陳汝琬

福州市規(guī)劃設計研究院集團有限公司

1 引言

自1929年A.Fleming發(fā)現(xiàn)青霉素以來，全世界已經(jīng)生產(chǎn)并使用了多種抗生素來治療由病原菌引起的人類、動物和植物的疾病。因此，大量抗生素通過家庭、醫(yī)院、制藥公司、污水處理廠以及水產(chǎn)養(yǎng)殖和牲畜養(yǎng)殖場的排放物釋放到環(huán)境中。當前，抗生素幾乎在世界所有地方的地表水、地下水、土壤、沉積物和生物群中以較高濃度存在，所以抗生素已經(jīng)被列為一種新興的污染物類別[1]。水環(huán)境中存在多種抗生素會對水生生物造成生態(tài)風險，并導致水生生態(tài)系統(tǒng)中抗生素抗性基因（ARGs）和抗生素抗性細菌（ARB）的生成[2]。這種情況引起了人們對水生環(huán)境中抗生素殘留的嚴重關注，盡管我國對抗生素藥物的使用進行了嚴格的規(guī)定，但是抗生素的使用量和應用率依舊居高不下，造成了抗生素超量使用，甚至濫用，由此帶來了嚴重的環(huán)境污染問題，細菌耐藥性問題也日益突出[3]。抗生素由于分子量較大、種類繁多且普遍具有生物毒性，在污水處理過程中無法被完全去除，導致經(jīng)常規(guī)污水處理技術處理后的出水可能具有抑菌性。所以，在抗生素流入濃度較高的污水廠進行出水的抑菌測試很有必要。本文綜述了水環(huán)境中抗生素污染現(xiàn)狀以及實驗室常用的幾種抑菌試驗方法。

2 抗生素污染現(xiàn)狀

抗生素是由微生物（包括細菌，真菌，放線菌）或更高等的動植物在其整個生命中產(chǎn)生的次要物質，具有抗病原體或其他活性，并且可能會干擾其他活細胞的發(fā)育的化學物質。根據(jù)藥理特性，抗生素可以分為氨基糖苷類，β-內(nèi)酰胺類，糖肽類，大環(huán)內(nèi)酯類，喹諾酮類，磺酰胺類和四環(huán)素類[4]。近年來，抗生素廣泛用于預防和治療人類和動物的細菌感染，全球范圍內(nèi)的抗生素使用提高了傳染病的治療率和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)率。但是，抗生素的使用規(guī)模和范圍越來越廣泛，其造成的污染對水生環(huán)境和陸地生態(tài)系統(tǒng)的威脅也越來越嚴重。人類和動物消耗和排泄后，各種形式的抗生素將釋放到環(huán)境中，如圖1所示。據(jù)估計，2013年我國向環(huán)境中排放了約53800噸抗生素，這主要來自水產(chǎn)養(yǎng)殖和畜牧農(nóng)場的廢水以及未經(jīng)充分處理的污水。近年來，在污水處理廠、河流、湖泊、海洋、地下水、沉積物甚至飲用水中均會檢測到各種抗生素[5]。2005年至2016年期間，在我國的水樣中共監(jiān)測到超過90種抗生素，濃度范圍為0.1ng/L~1000ng/L。從地域上來看，在華北和華東地區(qū)的河流和湖泊中抗生素檢測濃度較高，這與華北和華東地區(qū)的人口規(guī)模和抗生素使用量情況相一致[1]。

圖1 抗生素進入水環(huán)境途徑

環(huán)境中抗生素的殘留非常有利于ARB和ARGs的發(fā)展和傳播，從而導致了抗生素抗性病原體的增加，會對生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生嚴重影響。同時，世界衛(wèi)生組織認為能夠引起感染的ARB也對人類健康有著巨大的潛在威脅。隨著抗生素的廣泛應用，含抗生素廢水大量流入污水處理廠。由于細菌密度高、營養(yǎng)豐富、污染物種類多（包括抗生素、殺菌劑、藥物和重金屬等），城市污水為ARB的繁殖提供了適宜的條件。此外，污水處理廠中還存在與人類共生和環(huán)境相關的微生物群，促進了ARGs的共享，甚至引入了對致病微生物的新抗性機制[6]。因此，在污水處理廠出水指標檢測時進行抑菌性試驗，對出水進行抑菌性測試非常有必要。

3 抑菌試驗

抑菌試驗是用于測定抗菌藥物體外抑制細菌生長效力的試驗，各種抑菌試驗廣泛應用于新開發(fā)的防腐劑、抗菌劑、植物精油以及藥物等多個領域。液體培養(yǎng)基法、固體培養(yǎng)基法和高通量篩選法是三種常見的體外抑菌試驗方法[7]。

3.1 液體培養(yǎng)基法

液體培養(yǎng)基法是將液體營養(yǎng)培養(yǎng)基用于細菌培養(yǎng)的一種方法，常用方法包括濁度法、微肉湯稀釋法和營養(yǎng)物消耗法。這種方法相對易于操作，結果直觀易觀察，適用于高溶解度藥物的檢測。在環(huán)境領域中，測試處理后水體的抑菌性會用到比濁法，將抑菌效果轉移至吸光度，可以通過吸光度的改變判斷抑菌性的高低。Snowberger等人利用比濁法進行抑菌實驗，以大腸桿菌為基礎，發(fā)現(xiàn)環(huán)丙沙星、沙拉沙星和諾氟沙星這三種產(chǎn)品抗生素的抑菌效力與母體氟喹諾酮類藥物的抑菌效力相當或更高，這些結果強調了在紫外降解抗生素過程中要考慮抗生素中間轉化的重要性[8]。

3.2 固體培養(yǎng)基法

固體培養(yǎng)基法是將瓊脂培養(yǎng)基用于細菌培養(yǎng)的一種方法，一般的方法包括擴散法、菌落計數(shù)法和藥敏平板法。此類方法具有很高的準確性，可重復性，易于操作且成本較低[9]。在環(huán)境水樣測試中，擴散法最常用于測試抗菌性能。這是因為擴散耗材簡單易用，并且結果明顯可區(qū)分。擴散法主要包括紙擴散法、牛津杯法和打孔法。紙擴散法（也稱為K-B法）通常包括對圓形濾紙進行滅菌和干燥，將滅菌的濾紙浸入待測抗菌溶液中，然后將其置于測試板上進行培養(yǎng)。具體的操作方法如下：將無菌濾紙放在待測溶液的無菌培養(yǎng)皿中，在整個無菌操作過程中取出藥紙，擦去多余的溶液并將其黏在固體表面上。輕輕按壓濾紙，使濾紙與培養(yǎng)基緊密接觸。通過將培養(yǎng)皿在37°C的恒溫培養(yǎng)箱中放置24小時并觀察藥紙周圍的抑菌區(qū)域的大小來確定溶液的抑菌性。

牛津杯法是使用牛津杯進行擴散試驗的方法，將一定量的待測試抗菌溶液注入牛津杯中，進行培養(yǎng)和觀察。具體的操作方法如下：將無菌牛津杯放在酒精燈的火焰上，快速加熱以對其進行消毒，然后將牛津杯垂直于培養(yǎng)基表面放置，然后輕輕按壓以確保杯底與培養(yǎng)基無縫貼合。將相同量的待測溶液注入每個牛津杯中。對于對照試驗，可以添加相同量的鹽水，并在37°C培養(yǎng)24小時，通過觀察牛津杯周圍抑制區(qū)的大小反應溶液的抗菌性。

打孔法是用滅菌后的鋼管在試驗平板上打孔，挑去培養(yǎng)基小塊以做成圓孔，向孔中注入一定量的待測抑菌溶液后進行培養(yǎng)觀察。具體操作方法為：在制備好的固體平板上，利用滅菌后的打孔器垂直打出大小完全相同的幾個小孔，保證孔的分布均勻，與培養(yǎng)皿邊界保持15mm以上距離。用滅菌牙簽將瓊脂塊挑出。在每個孔注入等量待測溶液，37°C培養(yǎng)24小時，通過觀察孔周圍抑菌圈的大小來判斷出水的抑菌性[10]。

K-B和牛津杯方法的誤差相比于打孔法要高很多，這是由于K-B和牛津杯方法從介質表面向外圍呈球形擴散（見圖2），擴散程度與培養(yǎng)基厚度直接相關。介質越厚，表面和底部的擴散率差異越大，表面和底部抑制區(qū)的直徑相差越大。而打孔法中待測溶液在培養(yǎng)基周圍均勻分布（見圖2），從而使培養(yǎng)基表面和底部的抑制區(qū)域大小相等，并避免了測量誤差[11]。Geng等人利用了打孔法檢測了利用真空紫外/紫外降解喹諾酮類抗生素中間產(chǎn)物的抑菌能力，實驗結果表明利用真空紫外/紫外工藝中間產(chǎn)物的抗菌活性會低于紫外工藝的抗菌活性[12]。

圖2 不同擴散方法的滲透方式

3.3 高通量篩選法

高通量篩選是一種快速鑒定細菌和藥物敏感性的檢測方法。這種方法操作簡便，檢測過程周期短，分析準確，可以高通量檢測和篩選，并且克服了傳統(tǒng)抗菌活性篩選過程耗時長的問題，減小了勞動強度和材料消耗，是目前研究藥物對細菌敏感性流行的檢測方法[7]。但高通量儀器耗材昂貴、成本高，并不適用于環(huán)境領域中應用到的低精度的抑菌實驗。

3.4 定性與定量試驗

根據(jù)抑菌試驗測試需求的不同，抑菌試驗可以分為定性試驗和定量試驗兩種形式。定性試驗常用瓊脂擴散法，包括以上介紹的濾紙片法、平板打孔法、牛津杯法等，試驗精度較低。定量試驗常用最小抑菌濃度測定試驗，針對不溶性抑菌物采用瓊脂梯度稀釋法，針對可溶性抑菌物采用營養(yǎng)肉湯梯度稀釋法。定量試驗時需要取若干個試管，分別編號，將目標菌種濃度進行梯度稀釋，37℃培養(yǎng)24h后，觀察比較每個試管中培養(yǎng)液渾濁度。無菌落長出的試管中培養(yǎng)液澄清，有菌落長出的試管中培養(yǎng)液渾濁。產(chǎn)生渾濁液的最低濃度則為最小抑菌濃度，稀釋梯度越密集測試精度越準確[10]。

4 結束語

現(xiàn)如今，抗生素對水環(huán)境污染嚴重，污水廠長期滯留在其中不僅抑制活性污泥的生物活性，還會產(chǎn)生高排放污染物。在廢水和活性污泥中經(jīng)常檢測到ARB，這些類型的ARB如果成為生活污水中的優(yōu)勢菌群，會導致橫向基因轉移，入侵到人和動物中，誘導形成嚴重的耐藥性，使抗生素對人和動物致病菌治療能力大大降低。本文綜述了水體中抗生素污染現(xiàn)狀和抑菌試驗的幾種試驗方法，這些抑菌試驗操作方式簡單，試驗原料易取得，適用于對于精度要求不高的水處理試驗，對污水處理廠出水增設抑菌性測試可以減少含抗生素廢水對環(huán)境和生態(tài)的進一步影響。