李金業(yè),陳慶鋒,2,*,李 青,趙長盛,馮 優(yōu),李 磊

1 齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院)山東省分析測(cè)試中心, 濟(jì)南 250014 2 山東師范大學(xué)地理與環(huán)境學(xué)院, 濟(jì)南 250014

濱海濕地是陸地和海洋生態(tài)系統(tǒng)之間的過渡帶,具有生物多樣性高、生態(tài)敏感性強(qiáng)等特點(diǎn)[1]。微生物是濕地環(huán)境和有機(jī)物分解的重要組成部分,它可以改變濕地土壤的理化特性,在土壤有機(jī)質(zhì)動(dòng)態(tài)、能量傳遞和元素生化循環(huán)等方面起著重要作用[2]。同時(shí),濕地微生物多樣性高對(duì)于土壤生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定和服務(wù)功能的提高具有不容忽視的作用,將有助于提高微生物種群的遺傳多樣性[3],并對(duì)提高物質(zhì)的營養(yǎng)循環(huán)和重要生態(tài)系統(tǒng)過程的效率有積極的影響[4]。近年來,濕地土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和功能的重要性越來越受到關(guān)注[5]。

黃河三角洲濱海濕地不僅是我國暖溫帶地區(qū)最年輕、最完整、面積最大的濕地之一[6],也是世界上陸地-海洋相互作用最活躍的區(qū)域之一,在濕地生物多樣性保護(hù)和水質(zhì)凈化中發(fā)揮著重要作用[7]。由于圍墾、海岸侵蝕和石油污染等人為干擾,濱海濕地正經(jīng)歷著持續(xù)而嚴(yán)重的退化,面積不斷減小[8]。微生物對(duì)環(huán)境變化非常敏感,這些破壞效應(yīng)會(huì)影響濕地土壤微生物的群落組成。反過來,濕地土壤微生物的變化又會(huì)導(dǎo)致濕地生態(tài)系統(tǒng)的整體結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生變化[9]。濕地植物與土壤環(huán)境因子相互作用,對(duì)土壤微生物群落及功能多樣性產(chǎn)生影響[10]。濱海濕地土壤養(yǎng)分含量低、透氣性差,植物、土壤微生物多樣性均不高,尤其是原生鹽堿土壤中的微生物群落多樣性更低[11]。目前已有研究揭示了黃河三角洲濕地的植被格局分布,以及不同類型植被恢復(fù)對(duì)土壤性質(zhì)和植被多樣性的影響[12-13]。濕地植物可以通過提供凋落物中的營養(yǎng)物質(zhì)直接影響土壤微生物的功能[14],根際分泌物會(huì)改變氧化還原電位、pH值等根際環(huán)境,間接決定根際微生物種類和數(shù)量[15],植物根際鐵錳氧化膜與細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)也存在某種關(guān)聯(lián)。有關(guān)黃河三角洲濱海濕地微生物群落多樣性與植被關(guān)系的研究直到20世紀(jì)90年代才逐步開展[16-17],植物群落和環(huán)境因子對(duì)濕地土壤微生物影響的研究越來越得到關(guān)注。

本研究以黃河三角洲濱海濕地表層土壤和植物根際為研究對(duì)象,通過高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)土壤和植物根際中的微生物進(jìn)行了初步研究,旨在揭示植被根際微生物與土壤微生物的結(jié)構(gòu)和豐度特征,分析微生物群落與土壤環(huán)境因子之間的內(nèi)在關(guān)系,將為認(rèn)識(shí)黃河三角洲濱海濕地的生物地球化學(xué)循環(huán)提供微生物生態(tài)學(xué)視角。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

本研究以黃河三角洲濱海濕地為研究對(duì)象,研究地點(diǎn)位于黃河三角洲的中心區(qū)域(117°31′—119°18′E,36°55′—38°16′N)。該地區(qū)位于渤海灣南岸和萊州灣西岸,屬于溫帶半濕潤大陸性季風(fēng)氣候。研究區(qū)內(nèi)主要為鹽漬型土壤,受潮汐海水入侵影響,土壤鹽漬化嚴(yán)重(高達(dá)70%),主要濕地植物為蘆葦、堿蓬和檉柳。

1.2 樣品采集

通過野外實(shí)地調(diào)研,2018年5月選取區(qū)域內(nèi)代表性的翅堿蓬群落、蘆葦與檉柳灌木混合植被群落、灘涂裸地、油田等13個(gè)采樣點(diǎn)為調(diào)查對(duì)象進(jìn)行采樣(圖1)。土壤樣品采樣時(shí),首先去除土壤表層有機(jī)物和細(xì)根等雜質(zhì),然后按照5點(diǎn)取樣法用鐵鍬采集20 cm × 20 cm 樣方中表層(約0—25 cm)土樣,每個(gè)采樣點(diǎn)重復(fù)3次,共39個(gè)樣品。為了研究植物對(duì)土壤微生物種群的影響,選擇了4個(gè)優(yōu)勢(shì)種,即蘆葦、檉柳、堿蓬和蒿,用鐵锨挖出植物,收集根際土壤,共采集9個(gè)根際土壤樣品(表1)。所有樣品儲(chǔ)存在采樣袋后,放在液氮中冷卻,然后送到實(shí)驗(yàn)室。每個(gè)樣品分成兩部分：一部分樣品風(fēng)干研磨后,分別過不同孔徑的篩子用于土壤理化性質(zhì)測(cè)定；另一部分在-80℃的環(huán)境中冷凍保存,送到北京博奧晶典生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

表1 土壤采樣點(diǎn)及生態(tài)系統(tǒng)狀況

圖1 黃河三角洲濕地監(jiān)測(cè)點(diǎn)

1.3 土壤理化性質(zhì)測(cè)定

1.4 土壤總DNA提取、PCR擴(kuò)增及測(cè)序

選用 Fast DNA SPIN Kit for Soil 試劑盒提取土壤微生物基因總DNA,將提取得到的土壤DNA溶解于70 μL無菌TE緩沖液中,具體提取過程按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。電泳檢測(cè)后,對(duì)16S rRNA V3+V4(細(xì)菌)區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增,細(xì)菌引物[18]序列為：338F 5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′及806R 5′-GGACTACHVGGG TWTCTAAT-3′,使用Illumina Hiseq測(cè)序平臺(tái),利用雙末端測(cè)序(Paired-End)的方法,構(gòu)建小片段文庫進(jìn)行16S rRNA測(cè)序。

1.5 數(shù)據(jù)分析

通過對(duì)Reads拼接過濾,OTUs(Operational Taxonomic Units)聚類(97%),并進(jìn)行物種注釋及豐度分析,揭示樣品的物種組成。通過α多樣性的五個(gè)指數(shù),包括Coverage,Simpson,Chao1,ACE和Shannon指數(shù)分析樣本內(nèi)的物種多樣性,進(jìn)一步對(duì)β多樣性分析(Beta Diversity)和顯著物種差異進(jìn)行分析,挖掘樣品之間的差異。本研究選擇UPGMA(Unweighted Pair-group Method with Arithmetic Mean)分析物種組成相似度。

使用Microsoft Excel和Adobe Illustrator 16.0(Adobe Systems Inc., San Jose, USA)進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和繪制圖形。通過Alpha多樣性分析,統(tǒng)計(jì)了各樣品的覆蓋度、Ace指數(shù)、Chao1指數(shù)和shannon指數(shù)。使用QIIME軟件進(jìn)行β多樣性分析來評(píng)估樣品在物種復(fù)雜性方面的差異。利用SPSS19.0(International Business Machines Corporation, Armonk, USA)軟件,采用主成分分析(PCA)和相關(guān)分析(CA)分析土壤理化性質(zhì)間的關(guān)系,顯著性差異定義為P<0.05。采用Canoco 5.0(Microcomputer Power, New York, USA)軟件分析土壤理化性質(zhì)與土壤細(xì)菌群落多樣性之間的關(guān)系,識(shí)別影響濕地群落結(jié)構(gòu)的主導(dǎo)因子。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤和根際微生物樣品測(cè)序結(jié)果

通過雙末端測(cè)序(Paired-End)并優(yōu)化后,13個(gè)土樣共獲得853672條有效序列(Effective Tags),Effective Tags平均長度集中在411—421 bp之間,占PE Reads序列的86.28%,質(zhì)量值≥30的堿基約占總堿基數(shù)的95.5%—96.08%。序列的長度和數(shù)量是將序列匹配到數(shù)據(jù)庫從而產(chǎn)生基因注釋的關(guān)鍵,保證了微生物物種多樣性分析的科學(xué)性、真實(shí)性。13個(gè)土樣中的微生物歸屬于27門、54綱、143目、282科、627屬和705種,微生物多樣性指數(shù)和覆蓋率見表2。從表2可以看出,蘆葦檉柳區(qū)(HW4-2)的OTU數(shù)最多,高于其他地區(qū)。微生物豐富度指數(shù)(Chao 1指數(shù)和ACE指數(shù))表明蘆葦檉柳生長區(qū)的微生物豐度高于灘涂裸地(HW1-1、YWS2和YWS6)、堿蓬區(qū)(HW6-1、YWS3)和棉田區(qū)(HW5-1),海漫灘(YWS2)中微生物豐度明顯高于河漫灘(YWS6)和泥灘(HW1-1)。

香農(nóng)指數(shù)(Shannon index)是反映樣本微生物多樣性的另一種表現(xiàn)形式,從圖2和表2可以看出土壤樣品中細(xì)菌的香農(nóng)指數(shù)大約在4—5.5之間,而根際細(xì)菌香農(nóng)指數(shù)范圍約為0—4,說明土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性均明顯大于植物根際細(xì)菌。根際中OTU豐富度的下降歸因于根際過程的均質(zhì)化作用,從而減少了生態(tài)位。

圖2 樣品香農(nóng)指數(shù)曲線

表2 微生物的多樣性指數(shù)及覆蓋率

2.2 微生物群落結(jié)構(gòu)組成分析

在所有濕地土壤樣本中,土壤微生物表現(xiàn)出較高的多樣性(圖3)。樣本的門水平分類中豐度前十的物種組成基本一致,主要包括變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、放線菌門(Actinobacteria)、藍(lán)藻菌門(Cyanobacteri)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、綠彎菌門(Chloroflexi)、浮霉菌門(Planctomycetes)、酸桿菌門(Acidobacteria)、軟壁菌門(Tenericutes),其中,細(xì)菌分布以厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門和放線菌門為主,這四種細(xì)菌門在各樣本中合計(jì)占比高于90%,這可能表明了它們?cè)跐竦刂械姆€(wěn)定性,這與之前變形桿菌門在黃河口數(shù)量最多的研究結(jié)果[19-20]不同。與土壤微生物相比,根際微生物的優(yōu)勢(shì)菌群發(fā)生了變化(圖3),以藍(lán)藻門細(xì)菌為主,豐度較高的菌群還有變形菌門、放線菌門和厚壁菌門,和占比約為總菌群的90%,特有的細(xì)菌為Patescibacteria。

圖3 樣品中細(xì)菌群落門水平上的相對(duì)豐度

圖4為基于Beta多樣性分析得到的UPGMA聚類樹與屬水平上細(xì)菌豐度的結(jié)合圖。在聚類樹中,樣品越靠近,枝長越短,表示兩個(gè)樣品的物種組成越相似。在土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)中,YWS3和HW5-1與其他采樣點(diǎn)細(xì)菌結(jié)構(gòu)差異性最大,YWS3中的細(xì)菌豐度排名前10的物種較少,HW5-1以Coffea_arabica_coffee為主。HW1-1與YWS2物種組成相似,但與YWS6物種組成相似性較遠(yuǎn)。油井附近采樣點(diǎn)微生物結(jié)構(gòu)也不同,YWS1細(xì)菌分布均勻,而Uncultured_bacterium_f_muribaculaceae在YWS5中豐度較高。豐度檢測(cè)前10的屬包括Lactobacillus(乳酸菌屬)、Uncultured_bacterium_f_muribaculaceae、Rhodococcus(紅球菌屬)、Bifidobacterium(雙歧桿菌屬)、Coffea_arabica(咖啡屬)、Thauera(索氏菌屬)、Ruminococcus(瘤胃球菌屬)、Ochrobactrum(蒼白桿菌屬)、Flavobacterium(黃桿菌屬)、Escherichia_Shigella(埃希氏桿菌屬),主要是屬于厚壁菌門和酸桿菌門。植物根際細(xì)菌中,HW3-15P1與HW2-15P1的種群結(jié)構(gòu)相似,以Lolium_perenne為主,而其他根際細(xì)菌結(jié)構(gòu)以Coffea_arabica_coffee為主。豐度檢測(cè)前10的屬主要包括Coffea_arabica_coffee、Lolium_perenne、Pseudoalteromonas(假交替單胞菌屬)、Oryza_meyeriana、Vibrio(弧菌屬)、Streptomyces(鏈霉菌屬)、Photobacterium(發(fā)光桿菌屬)、Pseudomonas(假單胞菌屬)、Marinomonas(海單胞菌屬),主要是屬于藍(lán)藻門、變形菌門和放線菌門。

圖4 屬水平上UPGMA聚類樹與柱狀圖組合圖

黃河三角洲濕地微生物豐度和結(jié)構(gòu)的差異性主要表現(xiàn)在同一生境類型不同采樣點(diǎn)間微生物物種差異、不同生境類型下微生物物種差異及同一采樣點(diǎn)植物根系與土壤中微生物的差異。HW1-1、YWS2、YWS6為漫灘地,有少數(shù)植被覆蓋,細(xì)菌門水平上的豐度大小順序依次為厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門、放線菌門、藍(lán)藻門,YWS5為油田附近灘涂,其細(xì)菌豐度依次為擬桿菌門、變形菌門、放線菌門、厚壁菌門和藍(lán)藻門。檉柳區(qū)(HW4-1、YWS4)與植被混合區(qū)(HW2-1、HW3-1、HW4-2)菌門豐度相近,依次為厚壁菌門、變形菌門、放線菌門、擬桿菌門和藍(lán)藻門；翅堿蓬覆蓋區(qū)的優(yōu)勢(shì)菌群豐度差異較大,翅堿蓬(YWS3)中變形菌門和擬桿菌門的豐度高于HW6-1,厚壁菌門、放線菌門和藍(lán)藻門的豐度則低于HW6-1；棉田(HW5-1)以藍(lán)藻菌門的產(chǎn)氧光細(xì)菌綱為主,次優(yōu)勢(shì)類群為厚壁菌門、變形菌門和放線菌門,這一現(xiàn)象與植物根系的菌群結(jié)構(gòu)極其相似。

2.3 土壤環(huán)境因子與土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的相關(guān)性分析

2.3.1土壤環(huán)境影響因子及其相關(guān)性分析

表3 不同土壤的主要環(huán)境參數(shù)

2.3.2土壤環(huán)境因子與微生物群落多樣性的相關(guān)性分析

表4 土壤環(huán)境因素的相關(guān)系數(shù)矩陣

表5 土樣的主成分分析和因子載荷

圖5 門和屬水平細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境變量的RDA排序圖

3 討論

3.1 土壤和根際微生物群落結(jié)構(gòu)特征

濕地土壤具有較厚的有機(jī)質(zhì)層,其溫度和氧含量比其他類型的土壤更穩(wěn)定,使得濕地細(xì)菌群落具有相對(duì)穩(wěn)定的組成以保證其生態(tài)功能,這就解釋了不同類型的濕地土壤中菌群結(jié)構(gòu)的相似性[23]。在門和屬水平上,微生物群落存在差異,土壤中細(xì)菌以變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門為主,但在不同類群中仍存在明顯的類群豐度差異,如HW5-1中藍(lán)藻菌門的豐度較高,YWS3中變形菌門的豐度較高,YWS5中擬桿菌門的豐度較高。同時(shí),細(xì)菌的豐度和結(jié)構(gòu)還受到植被的影響,植物多樣性可以用來預(yù)測(cè)土壤微生物群落的多樣性。黃河三角洲典型的蘆葦區(qū)、檉柳區(qū)、堿蓬區(qū)及漫灘裸地中菌群豐度表現(xiàn)出明顯的差異。根際中豐度較高的細(xì)菌包括藍(lán)藻門、變形菌門和放線菌門,其中藍(lán)藻門的平均豐度達(dá)到50%以上。

3.2 微生物群落與環(huán)境因子的相關(guān)性

4 結(jié)論

本研究利用高通量測(cè)序技術(shù)研究了我國黃河三角洲濱海濕地土壤和植物根際細(xì)菌群落的豐度和結(jié)構(gòu),揭示了環(huán)境因子與濕地土壤中微生物群落結(jié)構(gòu)組成的內(nèi)在聯(lián)系,主要結(jié)論如下：

(1)濕地土壤和植物根際中優(yōu)勢(shì)菌群結(jié)構(gòu)存在差異。土壤細(xì)菌分布以厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門和放線菌門為主,在各樣本中合計(jì)占比高于90%；根際細(xì)菌豐度較高的為藍(lán)藻門、變形菌門、放線菌門和厚壁菌門,土壤微生物的豐度和多樣性顯著大于根際細(xì)菌,在屬水平上土壤和植物菌群結(jié)構(gòu)的差異更明顯。

(2)裸地、蘆葦、檉柳和堿蓬等不同生境類型條件下細(xì)菌的物種組成存在差異。微生物豐富度指數(shù)表明蘆葦檉柳生長區(qū)的微生物豐度高于灘涂裸地、堿蓬區(qū)和棉田區(qū),海漫灘中微生物豐度明顯高于河漫灘和泥灘。

本研究有助于了解黃河三角洲濱海濕地土壤和植物根際的細(xì)菌分布特征,研究微生物不同功能之間存在的內(nèi)在聯(lián)系,維護(hù)三角洲濕地生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性、生物多樣性和遺傳多樣性。