姜莉莉，武海斌，宮慶濤，孫瑞紅

（山東省果樹研究所，山東泰安271000）

核桃（Juglans regia L.）為胡桃屬多年生落葉喬木，因其果仁營養(yǎng)豐富，該樹種在我國具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會地位[1]。山東省是核桃主產(chǎn)區(qū)之一，種植面積近10 萬hm2[2]。近年來，由于管理松懈、反常氣候頻率增加，核桃病蟲害發(fā)生日益嚴(yán)重[3]。核桃炭疽病是危害核桃果實(shí)、導(dǎo)致落果、爛果的重要因素，發(fā)病率高達(dá)30%～50%，嚴(yán)重影響核桃產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展[4]。該病由膠孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides 侵染引起，在核桃近成熟期發(fā)生，高溫高濕條件可使病情加劇[5]。核桃干腐病是造成核桃減產(chǎn)的重要病害，病原菌為葡萄座腔菌屬Botryosphaeria[6]。核桃葉斑病病原菌為鏈格孢屬Alternaria[7]，可導(dǎo)致核桃葉片大面積枯黃，降低核桃結(jié)實(shí)量和果實(shí)飽滿度。

植物體微生物多樣性受環(huán)境因素、生理?xiàng)l件等多種因素影響[8]。高通量測序技術(shù)能夠獲得更加真實(shí)的植物微生物群落的分類和功能信息，揭示病原菌與植物間的互作關(guān)系[9]。本研究采用高通量測序技術(shù)分析核桃炭疽病病果與健果青皮的微生物多樣性，以期為病害的科學(xué)防治提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2020年8月27日，于山東省濟(jì)南市歷城區(qū)高爾鎮(zhèn)核桃園村（117°5′22"E，36°11′17"N），從15年生“香玲” 核桃樹采集核桃炭疽病果和健果各20 枚。以75%酒精擦拭果實(shí)青皮表面，干冰保存并送樣。

1.2 測序分析

核桃青皮微生物多樣性分析由北京諾禾致源科技股份有限公司代理完成。

采用CTAB 法對樣本的基因組DNA 進(jìn)行提取，以瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 的純度和濃度，以無菌水稀釋樣本至1 ng/μL。以稀釋后的基因組DNA 為模板，根據(jù)測序區(qū)域的選擇，分別使用帶Barcode 的16S V4 區(qū)引物 （515F 和806R）和ITS1區(qū)引物（ITS5-1737F 和ITS2-2043R）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。

PCR 產(chǎn)物使用2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測；對檢測合格的PCR 產(chǎn)物進(jìn)行磁珠純化和酶標(biāo)定量，根據(jù)產(chǎn)物濃度進(jìn)行等量混樣，充分混勻后使用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 產(chǎn)物，回收目的條帶。進(jìn)行文庫構(gòu)建，經(jīng)過Qubit 和qPCR 定量檢測合格后，使用NovaSeq6000 進(jìn)行上機(jī)測序。

從下機(jī)數(shù)據(jù)中拆分出各樣本數(shù)據(jù)，截去Barcode和引物序列后使用FLASH（V1.2.7）進(jìn)行拼接。參照Qiime（V1.9.1）的Tags 質(zhì)量控制流程，將數(shù)據(jù)嚴(yán)格過濾得到高質(zhì)量的Tags 數(shù)據(jù)。

利用Uparse 軟件（V7.0.1001）對所有樣本的全部Effective Tags 進(jìn)行聚類，默認(rèn)以97%的一致性（Identity）將序列聚類成為OTUs （Operational Taxonomic Units），同時(shí)會選取OTUs 的代表性序列，依據(jù)其算法原則，篩選的是OTUs 中出現(xiàn)頻數(shù)最高的序列作為OTUs 的代表序列。對OTUs 序列進(jìn)行物種注釋，用Mothur 方法與SILVA138（http://www.arb-silva.de/）的SSUrRNA 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行物種注釋分析（設(shè)定閾值為0.8～1），獲得分類學(xué)信息并分別在各個(gè)分類水平：kingdom （界），phylum （門），class（綱），order（目），family（科），genus（屬），species（種）統(tǒng)計(jì)各樣本的群落組成。使用MUSCLE（Version 3.8.31）軟件進(jìn)行快速多序列比對，得到所有OTUs代表序列的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系。以樣本中數(shù)據(jù)量最少的為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行均一化處理，并基于此進(jìn)行后續(xù)的α-和β-多樣性分析。

使用Qiime 軟件（V1.9.1）計(jì)算Observed-otus、Chao1、Shannon、Simpson、ace、Goods -coverage和PD_whole_tree 指數(shù)，使用R 軟件（V2.15.3）繪制稀釋曲線，并使用R 軟件進(jìn)行α-多樣性指數(shù)組間差異分析。

FunGuild 是真菌的環(huán)境功能數(shù)據(jù)庫，基于已有文獻(xiàn)支持，對真菌的生態(tài)功能進(jìn)行了歸類，構(gòu)建了FunGuild 數(shù)據(jù)庫?；跀U(kuò)增子分析得到的物種信息，可以查詢文獻(xiàn)中已有的物種在環(huán)境中的生態(tài)功能。

PICRUSt 是基于Greengene 數(shù)據(jù)庫中OTU 的tree 和基因信息，推斷它們的共同祖先的基因功能譜，同時(shí)對數(shù)據(jù)庫中其它未測物種的基因功能譜進(jìn)行推斷，構(gòu)建古菌和細(xì)菌域全譜系的基因功能預(yù)測譜，最后將測序得到的菌群組成“映射”到數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行菌群代謝功能預(yù)測。

2 結(jié)果與分析

2.1 稀釋曲線

由圖1和圖2可以看出，隨著測序深度的增加，各樣本的稀釋曲線均逐漸趨于平緩，表明本試驗(yàn)取樣合理可靠，該測序深度可以反映核桃青皮的微生物群落結(jié)構(gòu)。同時(shí)，由圖1可以看出，核桃病果的ITS 區(qū)OUT 數(shù)量遠(yuǎn)高于健果，可見核桃炭疽病果青皮的真菌數(shù)量較健果明顯增多。

圖1 核桃病果與健果的ITS 稀釋曲線Figure1 ITSdilutioncurveofwalnutinfectedandhealthyfruit

圖2 核桃病果與健果的16S 稀釋曲線Figure 2 16S dilution curve of walnut infected and healthy fruit

2.2 核桃病果與健果的微生物多樣性指數(shù)比較

Shannon 指數(shù)用于表征群落多樣性，Simpson 指數(shù)用于表征優(yōu)勢度。由表1可以看出，核桃健果的真菌和細(xì)菌Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)均低于病果，可見“香玲”核桃感染炭疽病后真菌和細(xì)菌的多樣性和優(yōu)勢度升高。

Chao1 指數(shù)和ACE 指數(shù)用于表征群落豐度。由表1可以看出，核桃健果的真菌Chao1 指數(shù)和ACE指數(shù)均低于病果，可見“香玲”核桃受炭疽病感染后真菌群落豐度提高，這與圖1測序深度的結(jié)果一致。

表1 核桃病果與健果青皮的真菌與細(xì)菌α-多樣性指數(shù)Table 1 α-diversity of fungus and bacteria of walnut infected and healthy fruit green peel

2.3 核桃炭疽病病果與健果青皮的真菌相對豐度比較

由圖3可以看出，“香玲” 核桃感染炭疽病后，青皮刺盤孢屬Colletotrichum（炭疽病菌）相對豐度明顯提高。此外，赤霉Gibberella（赤霉病菌）、葡萄座腔菌屬Botryosphaeria （干腐病菌）、鏈格孢屬Alternaria（葉斑病菌）和月盾霉屬Peltaster（煤污病菌）等病原菌的相對豐度也明顯提高。

圖3 核桃炭疽病病果與健果青皮屬水平真菌相對豐度比較Figure 3 Relative abundance comparison of fungus in genus level of walnut anthracnose-infected and healthy fruit peel

2.4 核桃炭疽病病果與健果青皮的細(xì)菌相對豐度比較

由圖4可以看出，“香玲” 核桃受炭疽病感染后，青皮中鞘氨醇桿菌Sphingobacterium、根瘤菌Rhizobium、叢毛單胞菌屬Comamonas、假單胞菌屬Pseudomonas、埃希氏桿菌屬Escherichia 和寡養(yǎng)單胞菌Stenotrophomonas 的相對豐度明顯提高。

圖4 核桃炭疽病病果與健果青皮屬水平細(xì)菌相對豐度比較Figure 4 Relative abundance comparison of bacteria in genus level of walnut anthracnose-infected and healthy fruit peel

2.5 核桃炭疽病病果與健果青皮的真菌功能預(yù)測

由圖5可以看出，“香玲” 核桃感染炭疽病后，青皮動物病原菌、內(nèi)生植物病原菌、動物內(nèi)共生菌、寄生性真菌含量顯著提高。

圖5 核桃病果與健果青皮真菌功能預(yù)測比較Figure 5 Fungus functional prediction comparison of walnut anthracnose-infected and healthy fruit peel

2.6 核桃炭疽病病果與健果青皮的細(xì)菌功能預(yù)測

由圖6可以看出，“香玲” 核桃感染炭疽病后，青皮環(huán)境信息處理和細(xì)胞進(jìn)程相關(guān)細(xì)菌的含量顯著提高。

圖6 核桃病果與健果果皮細(xì)菌功能預(yù)測比較Figure 6 Bacteria functional prediction comparison of walnut anthracnose-infected and healthy fruit peel

3 討論與結(jié)論

目前，國內(nèi)外對于核桃病原菌的分離及研究多采用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法，僅關(guān)注病原菌本身[10]。本研究采用高通量測序技術(shù)分析“香玲”核桃感染炭疽病后的青皮微生物多樣性，共獲得376 個(gè)屬真菌和230個(gè)屬細(xì)菌。α-多樣性指數(shù)分析發(fā)現(xiàn)，“香玲”核桃感染炭疽病后，真菌和細(xì)菌Shannon 指數(shù)和Simpson指數(shù)均明顯提高，表明其真菌和細(xì)菌的多樣性和優(yōu)勢度升高。同時(shí)，真菌Chao1 指數(shù)和ACE 指數(shù)也明顯提高，可見“香玲”核桃受炭疽病感染后真菌群落豐度提高。

真菌相對豐度分析發(fā)現(xiàn)，除青皮刺盤孢屬Colletotrichum（炭疽病菌）外，“香玲”核桃感染炭疽病后，青皮的赤霉Gibberella（赤霉病菌）、葡萄座腔菌屬Botryosphaeria （干腐病菌）、鏈格孢屬Alternaria（葉斑病菌）和月盾霉屬Peltaster（煤污病菌）等病原菌的相對豐度也明顯提高。生產(chǎn)中可采用三唑類、苯并咪唑類等殺菌劑進(jìn)行綜合防治。

細(xì)菌相對豐度分析發(fā)現(xiàn)，“香玲”核桃受炭疽病感染后，青皮中鞘氨醇桿菌Sphingobacterium、根瘤菌Rhizobium、假單胞菌屬Pseudomonas 等益生菌的相對豐度明顯提高。表明病原菌相對豐度的提高可在一定程度上促進(jìn)益生菌的增殖。

功能預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)，“香玲” 核桃感染炭疽病后，青皮內(nèi)生植物病原菌、寄生性真菌及環(huán)境信息處理和細(xì)胞進(jìn)程相關(guān)細(xì)菌的含量顯著提高。