[31]。

本試驗條件下,干旱脅迫、鹽脅迫及二者同時脅迫處理的優(yōu)勢菌門均為變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)和擬桿菌門(Gemmatimonadota)。干旱脅迫和鹽脅迫均使得變形菌門(Proteobacteria)和酸桿菌門(Acidobacteria)相對豐度降低,而藍藻菌門(Cyanobacteria)的相對豐度提高,但在干旱和鹽同時脅迫條件下藍藻菌門(Cyanobacteria)的相對豐度降幅達60.0%。具有較強固氮能力的藍藻門細菌豐度的提高可能對花生抵御旱鹽逆境具有重要作用?？梢?不同類型、不同成因的鹽堿土壤或人工模擬鹽堿脅迫條件,其植物根際微生物在門和綱水平的優(yōu)勢菌群差異不大,變形菌門、放線菌門、酸桿菌門、擬桿菌門、綠彎菌門和芽單胞菌門為優(yōu)勢物種,但在屬和種水平上物種差異較大,尤其是“未分類(unclassified)”和“沒有明確的分類信息或分類名稱(norank)”的物種差異較大。這就為特異功能物種和菌株的分離提供了更大的可能和空間,為促生菌的分離培養(yǎng)優(yōu)化和應用提供了技術(shù)基礎(chǔ)和前景。

土壤微生物功能預測分析顯示,信號轉(zhuǎn)導機制、防御機制及翻譯后修飾、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換和分子伴侶等相關(guān)功能在旱鹽雙重脅迫中活性更強[31]。膜轉(zhuǎn)運(Membrane transport)、氨基酸代謝(Aminoacids metabolism)和碳水化合物代謝(Carbohydrate metabolism)是沙地榆根際細菌群落中主要的代謝功能群[27]。本試驗條件下,干旱脅迫使花生根際細菌功能基因豐度值明顯升高,旱鹽同時脅迫則使其明顯降低,并以能源生產(chǎn)與轉(zhuǎn)化、氨基酸轉(zhuǎn)運和代謝、碳水化合物的運輸和代謝、轉(zhuǎn)錄和僅通用功能預測等5類功能基因豐度值升高明顯;輕度鹽脅迫條件下,次生代謝產(chǎn)物的生物合成、轉(zhuǎn)運和分解代謝功能群豐度稍有降低,其余類功能基因豐度均略有升高。適度鹽脅迫對作物生長的作用機制有待深入研究。

因此,建議今后豐富根際微環(huán)境研究對象的多樣性,綜合分析不同影響因子之間的內(nèi)在關(guān)系的基礎(chǔ)上,運用新技術(shù)、新方法從基因水平對根際微環(huán)境信號傳遞和基因定位等熱點問題進行系統(tǒng)研究,為進一步完善根際微生態(tài)系統(tǒng)作用機制和提高作物抗逆性提供理論支撐。