郭青青 周 蓉 陳 雪 陳 蕾 李加納 王 瑞,*

甘藍型油菜桔紅花顯性基因候選區(qū)域的NGS定位及InDel標(biāo)記開發(fā)

郭青青1,2,**周 蓉1,2,**陳 雪1,2陳 蕾1,2李加納1,2王 瑞1,2,*

1西南大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物科技學(xué)院, 重慶 400715;2重慶市油菜工程技術(shù)研究中心, 重慶 400715

甘藍型油菜花色的選育和改良已成為種質(zhì)資源鑒定和材料創(chuàng)制的重要研究方向。目前為止, 甘藍型油菜桔紅花顯性基因定位的研究還未見報道。本研究以甘藍型油菜雙單倍體(doubled haploid, DH)純系黃花Y05和桔紅花R08雜交, 分析桔紅花性狀遺傳模式。在F2群體中選取30株極端桔紅花和30株極端純黃花構(gòu)建葉片DNA子代池和花瓣RNA子代池, 對親本和DNA子代池進行30×重測序, 對RNA子代池進行6G測序。以法國甘藍型油菜Darmor-bzh為參考序列, QTL-seq流程和MMAPPR流程相互結(jié)合鑒定桔紅花基因候選區(qū)間。利用IGV軟件可視化分析候選區(qū)間內(nèi)插入缺失(InDel)變異位點, 根據(jù)候選區(qū)間信息設(shè)計InDel引物。結(jié)果表明, 桔紅花性狀受1對顯性主效基因控制, 全基因組重測序定位桔紅花性狀基因候選區(qū)間結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測序定位結(jié)果高度一致, 均位于法國甘藍型油菜Darmor-bzh A07染色體18～19 Mb。聚丙烯酰胺凝膠電泳篩選到3個與桔紅花性狀緊密連鎖共分離的InDel標(biāo)記。這些研究為精細定位桔紅花顯性候選基因以及分子標(biāo)記輔助選育甘藍型油菜桔紅花新材料提供新思路。

甘藍型油菜; 桔紅花性狀; 基因定位; 測序; 分子標(biāo)記

甘藍型油菜屬于十字花科(Cruciferace)蕓薹屬()植物, 是食用植物油、蛋白質(zhì)飼料和能源的原料作物。近幾年, 油菜花觀光旅游已成為發(fā)展油菜產(chǎn)業(yè)和促進農(nóng)民增收的重要內(nèi)容[1]。因此, 加快選育創(chuàng)制不同遺傳背景的油菜花色新品種具有重要的理論和現(xiàn)實意義。

油菜花色是指其成熟花瓣的顏色, 栽培油菜花色主要表現(xiàn)為黃色、白色及其中間衍生色。對油菜白花性狀的研究已取得一系列成果[2-4], 由于不同學(xué)者所用材料、方法不盡相同, 得出的花色遺傳模式結(jié)論也有多種。部分學(xué)者認為, 甘藍型油菜白花性狀由單個顯性基因控制[5-6], 也有不少學(xué)者發(fā)現(xiàn), 白花性狀由1對不完全顯性基因控制, 表現(xiàn)為質(zhì)量性狀[4,7-10]。而董育紅等[11]、黃萌等[12]、田露申等[13-14]和柳麗[15]均發(fā)現(xiàn)白花性狀受1對不完全顯性基因控制, 但表現(xiàn)出數(shù)量性狀的遺傳特點。而白菜型油菜白花性狀由單個隱性基因控制[16], 芥菜型油菜白花性狀由2對隱性基因控制[17]。與白花性狀相比, 其他花色的遺傳研究結(jié)果相對較少。李莓等[18]、淡亞彬[19]、Yao等[20]均發(fā)現(xiàn)甘藍型油菜桔紅花色由2對隱性核基因控制, Yao等[20]進一步將隱性基因確定為和。李莓等[18]還證實大白菜桔紅色花由1對隱性基因控制。Zhang等[21]以黃花和桔紅花大白菜為材料作遺傳分析發(fā)現(xiàn), 大白菜桔紅花性狀由單隱性基因控制。

至今已有多位學(xué)者進行了花色相關(guān)基因染色體定位, 并開發(fā)出多個與花色緊密連鎖的分子標(biāo)記。劉雪平等[22]利用RAPD標(biāo)記發(fā)現(xiàn)白花基因與高芥酸基因具有連鎖關(guān)系, 并篩選到1個與黃花和低芥酸基因均連鎖的標(biāo)記S92-1400。Huang等[23]以甘藍型白花和黃花油菜為材料, 獲得了與白花基因連鎖的3個AFLP和2個SSR標(biāo)記, 其中位于白花基因兩側(cè)的標(biāo)記EA06MG08和EA11MG12遺傳距離分別為3.0 cM和3.2 cM。張豹等[6]結(jié)合SSR技術(shù)和QTL分析, 將甘藍型油菜白花基因定位到了C03染色體上。隨著二代測序技術(shù)的發(fā)展以及SNP標(biāo)記的開發(fā), 集團分離分析法(bulked segregant analysis, BSA)廣泛應(yīng)用于目標(biāo)性狀的基因定位。趙君偉[16]通過集團分離分析法以及SNP和InDel標(biāo)記分析2330個單株, 將花色基因定位在白菜參考基因組A02染色體162 kb區(qū)間, 且SNP標(biāo)記與白花基因共分離。陳雪等[24]利用二代測序技術(shù)和構(gòu)建混池的原理將甘藍型油菜白花性狀基因定位在C03染色體52～55 Mb, 并在此區(qū)間760 kb內(nèi)篩選出6個與該基因緊密連鎖共分離的SSR標(biāo)記。

甘藍型油菜桔色花基因定位方面文獻很少, 僅有Yao等[20]將甘藍型油菜隱性桔紅花基因定位在C09染色體1.000～5.464 Mb區(qū)間; 將基因鎖定在1.86 cM區(qū)間, 同時篩選出1個共顯性標(biāo)記BnA09-22與緊密連鎖。目前為止, 關(guān)于甘藍型油菜桔紅花顯性基因定位的研究還未見報道。本研究基于BSA的原理, 利用甘藍型油菜F2花色分離群體, 分別進行葉片重測序和花瓣轉(zhuǎn)錄組測序, 定位桔紅花顯性基因候選區(qū)間, 同時通過IGV軟件可視化候選區(qū)間InDel變異, 開發(fā)InDel連鎖標(biāo)記, 以期為精細定位桔紅花顯性基因以及分子標(biāo)記轉(zhuǎn)育甘藍型油菜桔紅花新材料奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

甘藍型油菜純系黃花Y05和純系桔紅花R08是由西南大學(xué)李加納油菜生物學(xué)團隊通過小孢子加倍選育的雙單倍體(DH)純系材料。2018年將純系黃花Y05與純系桔紅花R08雜交獲得F1, 次年獲得F2。觀察F1和F2群體的花色分離。從F2群體中選取極端桔紅花和極端黃花構(gòu)建桔紅花子代池和黃花子代池, 用于桔紅花基因候選區(qū)間定位。

1.2 田間試驗和性狀調(diào)查

2019年3月花期, F1單株自交獲得F2。2019年9月對親本和F2進行育苗播種, 10月將單株移栽到西南大學(xué)歇馬油菜基地試驗田, 行距為0.2 m, 株距為0.2 m。2020年1月苗期對F2群體458個單株插牌編號。2020年3月記錄458個單株的盛花期花色。

1.3 子代池構(gòu)建

2020年1月苗期, 對親本及F2群體每個單株插牌編號, 取幼嫩葉0.2 g。使用OMEGA HP Plant DNA試劑盒提取2個親本以及F2代的30株極端黃花和30株極端桔紅花單株幼嫩葉DNA。等量混合F2代單株幼嫩葉DNA, 構(gòu)建桔紅花葉片DNA子代池和黃花葉片DNA子代池。初花期時, 在F2群體中選取極端純桔紅花和極端純黃花各30株, 取每株剛張開的花瓣0.15 g, 使用EZ-10 Total RNA Mini-Preps Kits試劑盒提取RNA。等量混合RNA, 構(gòu)建桔紅花花瓣RNA子代池和黃花花瓣RNA子代池。2個葉片DNA子代池和2個親本葉片DNA建庫類型為DNA-350 bp, 以illumina HiSeq PE150方法測序, 測序深度為30×。2個花瓣RNA子代池建庫類型為DNA-300 bp, 以illumina HiSeq PE125方法測序, 測序數(shù)據(jù)量為6 G。

1.4 數(shù)據(jù)處理

啟動QTL-seq流程[25], 過濾低質(zhì)量reads; 將過濾后的親本reads與法國甘藍型油菜參考組Darmor-bzh Brassica_napus.v4.1.fa (http://www.geno scope.cns.fr/brassicanapus/)比對并替換SNP, 構(gòu)建親本參考組, 再將親本reads比對到新構(gòu)建的親本參考基因組上, 找出錯配造成的SNP, 用于后續(xù)排除和過濾。將質(zhì)控過濾后的2個DNA子代池reads分別與親本參考基因組比對。使用Coval Refine過濾, Coval Call檢測變異位點, 計算2個葉片DNA子代池SNP-index及2個子代池SNP-index的差值delta (SNP-index)。利用R包制作delta (SNP-index)滑窗分析圖, 鑒定桔紅花顯性基因候選區(qū)間。

利用Bwa軟件將2個花瓣RNA子代池測序數(shù)據(jù)與法國甘藍型油菜參考基因組Darmor-bzh比對, 得到sam文件后進行sort排序, 去除PCR重復(fù), 建立索引文件。用GATK軟件確定重新比對區(qū)域, 最大限度降低InDel附近比對錯誤率, 獲得2個花瓣RNA子代池的bam文件(http://www.broadinstitute. org/gatk/)。啟動MMAPPR分析流程[26], 計算SNP頻率、歐氏距離Loess fit of ED4檢測峰值和鑒定桔紅花基因候選區(qū)間。

1.5 引物設(shè)計與電泳

使用GATK軟件獲得2個親本葉片和2個子代池葉片bam文件, samtools截取4個bam文件候選區(qū)間, IGV軟件查看2個親本和2個子代池截取文件, 尋找桔紅花基因候選區(qū)間InDel, 鎖定起始和終止物理位置, 使用Vector和Blast設(shè)計InDel引物, 由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成引物序列。隨機選取F2群體極端黃花和桔紅花各11株幼嫩葉的DNA作為模板用于PCR擴增。PCR體系包含2.2 μL模板、0.25 μL dNTP、前后引物各0.36 μL、0.31 μL酶(2.5 U μL)、1.9 μL 10×PCR buffer (含Mg2+), 最后補充ddH2O至8.90 μL。PCR程序為94℃ 5 min; 94℃ 30 s, 52～60℃ 30 s, 72℃ 30 s, 共35個循環(huán); 72℃ 5 min; 4℃保存。8%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離PCR擴增產(chǎn)物, 最后用銀染法進行顯影。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃花Y05和桔紅花R08組合后代表型觀察和遺傳分離

甘藍型油菜黃花純系Y05與桔紅花純系R08正反交F1代均為桔紅花, F2代純桔紅花和純黃花分離明顯(圖1), 呈顯著的質(zhì)量性狀或主效基因分布特點。并且桔紅花的花藥呈現(xiàn)桔紅色, 與黃花的黃色花藥有明顯區(qū)別。

2年田間試驗數(shù)據(jù)顯示, 桔紅花單株和黃花單株的實際值分別為108∶41和333∶125, 接近3∶1的分離比例, 按1對基因的控制模式進行χ2測驗, χ2值分別為0.37和1.16, 符合理論預(yù)測, 即桔紅花和黃花性狀分離比符合3∶1的分離規(guī)律(表1), 推測桔紅花性狀受1對顯性基因或主效基因控制。

2.2 重測序DNA子代池數(shù)據(jù)分析

對親本和子代池葉片重測序質(zhì)控過濾后的數(shù)據(jù)進行測序深度和覆蓋度分析(圖2)發(fā)現(xiàn), 19條染色體上測序深度平均為20×, 覆蓋度和SNP檢出率達到飽和。因此所有樣本數(shù)據(jù)量足夠, 測序質(zhì)量合格, 測序數(shù)據(jù)與法國甘藍型油菜參考組Darmor-bzh比對結(jié)果正常, 可用于變異分析和鑒定目標(biāo)性狀基因候選區(qū)間。

過濾掉桔紅花和黃花2個子代池中SNP-index均小于0.3的位點, 分別計算每個子代池的SNP-index和2個子代池之間的delta (SNP-index)。以滑動窗口法(窗口大小為2 Mb, 滑動步長為50 kb)對delta (SNP-index)在19條染色體上作圖。置信區(qū)間設(shè)置為95%和99%, 置信水平以上窗口作為候選區(qū)間(圖3)。除chrA07染色體外, 其余18條染色體delta (SNP- index)紅線都在置信區(qū)間范圍內(nèi)。Darmor-bzh A07染色體18～19 Mb區(qū)間delta (SNP-index)峰值達到極顯著水平, 顯示甘藍型油菜桔紅花顯性基因在此候選區(qū)間之內(nèi)。

表1 黃花Y05與桔紅花R08雜交F2群體花色分離比例

圖1 甘藍型油菜黃花Y05和桔紅花R08花瓣形態(tài)比較

A1與A2: 黃花Y05; B1與B2: 桔紅花R08。

A1 and A2: yellow petal Y05; B1 and B2: orange petal R08.

圖2 甘藍型油菜19條染色體上重測序平均深度和覆蓋度

黑線: 利用滑動窗口計算得到的平均測序深度曲線。

Black lines: refer to the average sequencing depth curve using a sliding window.

2.3 轉(zhuǎn)錄組子代池數(shù)據(jù)分析

更改參考組Darmor-bzh基因序列染色體名稱(chrA01～chrA10、chrC01～chrC09更改為chr1～chr19),使用GATK軟件處理黃花花瓣子代池和桔紅花花瓣子代池RNA測序數(shù)據(jù), 獲得2個RNA子代池bam文件。啟動MMAPPR流程, 利用2個子代池SNP頻率計算ED4(Loess fit), 以0.6為閾值, 桔紅花顯性基因定位在chr7(A07)染色體18～19 Mb (圖4)?；ò贽D(zhuǎn)錄組測序定位桔紅花顯性基因染色體區(qū)域與葉片DNA重測序定位結(jié)果高度一致。

圖3 甘藍型油菜19條染色體上delta (SNP-index)分布

藍點: delta (SNP-index)位點; 紅線: 利用滑動窗口數(shù)計算的delta (SNP-index)的變化趨勢; 綠線: 顯著性為95%的閾值; 橘線: 顯著性為99%的閾值。

Blue dot: delta (SNP-index); Red line: sliding window average of delta (SNP-index); Green lines: sliding window average of 95%-confidence interval upper/lower side; Orange line: sliding window average of 99%-confidence interval upper/lower side.

圖4 甘藍型油菜19條染色體上ED4 (Loess fit)和A07染色體上ED4 (Loess fit)

2.4 IGV可視化桔紅花基因候選區(qū)間InDel變異

基于重測序和轉(zhuǎn)錄組定位桔紅花基因候選區(qū)間結(jié)果, 使用samtools軟件view參數(shù)截取親本和兩子代池bam文件中的A07染色體18～19 Mb區(qū)間。對截取的4個bam文件排序、建立索引后導(dǎo)入IGV軟件, 可視化查看兩親本P1 (Y05)、P2 (R08)和桔紅花子代池(R)、黃花子代池(Y)中A07染色體18～19 Mb區(qū)間的InDel變異(圖5), 滑動IGV顯示窗口, 在此區(qū)間找到3個遺傳穩(wěn)定的small InDel。親本之間的InDel差異在2個子代池中穩(wěn)定表現(xiàn)和遺傳。

圖5 IGV可視化候選區(qū)間InDel變異

2.5 InDel引物設(shè)計和聚丙烯酰胺電泳

3個InDel均位于A07染色體18～19 Mb, IGV軟件鎖定其物理位置, 結(jié)合使用Vector和Blast設(shè)計InDel 引物(表2)。聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果表明, 3個InDel標(biāo)記均能準(zhǔn)確區(qū)分F2極端黃花和極端桔紅花單株, 僅圖6-C中24桔紅花單株條帶為交換株(圖6), 推斷桔紅花性狀候選基因與這3個small InDel標(biāo)記緊密連鎖共分離。

表2 基于候選區(qū)間設(shè)計的InDel引物序列

圖6 黃花和桔紅花親本及F2代單株電泳

M: 20 bp ladder; A: InDel-65; B: InDel-69; C: InDel-56; 1: 黃花親本; 2: 桔紅花親本; 3～13: F2群體11個黃花單株; 14～24: F2群體11個桔紅花單株。

1: parents with yellow petal; 2: parents with orange petal; 3–13: 11 yellow petal plants in F2population; 14–24: 11 orange petal plants in F2population.

3 討論

蕓薹屬中甘藍型油菜桔紅花研究報道文獻較少,僅有李莓等[18]、淡亞彬[19]、Yao等[20]發(fā)現(xiàn)甘藍型油菜桔紅花性狀由2對隱性基因控制。而本研究所用甘藍型油菜桔紅花材料性狀表現(xiàn)為1對顯性基因或主效基因遺傳特點, 表型觀察發(fā)現(xiàn), 除花瓣顏色為桔紅色外, 花藥顏色同時為桔紅色, 與黃花的黃色花藥明顯不同, 且能穩(wěn)定遺傳。因而, 本研究材料的桔紅花基因應(yīng)與前人所研究的甘藍型油菜桔紅花基因在功能和位點上有所區(qū)別。

對有參考序列物種進行全基因組重測序, 在全基因組水平掃描并檢測堿基突變位點, 通過計算SNP變異和頻率, 可以快速進行正向遺傳學(xué)性狀定位。近年來基于二代測序的BSA分析技術(shù)成為快速準(zhǔn)確定位質(zhì)量性狀或主效基因的有力工具。因其不需構(gòu)建復(fù)雜定位群體, 不依賴遺傳圖譜和大量分子標(biāo)記, 且周期短、效率高, 目前已在多種作物中用于定位質(zhì)量性狀或主效基因, 快速篩選靶基因以獲得緊密連鎖分子標(biāo)記[27-32]。在利用QTL-seq重測序定位甘藍型油菜桔色花文獻中, Yao等[20]將甘藍型油菜桔紅花隱性基因定位于C09染色體1.00～5.46 Mb區(qū)間。丁戈等[33]將控制桔黃花隱性基因定位在C09染色體區(qū)域4.64～8.28 Mb。QTL-seq原理是基于F2群體或重組自交系(RIL)群體開發(fā)的代碼流程, 但這2篇文獻中作者均以后代較為復(fù)雜的回交群體作為研究對象, 會在一定程度上使SNP頻率偏分離, 導(dǎo)致定位區(qū)間顯示較大, delta (SNP-index)信號不明顯。

本研究對甘藍型油菜桔紅花顯性基因F2花色分離群體進行葉片DNA重測序和花瓣RNA轉(zhuǎn)錄組測序, 在DNA水平和RNA轉(zhuǎn)錄本表達量水平分別使用QTL-seq和MMAPPR鑒定桔紅花顯性基因候選區(qū)間。MMAPPR實際上是歐式距離算法的BSR分析, 其優(yōu)勢是檢測到的信號均在基因區(qū)域, 根據(jù)樣品表達量可以初步驗證候選位點或候選基因。但RNA-seq外顯子拼接成轉(zhuǎn)錄本, 與參考組比對檢測基因組變異位點時存在gap, 導(dǎo)致部分區(qū)域SNP鑒定不準(zhǔn)確。另外, RNA水平上有時會出現(xiàn)RNA編輯現(xiàn)象, 造成非DNA水平上的SNP突變。因此, MMAPPR方法檢測SNP的準(zhǔn)確性沒有QTL-seq高, 并且RNA轉(zhuǎn)錄本測序時, 由于每條基因表達量不均一, 會對后續(xù)SNP鑒定造成干擾。同時, 同源染色體等位基因表達量的不均衡還可能會出現(xiàn)低估雜合位點的情況。

傳統(tǒng)分子標(biāo)記的應(yīng)用多集中在RAPD、AFLP標(biāo)記等, 由于其穩(wěn)定性、重演性差, 現(xiàn)已很少用于作物標(biāo)記開發(fā)。SSR串聯(lián)重復(fù)序列具有一定的物種穩(wěn)定性, 可以通過NGS測序批量化設(shè)計某一物種的SSR引物數(shù)據(jù)庫。此類重復(fù)序列一般分布在基因間區(qū), 開發(fā)的SSR標(biāo)記也位于基因間區(qū)。不過SSR位點易發(fā)生突變, 導(dǎo)致后續(xù)結(jié)果分析模棱兩可。而InDel作為高通量分子標(biāo)記, 具有各類遺傳標(biāo)記的優(yōu)點, 且開發(fā)成本隨測序技術(shù)的發(fā)展不斷降低。InDel標(biāo)記的開發(fā)完全基于序列差異, 開發(fā)過程中存在較少的無多型位點。相比于其他分子標(biāo)記, 基因組同一位點僅有極小概率發(fā)生相同長度大小的InDel變異, 避免了特異性和復(fù)雜性帶來的后續(xù)分析模糊[34]。

以往在水稻[35]、玉米[36]、棉花[37]、大麥[38]、油菜[39]等農(nóng)作物中開發(fā)InDel標(biāo)記時, 均以所用材料的測序數(shù)據(jù)與參考組比對, 鑒定InDel變異, 根據(jù)插入缺失序列, 在全基因組上開發(fā)InDel引物公共數(shù)據(jù)庫。全基因組上的InDel引物數(shù)量豐富, 即使在染色體某一區(qū)域選擇InDel引物篩選驗證標(biāo)記, 工作量也很大。而本研究通過對分離群體進行重測序, 結(jié)合使用QTL-seq和MMAPPR分析流程, 以法國甘藍型油菜Darmor-bzh序列為參考組, 葉片DNA重測序和花瓣RNA轉(zhuǎn)錄組測序相互驗證, 快速鑒定出甘藍型油菜桔紅花顯性基因位于A07染色體18～19 Mb候選區(qū)間。同時利用IGV軟件對親本、子代池bam文件實現(xiàn)桔紅花顯性基因候選區(qū)間InDel變異的可視化, 直觀地展示了InDel所處染色體物理區(qū)間以及來源于親本之間的InDel差異在兩子代池中的表現(xiàn)和遺傳情況。在可視化直接查看兩親本和兩子代池染色體特定區(qū)域InDel變異的基礎(chǔ)上設(shè)計InDel引物, 通過聚丙烯酰胺凝膠電泳在F2花色分離群體高效開發(fā)桔紅花顯性候選基因連鎖InDel分子標(biāo)記, 可為桔紅花顯性基因精細定位奠定研究基礎(chǔ), 同時為開發(fā)農(nóng)作物質(zhì)量性狀或主效基因連鎖標(biāo)記提供一種快速有效的解決思路。

4 結(jié)論

甘藍型油菜桔紅花性狀由1對顯性基因或主效基因控制。桔紅花性狀顯性基因候選區(qū)間定位于A07染色體18～19 Mb區(qū)間, 在此區(qū)間開發(fā)和驗證了3個與桔紅花顯性基因緊密連鎖共分離的InDel標(biāo)記。

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Location and InDelmarkers for candidate interval of the orange petal gene inL. by next generation sequencing

GUO Qing-Qing1,2,**, ZHOU Rong1,2,**, CHEN Xue1,2, CHEN Lei1,2, LI Jia-Na1,2, and WANG Rui1,2,*

1College of Agronomy and Biotechnology, Southwest University, Chongqing 400715, China;2Chongqing Engineering Research Center for Rapeseed, Chongqing 400715, China

The petal color has been one of the major goals of breeding and genetic research inLTo date, there have been no reports about interval location of dominant orange petal gene trait inL. In this study, we constructed an F2mapping population with 458 individuals from the cross between DH Y05 (yellow petal) and DH R08 (orange petal). Whole-genome re-sequencing of DNAs and transcriptome sequencing of RNAs were from two populations each composed of 30 individuals showing extreme opposite trait for a given phenotype in a segregating progeny. Then we performed 30× and 6G of sequencing. Darmor-bzh as the reference genome was aligned to sequence data from the two bulks and parents. QTL-seq and Mutation Mapping Analysis Pipeline for Pooled RNA-seq (MMAPPR) workflow were applied to identify the candidate region of the orange petal gene. The insertion-deletion (InDel) sites can be visualized in candidate interval by Integrative Genomics Viewer (IGV). Based on these Indel variations, we used Vector and Blast to design InDel primers. The results indicated that the orange petal trait was controlled by a dominant major gene. A major candidate region was identified on chromosome A07 (18–19 Mb) of Darmor-bzh. Three InDel markers linked to the orange petal gene were screened by Polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE). This study may provide a novel idea for fine mapping dominant orange petal gene as well as marker assisted selection.

L.; orange petal; gene mapping; sequencing; molecular marker

10.3724/SP.J.1006.2021.04236

本研究由西南大學(xué)校創(chuàng)項目(X202010635478)和國家重點研發(fā)計劃項目“七大作物育種”(2016YFD0101300)資助。

This study was supported by the Innovation Project of Southwest University Students (X202010635478) and the National Key Research and Development Program of China (2016YFD0101300).

王瑞, E-mail: Ruiwang71@163.com

**同等貢獻(Contributed equally to this work)

郭青青, E-mail: 1833266719@qq.com; 周蓉, E-mail: 1822701415@qq.com

2020-10-31;

2021-01-13;

2021-02-18.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20210216.1539.008.html