閘雯俊，游艾青

（糧食作物種質(zhì)創(chuàng)新與品種改良湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所，武漢 430064）

MicroRNA（即miRNA）是由18～25個核苷酸組成的一類內(nèi)源性、短序列非編碼單鏈RNA，它由DNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生，不翻譯蛋白質(zhì)，通過和mRNA 3′UTR區(qū)結(jié)合來調(diào)控目標(biāo)基因的表達(dá)。miRNA主要是通過5′端被稱為種子序列的7 nt序列與位于靶mRNA 3′UTR的miRNA調(diào)控元件相互作用以識別靶mRNA。miRNA作為轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控的一種方式，在生物體內(nèi)形成一個調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，由于miRNA調(diào)控作用明顯，本身序列短，便于操作和研究，在生物學(xué)功能研究方面越來越受到人們的重視。

miRNAs研究已經(jīng)成為昆蟲生命科學(xué)領(lǐng)域中一個新的熱點(diǎn)。國內(nèi)已有研究者利用高通量測序獲得雌 雄 成 蟲 時 期 的 褐 飛 虱（Nilaparvata lugensSt?l）miRNAs，為研究miRNAs對褐飛虱生長發(fā)育提供了試驗(yàn)依據(jù)［1］。同時Zhou等［2］已經(jīng)測得灰飛虱的miRNAs，為研究灰飛虱的代謝及發(fā)育奠定了基礎(chǔ)。在雌性褐飛虱中，注射miR-4868b模擬物后谷氨酰胺合成酶蛋白表達(dá)下調(diào)，注射miR-4868b抑制劑后谷氨酰胺合成酶蛋白表達(dá)上調(diào)［3］。Nlu-miRNA-173及其靶標(biāo)基因Ftz-F1的正常表達(dá)能夠確保褐飛虱正常發(fā)育；而當(dāng)Nlu-miRNA-173過表達(dá)時，會導(dǎo)致褐飛虱發(fā)生嚴(yán)重的蛻皮缺陷［4］。

褐飛虱屬同翅目飛虱科昆蟲，又稱褐稻虱。褐飛虱是水稻主要害蟲之一，在中國長江流域和華南及西南廣大稻區(qū)發(fā)生頻繁、危害嚴(yán)重［5］。為分析可能調(diào)控Ccdc124基因表達(dá)的miRNA，本研究構(gòu)建了Ccdc124基因3′-UTR雙熒光素酶基因報告載體psi-CHECK2并鑒定其與Nlu-miRNA-8靶向調(diào)控關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料 褐飛虱品種（生物型Ⅱ）為武漢大學(xué)收藏，飼養(yǎng)在感蟲水稻品種臺中1號（TN1）植株上，環(huán)境條件為（25±2）℃，80%的相對濕度，光照培養(yǎng)16h/d，黑暗培養(yǎng)8 h/d。

1.1.2 試劑 人工合成的Ccdc124目標(biāo)序列（生工生物工程股份有限公司合成），Nlu-miRNA-8 mimics及陰性對照（GenePharma合成）；DMEM培養(yǎng)基+10%FBS（Gbico）；XhoI和NotI（購自NEB公司）；DNA Ligation Kit（TOYOBO，貨號：LGK-100）；轉(zhuǎn)染試劑（lipofectamine 2000（Invitrogen，貨號：11668-019）；QIAquick Gel Extraction Kit（QIA-GEN，貨號：28704）；psi-CHECK2 Vector及雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒（Promega，貨號：E1910）。

1.2 方法

1.2.1 褐飛虱組織總RNA提取與檢測 使用Trizol試劑（購自Invitrogen公司）提取褐飛虱全蟲的總RNA，具體提取步驟參照Trizol試劑自帶說明書。溶解后的RNA在含有溴化乙錠（EB）的1.5%瓊脂糖膠上電泳檢測，同時在RNA濃度測定儀上測定濃度，存放于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 褐飛虱Ccdc124基因3′UTR區(qū)片段的擴(kuò)增根據(jù)GenBank中的褐飛虱Ccdc124基因序列（ID：XM_022350855.1）中 的3′UTR區(qū) 采 用Primer Premier5.0軟件設(shè)計PCR引物，設(shè)計合 成 特 異 引 物（F：5′-CCGGCTCGAGCAAATCACCCGAGAACCCTA-3′；R：5′-TAAGCGGCCGCGCTATTGACAATGCTG ACCAA-3′），上述引物由廣州市銳博生物科技有限公司合成。目標(biāo)片段DNA大小為214 bp。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系（50μL）為5×Phusion Green HF Buffer 10μL，10 mmol/L dNTPs 1μL，上游引物2.5μL，下游引物2.5μL，cDNA模板1μL，Phusion DNA Polymerase 1μL，ddH2O 32μL。反應(yīng)程序?yàn)?8℃預(yù)熱30 s；98℃變性10 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35個循環(huán)；72℃延伸10 min；4℃保存。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖電泳檢測確定特異性產(chǎn)物。

1.2.3 PCR產(chǎn)物酶切和純化 用兩種內(nèi)切酶XhoI和NotI對上述PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切，酶切反應(yīng)體系如下，體系總體積為40μL。PCR產(chǎn)物酶切體系：PCR產(chǎn)物20μL，10×H緩沖液4μL，BSA 4μL，XhoI限制性內(nèi)切酶2μL，NotI限制性內(nèi)切酶2μL，ddH2O 8μL，共40μL。反應(yīng)程序?yàn)樵?7℃酶切4 h，隨后進(jìn)行回收純化。

1.2.4 psi-CHECK2雙酶切處理 psi-CHECK2載體含有限制性內(nèi)切酶XhoI和NotI酶切位點(diǎn)。用兩種內(nèi)切酶XhoI和NotI對上述PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切，酶切反應(yīng)體系總體積為40μL：載體psi-CHECK210μL，10×H緩沖液4μL，BSA 4μL，XhoI限制性內(nèi)切酶2μL，NotI限制性內(nèi)切酶2μL，ddH2O 18μL，共40μL。反應(yīng)程序?yàn)樵?7℃酶切4 h，隨后進(jìn)行回收純化。

1.2.5 雙熒光素酶報告載體構(gòu)建 T4 DNA Ligase連接目的片段與psi-CHECK2載體。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5感受態(tài)細(xì)胞，接種于含氨芐青霉素的LB平板，37℃生化培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。篩選陽性克隆并經(jīng)XhoI+NotI雙酶切電泳鑒定?？寺〗?jīng)雙酶切電泳鑒定后送測序（載體送至上海生工測序），與預(yù)期序列一致的克隆保留，接種LBAmp液體培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h后提取質(zhì)粒DNA。

1.2.6 雙熒光素酶基因報告分析 果蠅S2細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于37℃5%CO2飽和濕度的條件下。轉(zhuǎn)染前1 d，細(xì)胞按2×104個/孔接種于24孔板上，培養(yǎng)基為含10%FBS的DMEM-高糖培養(yǎng)基；轉(zhuǎn)染當(dāng)天，細(xì)胞匯合度為50%～60%，吸去舊的培養(yǎng)基，用PBS洗滌2次，然后每孔加入300μL OPTI-MEM培養(yǎng)基，置于5%CO237℃培養(yǎng)箱中；每個孔OPTI-MEM培養(yǎng)基稀釋Lipofectamine 2 000 1μL，終體積為50μL，室溫下靜置5 min；每個孔加入20μmol/L濃度的miRNA mimics 1μL和0.5μg質(zhì)粒，再加入OPTI-MEM至總體積50μL，室溫下靜置5 min（最終孵育液中為50 nmol/L miRNA mimics）。復(fù)合50μL Lipofectamine 2 000倍稀釋液和孵育液，室溫下靜置20 min；每孔加入100μL轉(zhuǎn)染復(fù)合液，晃動24孔板稍加混勻；在5%CO237℃培養(yǎng)箱中孵育5 h，用新鮮的完全培養(yǎng)基（含血清）替換含有轉(zhuǎn)染復(fù)合物的培養(yǎng)基；轉(zhuǎn)染48 h后，吸去舊的培養(yǎng)基，用PBS清洗2次，每孔細(xì)胞加入100μL的PLB（Passive lysis Buffer），室溫輕微振搖15 min，收集細(xì)胞裂解液。用Promega公司的Dual-Luciferase Reporter Assay System（E1910）進(jìn)行樣品Luciferase活性檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 褐飛虱Ccdc124基因3′UTR區(qū)片段的擴(kuò)增

以基因組DNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)擴(kuò)增Ccdc1243′UTR，約為214 bp，1.5%瓊脂糖 凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物大小，與預(yù)計產(chǎn)物大小一致（圖1）。

圖1 PCR擴(kuò)增Ccdc124 3’UTR

2.2 Ccdc124 3′UTR載體構(gòu)建

PCR產(chǎn)物和psiCHECKTM-2載體經(jīng)雙酶切、純化、連接轉(zhuǎn)化后挑取5個單克隆菌落培養(yǎng)過夜，菌液PCR鑒定（圖2）。菌液PCR陽性單克隆，少量提取質(zhì)粒后經(jīng)雙酶切鑒定，可見2條帶（圖3），結(jié)果顯示分別對應(yīng)Ccdc1243′UTR片段（214 bp）及載體片段（6 273 bp）。陽性克隆送測序鑒定，blast比對后與GeneBank公布序列一致，說明成功構(gòu)建了psi-CHECK2/Ccdc1243′UTR載體。

圖2 菌液PCR鑒定電泳

圖3 重組質(zhì)粒psi-CHECK 2/Ccdc124 3′UTR雙酶切鑒定電泳

2.3 miRNA-8與Ccdc124的靶點(diǎn)驗(yàn)證

將miRNA-8 minic（Minic-8）、空白對照（No-Minic）或陰性對照（Minic-Ct）與psi-CHECK2/Ccdc1243′UTR重組質(zhì)粒分別共轉(zhuǎn)染果蠅S2細(xì)胞，以共轉(zhuǎn)染空白對照（No-Minic）或陰性對照（Minic-Ct）作為對照組，測得共轉(zhuǎn)染miRNA-8 minic（Minic-8）與psi-CHECK2/Ccdc1243′UTR重組質(zhì)粒組雙熒光素酶相對值為0.625，與對照組相比，熒光素酶活性極顯著下調(diào)37.5%。因此，根據(jù)雙熒光素酶報告基因表達(dá)結(jié)果分析，miRNA-8 minic對psi-CHECK2/Ccdc1243′UTR載體的報告熒光有明顯的下調(diào)作用（圖4）。

圖4 雙熒光素酶檢測

3 小結(jié)與討論

microRNA主要是通過與相應(yīng)靶基因的3′UTR序列中microRNA作用元件相互作用，抑制靶基因mRNA的轉(zhuǎn)錄及蛋白的翻譯。

本研究利用TargetScan、miRanda和Pictar 3種軟件預(yù)測靶向調(diào)控Ccdc124的miRNA，并聯(lián)合Pubmed文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫，最終認(rèn)定Nlu-miRNA-8靶向調(diào)控Ccdc124基因的可能性較大。本課題通過生物學(xué)試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了二者的調(diào)控關(guān)系。本研究以褐飛虱基因組DNA為模板PCR擴(kuò)增Ccdc124基因的3′-UTR序列，構(gòu)建psi-CHECK2/Ccdc1243′UTR載體。試驗(yàn)設(shè)置空白對照、miRNA-8 minic陰性對照，設(shè)計嚴(yán)謹(jǐn)，聯(lián)合構(gòu)建的載體共轉(zhuǎn)染于果蠅S2細(xì)胞，采用雙熒光素酶基因報告法檢測轉(zhuǎn)染后各組活性。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miRNA-8 minic可明顯下調(diào)psi-CHECK2/Ccdc1243′UTR載體熒光酶素活性。綜上所述，本研究成功構(gòu)建含有Ccdc124基因3′-UTR段雙熒光素酶基因報告載體，同時通過雙熒光素酶基因報告分析法初步證明Nlu-miRNA-8對Ccdc124基因在生物信息學(xué)水平存在調(diào)控的可能性，為下一步研究Nlu-miRNA-8的生物學(xué)功能提供可試驗(yàn)依據(jù)。