李前輝，郭浩翔，謝小娟，張宜林

糖尿病心肌病是糖尿病的一種主要心血管并發(fā)癥，引起心力衰竭，并最終導致糖尿病病人死亡率增加[1]。糖尿病病人心臟對再灌注損傷敏感性和預后較非糖尿病病人更差[2]。有研究顯示，糖尿病可消除各種藥物或缺血預處理對缺血心肌的保護作用[3]。因此，了解糖尿病心肌缺血再灌注損傷發(fā)病機制及發(fā)現(xiàn)新型預防藥物極其重要。在心臟病學中，咪達唑侖可作為心臟外科手術和心肌灌注診斷和治療程序之前的麻醉前藥物，已有研究顯示，咪達唑侖對心肌缺血再灌注損傷具有一定的保護作用[4]，但咪達唑侖對2型糖尿病心肌缺血再灌注的作用尚不明確。有研究顯示，炎癥反應和氧化應激增加是誘導糖尿病心臟再灌注損傷的主要因素[5]。本研究觀察咪達唑侖對2型糖尿病心肌缺血再灌注大鼠心肌損傷、炎癥反應和氧化應激的影響，以期為2型糖尿病心肌缺血再灌注損傷的預防提供基礎醫(yī)學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗試劑 咪達唑侖注射液(宜昌人福藥業(yè)有限責任公司生產，批號：180305)，蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒(上海研瑾生物，貨號：J-SG1120-10)，肌酸激酶同工酶(creatine kinase MB，CK-MB)、乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase，LDH)、心肌肌鈣蛋白I(cardiactroponin I，cTnI)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、谷胱甘肽(glutathione，GSH)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、白細胞介素(interleukin，IL)-6、IL-1β、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)試劑盒(上海聯(lián)碩生物科技有限公司，貨號：ml002220、ml042664、ml042326、ml042384、ml010129、ml042383、ml059476、ml037361、ml002859)，Annexin-V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒(南京碧波生物科技有限公司生產，BA11100)，2，2聯(lián)喹啉-4，4-二甲酸二鈉(BCA)試劑盒(上海易色醫(yī)療科技有限公司生產，貨號：BC201)，放射免疫沉淀(RIPA)裂解緩沖液(南京?？藸柹锟萍加邢薰旧a，貨號：SBJ-0999)，辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔單克隆二抗、核因子E2相關因子2(Nrf2)、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸醌氧化還原酶-1(NQO-1)、血紅素氧合酶-1(HO-1)、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(GAPDH)兔來源的單克隆一抗(英國Abcam公司，貨號ab6721、ab92946、ab28947、ab13243、ab9485)。

1.1.2 實驗動物 選取48只雄性Wistar大鼠，體重160～180 g，年齡8～9周，購自四川夏派森醫(yī)藥科技有限公司，許可證號：SYXK(川)2017-203。將大鼠隨機分為對照組和糖尿病組，各24只。所有大鼠在濕度為(50±10)%、溫度為(22±3)℃、14 h/10 h明暗的環(huán)境中飼養(yǎng)，自由獲取食物和飲水至少1周，再用于實驗。本研究中實驗動物已得到批準，所有程序均符合該機構的道德標準，并按照醫(yī)院動物護理和使用委員會的指導進行。

1.1.3 實驗儀器 microopticon 熒光定量聚合酶鏈式反應(qPCR)檢測系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司；FDP-1 HRV & BRS分析系統(tǒng)購自中國上海嘉龍教儀廠；美國碧迪流式細胞儀FACS Calibur(美國碧迪醫(yī)療器械有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 通過高脂飲食和鏈脲佐菌素(strepozotocin，STZ)方法誘導大鼠2型糖尿病 適應飼養(yǎng)1周后，給予觀察組24只雄性Wistar大鼠高脂飲食(標準普通食物67.5%，蔗糖20%，豬油10%和蛋黃粉2.5%)和10%糖水喂養(yǎng)5周。通過每日2次腹膜內注射30 mg/kg劑量的STZ(溶于0.1 mmol/L檸檬酸鹽緩沖液，pH 4.2)治療大鼠。3 d后，從尾靜脈提取血液樣品測量血糖水平。血糖>16.7 mmol/L證實該鼠患糖尿病。對照組大鼠喂食常規(guī)飲食，并單獨注射檸檬酸鹽緩沖液。

1.2.2 分組及給藥 將24只糖尿病大鼠隨機分為糖尿病假手術組(DS組)、糖尿病心肌缺血再灌注組(DI/R組)、糖尿病心肌缺血再灌注給藥組(DI/RM組)；將對照大鼠，將24只健康Wistar雄性大鼠再隨機分為假手術組(sham組)、心肌缺血再灌注組(I/R組)、心肌缺血再灌注給藥組(I/RM組)。缺血給藥前20 min，I/RM組和DI/RM組大鼠靜脈注射咪達唑侖0.75 mg/kg，并以1 mg/(kg·h)微注射泵維持至再灌注結束[6]。

1.2.3 心肌缺血再灌注大鼠模型 參考文獻[7]，除sham組和DS組外，其余大鼠腹膜內注射戊巴比妥鈉60 mg/kg麻醉，之后將大鼠固定于右側臥位，采用1%聚乙烯碘對胸部和腹部進行消毒，并使用無菌洞巾覆蓋大鼠。通過微注射泵注射咪達唑侖，于左側第4肋間切開后進行心包切開術，將5-0眼科縫合線置于左冠狀動脈的前降支周圍，完全結扎冠狀動脈以獲得局部缺血。若手術成功，則在閉塞遠端的心肌出現(xiàn)淺色。缺血30 min后，通過釋放結扎線恢復血流，通過目測檢查鮮紅色血液返回確認缺血區(qū)域的再灌注。sham組和DS組大鼠進行相同的外科手術，但不結扎左冠狀動脈的前降支。

1.2.4 FDP-1 HRV和BRS分析系統(tǒng)測定心功能 I/R手術后，麻醉大鼠，并通過右頸總動脈向左心室插管。通過MFLab 3.01軟件包在FDP-1 HRV和BRS分析系統(tǒng)測定左室舒張末期壓(left ventricular end diastolic pressure，LVEDP)、左室收縮壓(left ventricular systolic pressure，LVSP)、心率(heart rate，HR)和冠狀動脈流量(coronary flow，CF)，監(jiān)測心臟功能。

1.2.5 ELISA檢測血清CK-MB、LDH、cTnI、TNF-α、IL-6、IL-1β和心肌組織MDA、GSH、SOD的表達水平 收集血樣，6 h后離心；選取心臟同一部位組織，按質量體積比為1∶9加入生理鹽水勻漿，離心后取上清液加入各反應孔，37 ℃反應45 min。使用洗滌液洗滌4次，再加入生物素標記抗體，37 ℃孵育30 min；洗滌后加入HRP標記的鏈霉親和素混合均勻，37 ℃反應30 min，加入顯色劑避光顯色，最后加終止液終止反應，檢測結果。

1.2.6 HE染色觀察心肌損傷 將心臟組織采用冰生理鹽水沖洗，4%多聚甲醛溶液固定48 h，石蠟包埋，切片。按照HE染色試劑盒染色，并在400倍顯微鏡下觀察心肌損傷情況。

1.2.7 流式檢測細胞凋亡 細胞經0.25%胰酶處理后收集于試管中，之后將其離心，采用磷酸鹽緩沖鹽溶液洗滌1次。根據Annexin-V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒的說明書，通過FACS分析對FITC和PI熒光進行定量。細胞凋亡率(%)=早期細胞凋亡率+晚期細胞凋亡率。

1.2.8 蛋白印跡法檢測Nrf2、NQO-1、HO-1蛋白的表達 使用RIPA細胞裂解液從心臟組織中提取蛋白，并采用BCA試劑盒檢測蛋白濃度，12%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉膜后封閉1 h，加入兔來源的單克隆一抗(Nrf2為1∶1 000，NQO-1為1∶500，HO-1為1∶1 000，β-actin為1∶1 000)中，4 ℃ 孵育12 h；轉移至山羊抗兔單克隆二抗液(1∶2 000)中，室溫下孵育1 h，加顯影液，于成像系統(tǒng)中曝光，使用軟件Image Pro Plus 6.0分析蛋白條帶灰度，蛋白表達水平以目標蛋白積分吸光度與內參蛋白β-actin積分吸光度值比值表示。

2 結 果

2.1 咪達唑侖對2型糖尿病心肌缺血再灌注大鼠心臟功能的影響 與sham組比較，I/R組和DS組大鼠心臟LVSP、HR、CF降低(P<0.05或P<0.01)，LVEDP及血清LDH和CK-MB活性、cTnI含量升高(P<0.05或P<0.01)；與DS組和I/R組比較，DI/R組心臟LVSP、HR、CF降低(P<0.01)，LVEDP及血清LDH和CK-MB活性、cTnI含量升高(P<0.01)；與I/R組比較，I/RM組大鼠心臟LVSP、HR、CF升高(P<0.01)，LVEDP及血清LDH和CK-MB活性、cTnI含量降低(P<0.01)；與DI/R組比較，DI/RM組、I/RM組心臟LVSP、HR、CF升高(P<0.01)，LVEDP 及血清LDH和CK-MB活性、cTnI含量降低(P<0.01)。詳見圖1。

與sham組比較，＊P<0.05，＊＊P<0.01；與I/R組比較，#P<0.01；與DS組比較，△P<0.01；與DI/R組比較，&P<0.01。

2.2 咪達唑侖對2型糖尿病心肌缺血再灌注大鼠心肌損傷的影響 sham組心肌細胞排列整齊，細胞輪廓清晰；I/R組和DS組大鼠心肌組織存在心肌纖維斷裂，細胞排列紊亂，細胞變性壞死；DI/R組大鼠心肌組織出現(xiàn)大量心肌纖維斷裂，細胞排列嚴重紊亂，細胞變性壞死嚴重；I/RM組和DI/RM組大鼠心肌細胞逐漸恢復整齊排列，細胞變性壞死減少。與sham組比較，I/R組和DS組大鼠心肌細胞凋亡率增加(P<0.05或P<0.01)；與DS組和I/R組比較，DI/R組大鼠心肌細胞凋亡率增加(P<0.01)；與I/R組比較，I/RM組心肌細胞凋亡率降低(P<0.01)；與DI/R組比較，DI/RM組大鼠心肌細胞凋亡率降低(P<0.01)。詳見圖2。

與sham組比較，＊P<0.05，＊＊P<0.01；與I/R組比較，#P<0.01；與DS組比較，△P<0.01；與DI/R組比較，&P<0.01。

2.3 咪達唑侖對2型糖尿病心肌缺血再灌注大鼠氧化應激反應的影響 與sham組比較，I/R組和DS組大鼠心肌組織GSH含量和SOD活性降低(P<0.05或P<0.01)，MDA含量升高(P<0.05或P<0.01)；與DS組和I/R組比較，DI/R組大鼠心肌組織GSH含量和SOD活性降低(P<0.01)，MDA含量升高(P<0.01)；與I/R組比較，I/RM組心肌組織GSH含量和SOD活性升高(P<0.01)，MDA含量降低(P<0.01)；與DI/R組比較，DI/RM組大鼠心肌組織GSH含量和SOD活性升高(P<0.01)，MDA含量降低(P<0.01)。詳見圖3。

與sham組比較，＊P<0.05，＊＊P<0.01；與I/R組比較，#P<0.01；與DS組比較，△P<0.01；與DI/R組比較，&P<0.01。

2.4 咪達唑侖對2型糖尿病心肌缺血再灌注大鼠炎癥反應的影響 與sham組比較，I/R組和DS組大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β含量增加(P<0.05或P<0.01)；與DS組和I/R組比較，DI/R組大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β含量增加(P<0.01)；與I/R組比較，I/RM組血清TNF-α、IL-6、IL-1β含量減少(P<0.01)；與DI/R組比較，DI/RM組大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β含量減少(P<0.01)。詳見圖4。

與sham組比較，＊P<0.05，＊＊P<0.01；與I/R組比較，#P<0.01；與DS組比較，△P<0.01；與DI/R組比較，&P<0.01。

2.5 咪達唑侖對2型糖尿病心肌缺血再灌注大鼠心肌組織中Nrf2通路相關蛋白表達的影響 與sham組比較，I/R組和DS組大鼠心肌組織Nrf2、NQO-1和HO-1表達下調(P<0.05或P<0.01)；與DS組和I/R組比較，DI/R組大鼠Nrf2、NQO-1和HO-1表達下調(P<0.01)；與I/R組比較，I/RM組Nrf2、NQO-1和HO-1表達上調(P<0.01)；與DI/R組比較，DI/RM組大鼠Nrf2、NQO-1和HO-1表達上調(P<0.01)。詳見圖5。

與sham組比較，＊P<0.05，＊＊P<0.01；與I/R組比較，#P<0.01；與DS組比較，△P<0.01；與DI/R組比較，&P<0.01。

3 討 論

本研究結果顯示，咪達唑侖可改善2型糖尿病心肌缺血再灌注大鼠心臟功能，可能與抑制心肌細胞凋亡，抑制氧化應激反應和炎癥反應，調節(jié)Nrf2通路，并減輕心肌損傷有關。尹寧等[4]研究顯示，咪達唑侖對心肌缺血再灌注損傷具有一定的保護作用。

本研究結果顯示，糖尿病心肌缺血再灌注大鼠心肌細胞凋亡較非糖尿病心肌缺血再灌注大鼠嚴重，氧化應激反應和炎癥反應劇烈，與Xu等[8]研究結果一致。心肌缺血再灌注損傷過程中出現(xiàn)大量氧自由基、細胞內鈣水平升高、大量中性粒細胞浸潤、線粒體受損等病理變化促進心肌細胞凋亡[9]。有效抑制心肌細胞凋亡可顯著改善糖尿病心肌缺血再灌注大鼠心肌損傷。葛根素通過抑制細胞凋亡減少糖尿病大鼠缺血/再灌注引起的心肌損傷[10]。本研究結果顯示，咪達唑侖可抑制2型糖尿病心肌缺血再灌注大鼠心肌細胞凋亡。氧化應激引起細胞生物分子和細胞膜結構和功能改變[11]，缺血再灌注損傷引起氧化應激反應[12-13]，有效抑制氧化應激反應水平可明顯改善糖尿病心肌缺血再灌注大鼠心肌損傷。益氣養(yǎng)陰方可保護糖尿病心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌組織，減輕組織氧化應激水平，可能是通過激活細胞外調節(jié)蛋白激酶(ERK)/Nrf2/HO-1通路實現(xiàn)的[14]。本研究結果顯示，咪達唑侖可抑制2型糖尿病心肌缺血再灌注大鼠心肌細胞氧化應激反應。心肌缺血再灌注損傷引起心肌細胞內源性的炎癥反應，并誘導釋放大量炎性因子，從而進一步引起心肌受損[15]。芒果苷通過抑制心肌的氧化應激、炎癥減輕糖尿病大鼠心肌缺血再灌注損傷[16]。本研究結果表明，咪達唑侖可抑制2型糖尿病心肌缺血再灌注大鼠心肌細胞炎癥反應。冬凌草甲素能改善糖尿病心肌缺血再灌注損傷模型大鼠心臟功能、減少心肌損傷和細胞凋亡、降低氧化應激和炎性因子表達[17]，咪達唑侖可改善2型糖尿病心肌缺血再灌注損傷。

Nrf2可減輕缺血-再灌注損傷，具有心臟保護作用。這種內源性保護作用可能通過促進HO-1等抗氧化因子表達，抑制氧自由基產生，降低氧化應激反應實現(xiàn)的[18]。Nrf2通路可預防糖尿病發(fā)生，并在維持葡萄糖代謝、調節(jié)胰島素分泌和調節(jié)脂質代謝等方面發(fā)揮重要作用。有研究顯示，糖尿病病人和動物模型中Nrf2通路是被抑制的[19]。Peake等[20]認為Nrf2在糖尿病病人心臟中表達增加。造成實驗結果差異的原因可能為不同實驗研究之間的糖尿病持續(xù)時間、動物種類和實驗方案不同。本研究結果顯示，2型糖尿病心肌缺血再灌注大鼠心肌組織Nrf2通路相關蛋白表達降低，咪達唑侖可上調2型糖尿病心肌缺血再灌注大鼠心肌組織Nrf2通路相關蛋白表達。與Xu等[8]研究結果白藜蘆醇增加2型糖尿病大鼠心肌Nrf2表達，減輕心肌缺血再灌注損傷一致。

綜上所述，咪達唑侖可減輕2型糖尿病心肌缺血再灌注大鼠心肌損傷，抑制氧化應激和炎癥反應，可能與調節(jié)Nrf2通路有關。由于本研究是動物實驗，為探討具體的分子調控機制，有必要進行進一步的體外實驗。