沈 葉，黃烽如，房秋晨，孫魯寧**，王永慶**

1 徐州醫(yī)科大學(xué) 江蘇省新藥研究與臨床藥學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，徐州 221004；2 南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 臨床藥理研究室，南京210029

細(xì)胞色素P450（cytochrome P450，CYP450）是人體最重要的藥物代謝酶之一，其主要亞型（CYP3A4/5）參與50%以上臨床用藥的代謝[1，2]。許多外源性物質(zhì)可以作為誘導(dǎo)劑或抑制劑影響CYP3A底物的體內(nèi)暴露。因此，確定CYP3A 及其同工酶的活性對(duì)于評(píng)估藥物相互作用至關(guān)重要[3]。目前，評(píng)價(jià)人體內(nèi)CYP3A 酶活性的方法主要有探針?biāo)幬锓╗4]（如咪達(dá)唑侖、氨苯砜、紅霉素等）和內(nèi)源性生物標(biāo)志物法[5，6]。咪達(dá)唑侖被我國(guó)藥監(jiān)局和美國(guó)藥品監(jiān)督管理局藥品審評(píng)中心推薦為CYP3A 酶活性評(píng)價(jià)的首選探針底物[7]。咪達(dá)唑侖（1-甲基-8-氯-6-（2-氟苯基）-4H-咪唑并[l，5-a][l，4]苯并二氮雜艸卓）作為使用最為廣泛的苯二氮唑類短效中樞神經(jīng)系統(tǒng)抑制劑，具有鎮(zhèn)靜、催眠、抗驚厥、肌肉松弛的作用[8]。咪達(dá)唑侖作為探針?biāo)幬镞M(jìn)入人體后經(jīng)CYP3A 代謝生成主要代謝物1-羥基咪達(dá)唑侖[9]。

目前，文獻(xiàn)報(bào)道測(cè)定人血漿中咪達(dá)唑侖的分析方法主要為高效液相色譜法[10，11]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[8，12～14]。然而，文獻(xiàn)[10，11]中建立的方法靈敏度較低，分析時(shí)間較長(zhǎng)。文獻(xiàn)[13，14]開(kāi)發(fā)的方法前處理復(fù)雜，需要萃取或者旋干的操作，分析時(shí)間較長(zhǎng)。現(xiàn)建立了一種前處理簡(jiǎn)單快捷、線性范圍寬、高效靈敏的同時(shí)測(cè)定人血漿中咪達(dá)唑侖和1-羥基咪達(dá)唑侖的HPLC-MS/MS 法，可應(yīng)用于咪達(dá)唑侖作為CYP3A 探針的臨床藥物相互作用的研究。

1 儀器與藥品、試劑

1.1 儀器

1290 Infinity 高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫科技有限公司），包括G4220A 二元高壓泵；G1316C 柱溫箱和G4226A 多孔板自動(dòng)進(jìn)樣器；API 4000 三重四極桿質(zhì)譜儀，配備電噴霧離子源，Analyst1.6.3 數(shù)據(jù)采集處理系統(tǒng)（美國(guó)應(yīng)用生物公司）；BP211D 電子天平（德國(guó)Sartorius 公司）；Mixmate 渦旋混勻儀（德國(guó)Eppendorf 公司）；Stratos 離心機(jī)（德國(guó)Thermo Fisher 公司）。

1.2 藥品與試劑

馬來(lái)酸咪達(dá)唑侖（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：E1822047，純度：100.0%）；1-羥基咪達(dá)唑侖溶液（美國(guó)Cerilliant 公司，批號(hào)：FN12081503，濃度：100 μg·mL-1，溶劑：甲醇）；d4-咪達(dá)唑侖溶液（美國(guó)Cerilliant 公司，批號(hào)：FE03311701，濃度：100 μg·mL-1，溶劑：甲醇）；乙腈為色譜純（美國(guó)Merck 公司）；超純水（18.2 MΩ）由Millipore 純水儀制得。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Kinetex C18（2.1mm×50mm，2.6μm）；柱溫：38℃；流動(dòng)相由1mmol·L-1甲酸銨溶液（含0.1%甲酸）（A 相）和乙腈（B 相）組成，梯度洗脫程序見(jiàn)表1；流速：0.3mL·min-1；進(jìn)樣量：3.0μL；分析時(shí)間7min。

表1 梯度洗脫程序

2.2 質(zhì)譜條件

采用多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）離子檢測(cè)方式，離子化方式：電噴霧離子化（ESI），在正離子模式下進(jìn)行掃描檢測(cè)，離子化電壓為4500 V，溫度設(shè)為600 ℃，霧化氣壓力為60 psi，渦輪氣壓力為60 psi，氣簾氣壓力為50 psi，碰撞氣壓力為10 psi。咪達(dá)唑侖、1-羥基咪達(dá)唑侖及d4-咪達(dá)唑侖的定量離子對(duì)，去簇電壓（DP），射入電壓（EP），碰撞能量（CE），碰撞室射出電壓（CXP）見(jiàn)表2。

表2 質(zhì)譜條件

2.3 儲(chǔ)備液和工作液的配制

精密稱取馬來(lái)酸咪達(dá)唑侖對(duì)照品13.55 mg（經(jīng)純度換算相當(dāng)于咪達(dá)唑侖10.00 mg），用甲醇溶解定容至10.0 mL 量瓶中，得到1.00 mg·mL-1的咪達(dá)唑侖儲(chǔ)備液。取咪達(dá)唑侖儲(chǔ)備液40 μL 以及100 μg·mL-1的1-羥基咪達(dá)唑侖儲(chǔ)備液200 μL 置于同一2.0 mL 量瓶中，并用甲醇定容，得到咪達(dá)唑侖和1-羥基咪達(dá)唑侖濃度分別為20.0/10.0 μg·mL-1的混合工作液，將此混合工作液用甲醇逐級(jí)稀釋，得到咪達(dá)唑侖和1-羥基咪達(dá)唑侖濃度分別為6.00/3.00、8.00/4.00、80.0/40.0、400/200、1200/600、2000/1000、3200/1600、4000/2000 ng·mL-1的系列濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線用混合工作液，以及濃度分別為16.0/8.00、1000/500、3600/1800 ng·mL-1的質(zhì)控用混合工作液。

以乙腈為溶劑，配制含d4-咪達(dá)唑侖濃度為15.0 ng·mL-1的內(nèi)標(biāo)工作液。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線和質(zhì)控樣本的配制

采用空白血漿配制標(biāo)準(zhǔn)曲線和質(zhì)控樣本。取50 μL 空白血漿，加入2.50 μL 相應(yīng)濃度的混合工作液，配成含咪達(dá)唑侖和1-羥基咪達(dá)唑侖濃度分別為0.300/0.150、0.400/0.200、4.00/2.00、20.0/10.0、60.0/30.0、100/50.0、160/80.0、200/100 ng·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)曲線樣本，以及咪達(dá)唑侖和1-羥基咪達(dá)唑侖濃度分別為0.800/0.400 ng·mL-1、50.0/25.0 ng·mL-1和180/90.0 ng·mL-1的混合質(zhì)控樣本。

2.5 樣本前處理

取50 μL 血漿樣本，加入150 μL 含d4-咪達(dá)唑侖的乙腈工作液，置1.5 mL 離心管中，渦旋10 min，16000 r·min-1離心15 min（4 ℃），取上清液進(jìn)樣作LC-MS/MS 分析。

2.6 專屬性考察

本實(shí)驗(yàn)分別考察了咪達(dá)唑侖和1-羥基咪達(dá)唑侖及d4-咪達(dá)唑侖在人血漿中的專屬性。咪達(dá)唑侖和1-羥基咪達(dá)唑侖及d4-咪達(dá)唑侖的保留時(shí)間分別約為2.3 min、1.9 min 和2.3 min。典型色譜圖見(jiàn)圖1。結(jié)果表明，血漿中咪達(dá)唑侖和1-羥基咪達(dá)唑侖及d4-咪達(dá)唑侖峰位處無(wú)干擾。

圖1 咪達(dá)唑侖和1-羥基咪達(dá)唑侖及d4-咪達(dá)唑侖在血漿中的色譜圖

2.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線

按“2.4”項(xiàng)方法制備混合標(biāo)準(zhǔn)曲線樣本和混合質(zhì)控樣本。按“2.5”項(xiàng)下方法處理樣本。以濃度（C）為橫坐標(biāo)，以待測(cè)化合物/內(nèi)標(biāo)峰面積比值（f）為縱坐標(biāo)，用權(quán)重系數(shù)1/C2進(jìn)行最小二乘法作線性回歸。典型的咪達(dá)唑侖和1-羥基咪達(dá)唑侖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程分別為：

結(jié)果表明，分別在0.300～200 ng·mL-1與0.150～100 ng·mL-1線性關(guān)系良好。

2.8 提取回收率

按“2.4”項(xiàng)下方法，使用6 個(gè)不同來(lái)源的空白血漿制備低濃度（咪達(dá)唑侖/1-羥基咪達(dá)唑侖，0.800/0.400 ng·mL-1）、中濃度（咪達(dá)唑侖/1-羥基咪達(dá)唑侖，50.0/25.0 ng·mL-1）、高濃度（咪達(dá)唑侖/1-羥基咪達(dá)唑侖，180/90.0 ng·mL-1）混合質(zhì)控樣本，按“2.5”項(xiàng)下方法處理。同時(shí)在6 個(gè)不同來(lái)源的空白血漿的乙腈提取液加入相同濃度的咪達(dá)唑侖、1-羥基咪達(dá)唑侖和d4-咪達(dá)唑侖工作液，渦旋混勻。上述每個(gè)濃度樣本各配制3 份，進(jìn)樣分析后，以空白血漿制備的樣本中分析物的峰面積與空白血漿的乙腈提取液制備的樣本中分析物的峰面積的比值，評(píng)價(jià)提取回收率。結(jié)果顯示，3 種濃度血漿樣本中咪達(dá)唑侖的提取回收率分別為（101.6±6.6）%、（102.2±2.9）%、（100.6±6.8）%；1-羥基咪達(dá)唑侖的提取回收率為（101.8±4.6）%、（102.4±3.2）%、（101.1±7.1）%。

2.9 基質(zhì)效應(yīng)

按“2.4”和“2.5”項(xiàng)下方法，使用6 個(gè)不同來(lái)源的空白血漿制備乙腈提取液，加入待測(cè)咪達(dá)唑侖、1-羥基咪達(dá)唑侖和d4-咪達(dá)唑侖工作液，制備低濃度（咪達(dá)唑侖/1-羥基咪達(dá)唑侖，0.800/0.400 ng·mL-1）和高濃度（咪達(dá)唑侖/1-羥基咪達(dá)唑侖，180/90.0 ng·mL-1）質(zhì)控的基質(zhì)效應(yīng)樣本；同時(shí)用水基質(zhì)制備相同的低濃度和高濃度樣本；將上述樣本進(jìn)樣分析，得到各樣本待測(cè)化合物與內(nèi)標(biāo)的峰面積，計(jì)算待測(cè)化合物/內(nèi)標(biāo)峰面積比值（f），用于評(píng)價(jià)血漿基質(zhì)對(duì)分析的影響。

在低濃度和高濃度血漿樣本中，咪達(dá)唑侖的基質(zhì)效應(yīng)分別是（101.4±4.3）%、（98.9±2.7）%，1-羥基咪達(dá)唑侖的基質(zhì)效應(yīng)分別是（99.1±3.0）%、（95.5±2.9）%，結(jié)果顯示，血漿基質(zhì)不影響樣本檢測(cè)。

2.10 準(zhǔn)確度和精密度試驗(yàn)

按“2.4”項(xiàng)下方法，配制定量下限樣本，低、中、高3 種濃度的血漿基質(zhì)混合質(zhì)控樣本，每個(gè)濃度配制5 份（n=5），按“2.5”項(xiàng)下方法處理，考察批內(nèi)和批間準(zhǔn)確度和精密度。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 精密度和準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果（n=5）

2.11 穩(wěn)定性試驗(yàn)

按“2.4”項(xiàng)下方法，配制濃度為低、高兩種濃度的血漿基質(zhì)混合質(zhì)控樣本，分別在室溫（24 ℃）放置12 h、自動(dòng)進(jìn)樣器（10 ℃）中放置24 h、3 次凍融循環(huán)、-40 ℃冰凍10 個(gè)月，按“2.5”項(xiàng)下方法處理，以準(zhǔn)確度評(píng)估穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，待測(cè)化合物在上述各條件下穩(wěn)定性均良好。見(jiàn)表4。

表4 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

3 人血漿中咪達(dá)唑侖和1-羥基咪達(dá)唑侖濃度的測(cè)定

評(píng)價(jià)促變藥物對(duì)馬來(lái)酸咪達(dá)唑侖片在健康受試者中的藥代動(dòng)力學(xué)影響研究（預(yù)試驗(yàn)），在南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院Ⅰ期臨床試驗(yàn)室完成。在第一周期研究中，6 例健康男性受試者于試驗(yàn)第1 天早上空腹口服15 mg 馬來(lái)酸咪達(dá)唑侖片（1 片），分別于給藥前0 h（給藥前1.0 h 內(nèi)）和給藥后10、20、30、45 min，1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0、5.0、8.0、12、14、24 h（共16 個(gè)時(shí)間點(diǎn)），采集上肢靜脈血4 mL，分離血漿后保存于-80°C 冰箱待用。使用建立的LC-MS/MS 法對(duì)上述血樣進(jìn)行濃度測(cè)定。6 例健康男性受試者咪達(dá)唑侖及1-羥基咪達(dá)唑侖血藥濃度均值-時(shí)間曲線見(jiàn)圖2。

圖2 健康男性受試者咪達(dá)唑侖及1-羥基咪達(dá)唑侖血藥濃度均值-時(shí)間曲線（n=6）

4 討論

本研究建立并驗(yàn)證了同時(shí)測(cè)定人血漿中咪達(dá)唑侖和1-羥基咪達(dá)唑侖的HPLC-MS/MS 法。在方法開(kāi)發(fā)過(guò)程中，對(duì)每項(xiàng)質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，使得兩個(gè)待測(cè)化合物均具現(xiàn)有條件下最高的質(zhì)譜響應(yīng)。

在優(yōu)化色譜條件時(shí)，考察了用乙腈和甲醇作為有機(jī)相的方法，發(fā)現(xiàn)兩種有機(jī)試劑對(duì)于峰型和響應(yīng)的影響相差無(wú)幾；但考慮到乙腈沉淀蛋白效果更佳，因此在有機(jī)相的選擇上最終確定為乙腈。除此之外還評(píng)價(jià)了1 mmol·L-1乙酸銨和1 mmol·L-1乙酸銨（含0.1%甲酸）作為水相的方法，研究發(fā)現(xiàn)，甲酸的加入會(huì)大大減輕殘留效應(yīng)，因此最終選擇乙腈-1 mmol·L-1甲酸銨（含0.1%甲酸）作為流動(dòng)相。流速設(shè)置為0.3 mL·min-1可以同時(shí)兼顧分析時(shí)間和色譜柱壓力，并且具有良好的分離效果。同時(shí)建立了梯度洗脫程序，在實(shí)現(xiàn)良好的色譜分離的同時(shí)，在待測(cè)化合物出峰后使用95%有機(jī)相沖洗1.8 min 以保護(hù)色譜柱和減少本次進(jìn)樣對(duì)下一次進(jìn)樣的影響，以提高方法的耐用性。

本方法僅需50 μL 的樣本量，樣品制備程序基于一個(gè)簡(jiǎn)單的蛋白質(zhì)沉淀步驟，避免了復(fù)雜的萃取過(guò)程，靈敏度較高，且分析時(shí)間較短。最終建立了同時(shí)測(cè)定人血漿中咪達(dá)唑侖和1-羥基咪達(dá)唑侖濃度的HPLC-MS/MS 法，可用臨床藥物相互作用研究。