王琦，周建平

（1.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院胃腸外科/疝外科，沈陽 110001；2.沈陽市第十人民醫(yī)院普通外科，沈陽 110041）

結(jié)核病是由結(jié)核桿菌引起的疾病，按單一致病菌致死率排序，結(jié)核病高居榜首。在22個(gè)結(jié)核病高發(fā)的國家中，中國位居前三名［1］。臨床將除肺結(jié)核外的所有結(jié)核病統(tǒng)稱為肺外結(jié)核，結(jié)核性腹膜炎（tuberculous peritonitis，TBP）為較常見的肺外結(jié)核，其發(fā)病率一直居高不下，主要是由于感染結(jié)核分枝桿菌，臨床上以腹腔感染為主要表現(xiàn)，該病亦是腹腔積液的常見原因之一［2］。統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，女性TBP患病率高于男性［3］。臨床上TBP的診斷存在普遍滯后的現(xiàn)象，這主要是因?yàn)門BP起病初期的癥狀不典型，特異性很低，很容易造成誤診，所以需盡早診斷并進(jìn)行治療干預(yù)，以改善患者預(yù)后。治療延誤或失治可引發(fā)腸粘連、不完全性腸梗阻等不良結(jié)局［4］。單純依據(jù)臨床表現(xiàn)很難明確TBP診斷，依據(jù)實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)果進(jìn)行診斷對早期患者尤為重要。臨床上診斷TBP的方法不盡相同，實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)結(jié)核分枝桿菌、組織病理檢查、抗酸染色以及干擾素釋放試驗(yàn)、分子學(xué)診斷即聚合酶酶鏈反應(yīng)等較為多用［5］。本研究探討了一項(xiàng)結(jié)核分枝桿菌檢測新技術(shù)——利福平耐藥實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增檢測技術(shù)（GeneXpert mycobacterium tuberculosis/rifampicin assay，簡稱GeneXpert MTB/RIF試驗(yàn)）［6］在診斷TBP上的優(yōu)勢。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選取2018年5月至2020年3月在沈陽市第十人民醫(yī)院就診的疑似TBP患者90例，年齡28～63歲。所有患者均行開放或腹腔鏡手術(shù)活體組織檢查，其中確診為TBP的患者33例（TBP組），包括男16例，女17例，平均年齡（40.85±5.70）歲；非TBP的患者57例（非TBP組），包括男27例，女30例，平均年齡（40.51±7.89）歲。所有患者手術(shù)取組織標(biāo)本（應(yīng)用腹腔鏡摘取患者病變組織3～4處或開腹取病變組織作為活體組織標(biāo)本），將標(biāo)本放入無菌容器內(nèi)，并及時(shí)送檢。

1.2 方法

1.2.1 抗酸染色：將收集的活體組織按照實(shí)驗(yàn)規(guī)范《結(jié)核病細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)規(guī)程》進(jìn)行處理。將獲取的組織置于10%中性福爾馬林固定液中固定，常規(guī)脫水處理，石蠟包埋后切片，應(yīng)用專用制劑進(jìn)行HE染色。光鏡下觀察后行抗酸染色，常規(guī)脫蠟至水后進(jìn)行石碳酸復(fù)紅染液染色（15～30 min），之后用鹽酸乙醇對標(biāo)本進(jìn)行脫色分化，水洗后再用美蘭復(fù)染劑輕染，顯微鏡下觀察并記錄結(jié)核分枝桿菌數(shù)目。

1.2.2 GeneXpert MTB/RIF試驗(yàn)：將收集的組織標(biāo)本充分研磨后取1～2 mL，將標(biāo)本和2～3倍體積的處理液放置于螺旋管中，消化處理15 min，然后將消化處理后的標(biāo)本取2 mL放入GeneXpert MTB/RIF試劑盒中，隨后將試劑盒放入GeneXpert MTB/RIF檢測系統(tǒng)中，輸入相關(guān)信息后進(jìn)行檢測。GeneXpert會自動對樣品組織進(jìn)行濾過與洗滌，超聲溶菌解離DNA后與PCR試劑混合，通過實(shí)時(shí)擴(kuò)張進(jìn)行熒光檢測。該試驗(yàn)主要是通過測得不同標(biāo)本的循環(huán)閾值（cycle threshold，Ct）來判定結(jié)果，Ct值的含義為每個(gè)處置管內(nèi)收集的熒光信號抵達(dá)設(shè)定閾值時(shí)呈現(xiàn)的循環(huán)數(shù)。通過該試驗(yàn)結(jié)果可以準(zhǔn)確得出結(jié)核分枝桿菌的數(shù)量和利福平的耐藥程度。

1.2.3 BACTEC MGIT 960液體培養(yǎng)和藥敏試驗(yàn)：根據(jù)BACTEC MGIT 960操作手冊，將采集完好的組織液1 mL加入至MGIT液體培養(yǎng)容器內(nèi)進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)，取第3～5天陽性結(jié)果的培養(yǎng)容器，然后用滴管準(zhǔn)確取1 mL作為待檢液體，隨后將其放入無菌生理鹽水中進(jìn)行稀釋（比例為1 ∶4），以此作為稀釋菌液。隨后將稀釋菌液按1 ∶100的比例進(jìn)一步稀釋，得到對照菌液。各取500 μL稀釋菌液和對照菌液進(jìn)行利福平耐藥試驗(yàn)和藥敏試驗(yàn)，取出液體在試管中混合均勻，然后放入BACTEC MGIT 960檢測儀器的培養(yǎng)箱中，檢測周期為13 d，得到藥敏和利福平耐藥結(jié)果。判定結(jié)核分枝桿菌存在的條件：（1）抗酸涂片染色（+）；（2）革蘭氏染色無雜菌生長；（3）結(jié)核膠體金檢測（+），上述3點(diǎn)必須全部符合。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料用率表示，采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行比較，計(jì)量資料用表示，采用方差分析進(jìn)行比較。P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3種診斷方法的效果比較

GeneXpert MTB/RIF試驗(yàn)對結(jié)核分枝桿菌的檢測靈敏度為81.82%，特異度為100%；BACTEC MGIT 960液體培養(yǎng)法對結(jié)核分枝桿菌的檢測靈敏度為30.3%，特異度為100.00%；抗酸染色法對結(jié)核分枝桿菌的檢測靈敏度為21.21%，特異度為94.74%。GeneXpert MTB/RIF試驗(yàn)對結(jié)核分枝桿菌檢測的靈敏度明顯高于BACTEC MGIT 960液體培養(yǎng)法（χ2=17.78，P＜ 0.01）和抗酸染色法（χ2=24.26，P＜0.01）。見表1。

表1 3種方法對TBP診斷效果的比較

2.2 利福平耐藥性的比較

10份BACTEC MGIT 960液體培養(yǎng)陽性的藥敏試驗(yàn)顯示，利福平結(jié)核分枝桿菌耐藥占40%，利福平結(jié)核分枝桿菌敏感占60%。以BACTEC MGIT 960液體培養(yǎng)的藥敏結(jié)果作為金標(biāo)準(zhǔn)，GeneXpert MTB/RIF試驗(yàn)檢測利福平結(jié)核分枝桿菌耐藥的靈敏度可達(dá)75.00%（3/4），特異度為83.33%（5/6）。

3 討論

TBP不同于其他結(jié)核病，具有發(fā)病率、致殘率、致死率高的特點(diǎn)。同時(shí)，TBP屬于肺外結(jié)核，其診斷與肺結(jié)核等結(jié)核病的診斷方法截然不同。結(jié)核分枝桿菌在痰中的含量很少，故常規(guī)臨床中將分離痰內(nèi)結(jié)核分枝桿菌的檢測方法用于診斷TBP效果并不理想，TBP的診斷難度較肺結(jié)核更高。既往細(xì)菌學(xué)檢測一直是TBP診斷的核心方法，但陽性檢出率較低，已經(jīng)逐漸被臨床淘汰。由于TBP的臨床表現(xiàn)不典型，加上臨床診斷上存在一定程度的誤診、漏診，故國內(nèi)外專家一直在致力于尋找特異度高、靈敏度好、操作簡便的TBP診斷方法。

本研究選取33例TBP患者和57例非TBP患者，應(yīng)用不同的檢測方法進(jìn)行診斷。結(jié)果顯示，GeneXpert MTB/RIF試驗(yàn)對TBP診斷的靈敏度為81.82%，高于BACTEC MGIT 960液體培養(yǎng)法（30.30%）和抗酸染色法（21.21%）。研究結(jié)果表明，GeneXpert MTB/RIF試驗(yàn)對TBP的診斷精準(zhǔn)度更高、靈敏度更好。同時(shí)，GeneXpert MTB/RIF檢測利福平結(jié)核分枝桿菌耐藥TBP的靈敏度可達(dá)75.00%，特異度為83.33%，而BACTEC MGIT 960液體培養(yǎng)陽性的藥敏試驗(yàn)結(jié)果雖為檢測結(jié)核分枝桿菌的金標(biāo)準(zhǔn)，但其靈敏度和特異度均低于GeneXpert MTB/RIF試驗(yàn)。

抗酸染色法對標(biāo)本內(nèi)細(xì)菌含量的要求較高?？顾崛旧Y(jié)果陽性要求標(biāo)本中漿膜腔內(nèi)細(xì)菌群至少在5 000 U/mL以上，若積液中細(xì)菌群僅為1 000 U/mL，那么檢出率為50%左右，只有細(xì)菌群超過10 000 U/mL時(shí)，檢出率才能超過90%。同時(shí)，由于檢測過程中標(biāo)本極易在染色沖洗過程中被干擾，再加上試驗(yàn)條件、人為等主客觀因素，該方法的陽性檢出率低。BACTEC MGIT 960液體培養(yǎng)作為檢測結(jié)核分枝桿菌的金標(biāo)準(zhǔn)，雖在臨床應(yīng)用中靈敏度有所提高，但結(jié)核分枝桿菌特殊的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)與生理特性決定了其培養(yǎng)時(shí)間相對較長。再加上結(jié)核分枝桿菌對培養(yǎng)基營養(yǎng)需求極其苛刻，只能在富含充足的血清、甘油、馬鈴薯或一些無機(jī)鹽的特殊培養(yǎng)材質(zhì)下才能正常生長與繁殖，若無合適的氧分供應(yīng)和溫度調(diào)節(jié)則難以成功培養(yǎng)，多數(shù)臨床條件難以支持，很難滿足快速診斷、早期診斷的需要。T-spot檢測是近年來活躍在臨床一線的結(jié)核特異性抗體檢測方法，T-spot檢測雖然具有較高的靈敏度，但假陽性率較高，因此本研究并未應(yīng)用，再加上其檢測費(fèi)用較高，并不適合廣泛推廣。

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，實(shí)時(shí)熒光定量條件下的核酸擴(kuò)增技術(shù)用于醫(yī)學(xué)試驗(yàn)和臨床日趨廣泛，該技術(shù)成功應(yīng)用的典范——GeneXpert MTB/RIF試驗(yàn)，對結(jié)核類疾病的檢測表現(xiàn)出較高的靈敏度和特異度［7-9］。GeneXpert MTB/RIF試驗(yàn)是一種全自動操作，儀器應(yīng)用半巢式實(shí)時(shí)熒光條件下定量PCR技術(shù)，設(shè)定rpoB基因?yàn)橐锾结槪诤繛?0～100 U/mL時(shí)即可精確識別分揀。前期將標(biāo)本稀釋制備后，放入檢測儀器中，儀器自動對標(biāo)本實(shí)施采集、提取核酸并進(jìn)行擴(kuò)增，對結(jié)核分枝桿菌及利福平耐藥的核心檢測周期僅為2 h，大大提高了檢測效率［10］。而且研究顯示GeneXpert MTB/RIF試驗(yàn)的檢測結(jié)果準(zhǔn)確度較高，目前大多數(shù)臨床和實(shí)驗(yàn)中心已逐漸將該技術(shù)大范圍用于結(jié)核病的檢測和篩查。GeneXpert MTB/RIF檢測系統(tǒng)采用rpoB基因?yàn)橐锾结?，該基因與利福平耐藥相關(guān)［11］，應(yīng)用該儀器可同時(shí)檢測結(jié)核分枝桿菌數(shù)目和利福平耐藥情況。李曉非等［12］利用GeneXpert MTB/RIF試驗(yàn)對1 386例疑似結(jié)核病患者進(jìn)行診斷，結(jié)果顯示GeneXpert MTB/RIF試驗(yàn)對結(jié)核病的診斷和治療有效，尤其擅于早期發(fā)現(xiàn)和治療多藥耐藥結(jié)核病。PATIL等［13］對診斷率較低、極易誤診的下肺野結(jié)核進(jìn)行研究，收集了2 600例結(jié)核患者，應(yīng)用支氣管灌洗液樣本進(jìn)行GeneXpert MTB/RIF檢測，認(rèn)為GeneXpert MTB/RIF試驗(yàn)是評估下肺野結(jié)核的最佳診斷方法，可以廣泛應(yīng)用于臨床。METAFER IA等［14］對埃塞俄比亞的肺外結(jié)核病例進(jìn)行了橫斷面研究，收集了353例肺外結(jié)核病例，發(fā)現(xiàn)GeneXpert MTB/RIF試驗(yàn)的應(yīng)用比例高達(dá)71%，其中包括很多涂片陰性的患者，能夠顯著降低診斷的假陰性率。說明GeneXpert MTB/RIF試驗(yàn)?zāi)軌蚪鉀Q肺外結(jié)核的檢測難題，在保證檢測準(zhǔn)確性的同時(shí)，減少了復(fù)雜的人工程序，縮短了檢測周期，因此具有較高的臨床實(shí)用性。另外，本研究在確診為TBP的33例患者術(shù)中同時(shí)取腹水樣本21例，進(jìn)行了GeneXpert MTB/RIF試驗(yàn)檢測，結(jié)果均為陰性，提示臨床應(yīng)用GeneXpert MTB/RIF試驗(yàn)檢測TBP時(shí)需要對患者進(jìn)行活體組織檢查，才能保證檢出率。

綜上所述，GeneXpert MTB/RIF試驗(yàn)在TBP結(jié)核分枝桿菌檢測方面有明顯優(yōu)勢，主要表現(xiàn)在其靈敏度水平與特異性表現(xiàn)，同時(shí)具有方便、快捷、高效等優(yōu)點(diǎn)，故在臨床與診斷實(shí)踐中對TBP的快速診斷以及利福平耐藥情況的判定方面具有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值。