董 琛，李丹丹，張志勇，馬玉華，LI Lei

（1.山東體育學(xué)院體育社會(huì)科學(xué)學(xué)院，運(yùn)動(dòng)營(yíng)養(yǎng)與智慧配餐實(shí)驗(yàn)室，山東濟(jì)南 250102；2.荷蘭格羅寧根大學(xué)，生物醫(yī)學(xué)工程研究中心，荷蘭格羅寧根 9713）

2020年以來(lái)，隨著新冠肺炎病毒在全球的肆虐，越來(lái)越多的食品外包裝樣本檢出新冠病毒核酸陽(yáng)性，真菌、細(xì)菌、病毒互作互生復(fù)雜，食品包裝材料微生物污染問(wèn)題引起了各國(guó)的廣泛關(guān)注和重視[1?2]。目前，食品外包裝材料抑菌劑多種多樣，主要有效成分為雙季銨鹽抑菌劑或過(guò)氧化氫及其他混合物等[3?4]。然而，由于長(zhǎng)期使用單一抑菌劑使得微生物產(chǎn)生耐藥性的可能性大大提高。研究表明，交替使用不同的抑菌劑或復(fù)合抑菌劑在一定程度上可以減緩微生物對(duì)于抑菌劑的耐藥性[5]。為了能夠減輕微生物的耐藥性，開(kāi)發(fā)新型的抑菌劑（包括成分新配方）就成為了食品包裝材料領(lǐng)域微生物污染控制的重要一環(huán)[6?7]。

結(jié)合食品外包裝材料特點(diǎn)、微生物種類及人員安全因素，適用于食品包裝材料的抑菌劑應(yīng)主要具備高效、低毒、廣譜、無(wú)味、穩(wěn)定性好等特點(diǎn)，且對(duì)人的皮膚及眼睛無(wú)刺激性，對(duì)食品包裝材料及設(shè)備表面不產(chǎn)生腐蝕[8?9]。有機(jī)硅季銨鹽是一種理想的抑菌劑，具有良好的綜合性能，對(duì)人體皮膚無(wú)刺激性、無(wú)致癌作用[10]。季銨鹽化合物能吸附各種帶有負(fù)電荷的微生物，抑菌效果優(yōu)良，并且抑菌譜廣，能有效抑制諸多不同類型的微生物，在世界各國(guó)應(yīng)用十分廣泛[11?12]。脫氫乙酸鈉鹽是一種安全的食品型抑菌劑，可按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)劑量添加在食物中避免霉變引起的產(chǎn)品變質(zhì)和經(jīng)濟(jì)損失[13?14]。食品級(jí)抑菌劑脫氫乙酸鈉鹽應(yīng)用于食品包裝材料表面抑菌，可保證在發(fā)揮其高效廣譜的抑菌能力的同時(shí)，又不會(huì)對(duì)人員的健康帶來(lái)任何威脅。聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽等含有胍基官能團(tuán)的聚合物是一種具有抑制微生物生長(zhǎng)活性的有機(jī)化合物[15]，在醫(yī)療衛(wèi)生、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、服裝等領(lǐng)域使用非常普遍[16]，廣泛被用于衣物和紡織品的抑菌除臭，也是食品中綜合抑菌性能優(yōu)良的防腐劑之一[17]。本試驗(yàn)選用的有機(jī)硅季銨鹽、脫氫乙酸鈉鹽和聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽均是安全性高的生物抑菌劑，將三者單獨(dú)用于抑菌保鮮研究已見(jiàn)報(bào)道，且取得了較好效果，但將上述三種抑菌劑復(fù)配用于食品外包裝材料的應(yīng)用尚未見(jiàn)報(bào)道。

本研究選擇日常食品外包裝和環(huán)境樣本中大量存在的芽枝狀枝孢霉、黑曲霉、金灰青霉和多主枝孢霉這四種代表性真菌作為試驗(yàn)測(cè)試菌株[18?21]，通過(guò)有機(jī)硅季銨鹽、脫氫乙酸鈉鹽和聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽三種抑菌劑的施用篩選及復(fù)配，為食品包裝領(lǐng)域微生物控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

有機(jī)硅季銨鹽AEM-5700（CAS：27668-52-6，以異丙醇為溶劑，活性物含量60%）、聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽（CAS：32289-58-0（USA）/27083-27-8（Europe）/133029-32-0（INCI），活性物含量98%） 長(zhǎng)沙研邦化工科技有限公司；脫氫乙酸鈉鹽（CAS：64039-28-7，活性物含量98%） 梯希愛(ài)（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司；黑曲霉菌種（Aspergillus niger3.3928）中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心；芽枝狀枝孢菌種（Cladosporium cladosporioidesCICC 2477）、多主枝孢霉菌種（Cladosporium herbarumCICC 2443）和金灰青霉菌種（Penicillium aurantiogriseumCICC 40651）中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

CX 33生物顯微鏡 奧林巴斯（中國(guó)）有限公司（蘇州）；HCB-900V超凈臺(tái) 青島海爾生物醫(yī)療股份有限公司；YXQ-LS-50A滅菌鍋 上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；101-2AB微生物培養(yǎng)箱 天津泰斯特儀器有限公司；FJY1002-UVF-P超純水制作設(shè)備 青島富勒姆科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)菌種處理 購(gòu)自菌種保藏中心的菌種為安瓿管封裝的凍干菌種，用移液槍在安瓿管中加入3～5 mL合適的液體培養(yǎng)基，緩慢振蕩搖勻使凍干菌粉溶解呈懸浮狀態(tài)。用移液槍吸取菌液，將其接入到兩支斜面培養(yǎng)基試管中，置于28～31℃環(huán)境下培養(yǎng)2 d，對(duì)凍干菌種進(jìn)行恢復(fù)培養(yǎng)。培養(yǎng)2 d后，取出復(fù)壯后的第二代真菌斜面培養(yǎng)基。再將二代菌種轉(zhuǎn)入平板培養(yǎng)基，在28～31℃恒溫培養(yǎng)3 d，得到第三代工作菌作為本研究用菌種。

1.2.2 抑菌試驗(yàn)方法 將抑菌劑加水溶解，之后添加到滅菌后的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（Potato Dextrose Agar，PDA）培養(yǎng)基中，通常按1:9比例配制抑菌劑瓊脂平板，根據(jù)需要來(lái)選擇抑菌劑濃度范圍。在抑菌劑和PDA培養(yǎng)基充分混合至均勻之后，將混合物傾倒至滅菌平皿（直徑9 cm），每個(gè)無(wú)菌培養(yǎng)平板中需倒入20～25 mm的培養(yǎng)基。對(duì)照組為不含抑菌劑的PDA培養(yǎng)基。將直徑約為5 mm的第三代工作用菌種接種到PDA培養(yǎng)基中心。將培養(yǎng)皿用封口膜封存并在28℃下培養(yǎng)5 d，分別測(cè)量對(duì)照組和試驗(yàn)組的平均菌絲直徑，以此計(jì)算得出抑菌劑對(duì)于菌種的菌絲生長(zhǎng)抑制率。本研究所有的抑菌相關(guān)試驗(yàn)均做了三組重復(fù)，并且所呈現(xiàn)的結(jié)果是三組平行試驗(yàn)結(jié)果的均值，實(shí)驗(yàn)濃度如表1所示。

表1 有機(jī)硅季銨鹽、脫氫乙酸鈉鹽和聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽抑菌實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Experiment design of OQAS,SD and PHMB

試驗(yàn)組相對(duì)于對(duì)照組的相對(duì)菌絲生長(zhǎng)抑制用百分比表示，通過(guò)以下公式進(jìn)行計(jì)算：

式中：dc和dt分別表示對(duì)照組和試驗(yàn)組三組重復(fù)的平均菌絲半徑，mm。

1.2.3 三種抑菌劑的復(fù)配研究方法 通過(guò)對(duì)單一抑菌劑的抑菌試驗(yàn)，確定了三種抑菌劑的有效濃度范圍。根據(jù)響應(yīng)曲面法設(shè)計(jì)原理，采用Design-Expert.8.05軟件中Box-Behnken設(shè)計(jì)三因素三水平實(shí)驗(yàn)。制備三元復(fù)合抑菌劑。主要影響因素（自變量）為有機(jī)硅季銨鹽（X1）、脫氫乙酸鈉（X2）和聚六亞甲基二胍鹽酸鹽（X3）的用量，并以+1、0、?1分別代表自變量的高、中、低三因素水平，三個(gè)自變量根據(jù)以下方程進(jìn)行編碼。

式中：xi是本研究中自變量的編碼結(jié)果；Xi是本研究中自變量的實(shí)際選取濃度結(jié)果，X0是本研究中自變量在位于中心點(diǎn)處的實(shí)際濃度水平值，ΔX是本研究中自變量的波動(dòng)區(qū)間。

根據(jù)單一抑菌劑抑菌試驗(yàn)結(jié)果，確定復(fù)合抑菌劑對(duì)芽枝狀枝孢霉的試驗(yàn)各因素編碼的水平見(jiàn)表2。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素編碼及水平Table 2 Box-Behnken test design factor coding and level

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組實(shí)驗(yàn)都重復(fù)了3次，并進(jìn)行了2次平行測(cè)量。6次測(cè)量的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差作為最終的結(jié)果，運(yùn)用SPSS 18.0軟件ANOVA分析，并應(yīng)用Origin 8.5進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單一抑菌劑抑菌試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 四種真菌自然生長(zhǎng)狀況 如圖1所示，為四種真菌在不添加任何抑菌劑的平板上，在28℃下培養(yǎng)5 d的生長(zhǎng)狀況?？梢钥闯?，芽枝狀枝孢霉和多主枝孢霉長(zhǎng)滿了整個(gè)平板，其次黑曲霉的生長(zhǎng)能力也比較旺盛，而金灰青霉在同樣條件下的生長(zhǎng)能力最弱，在圖1c中可以看到大部分培養(yǎng)基都沒(méi)有利用。

圖1 培養(yǎng)5 d后空白對(duì)照組芽枝狀枝孢霉（a）、黑曲霉（b）、金灰青霉（c）和多主枝孢霉（d）的菌絲生長(zhǎng)情況Fig.1 After 5 days, mycelium growth states of Clado sporium cladosporioides (a), Aspergillus niger (b), Penicillium aurantiogriseum(c)and Cladosporium herbarum(d)in the control group

2.1.2 有機(jī)硅季銨鹽對(duì)四種真菌的抑制效果 如圖2所示，有機(jī)硅季銨鹽對(duì)四種真菌菌絲生長(zhǎng)的抑制率隨著用量的增加而增加，有機(jī)硅季銨鹽對(duì)四種真菌的實(shí)際作用效果有所差異，對(duì)多主枝孢霉抑制率最高。經(jīng)培養(yǎng)5 d后實(shí)驗(yàn)分析驗(yàn)證，當(dāng)達(dá)到菌絲生長(zhǎng)完全抑制時(shí)，芽枝狀枝孢霉所需有機(jī)硅季銨鹽的最少用量為48.1 mg/mL，黑曲霉所需有機(jī)硅季銨鹽最少用量為46.3 mg/mL，金灰青霉所需有機(jī)硅季銨鹽的最少用量為44.4 mg/mL，多主枝孢霉所需有機(jī)硅季銨鹽的最少用量為16.7 mg/mL。

圖2 培養(yǎng)5 d后不同濃度的有機(jī)硅季銨鹽對(duì)四種真菌菌絲生長(zhǎng)的抑制率Fig.2 Inhibition rateof different concentrations of OQASon mycelial growth of fungiafter 5 daysincubation

如圖3所示，四種真菌對(duì)有機(jī)硅季銨鹽的反應(yīng)有明顯不同。盡管當(dāng)達(dá)到菌絲生長(zhǎng)完全抑制時(shí)，芽枝狀枝孢霉、黑曲霉和金灰青霉所需的有機(jī)硅季銨鹽用量上差異不是十分明顯，但在實(shí)際抑菌作用效果變化上有明顯不同，以有機(jī)硅季銨鹽用量為3.7 mg/mL時(shí)為例，可以看出芽枝狀枝孢霉的菌絲半徑要明顯大于其他三種真菌。同時(shí)，多主枝孢霉菌絲半徑隨著有機(jī)硅季銨鹽用量的增多迅速減小，并且使用較小劑量的有機(jī)硅季銨鹽就可以達(dá)到很好的抑制效果。在對(duì)紡織品、醫(yī)用傷口敷料的研究中，有機(jī)硅季銨鹽在1～50 mg/mL都表現(xiàn)出了良好的抑菌效果，不僅對(duì)真菌具有很強(qiáng)的抑菌效果，對(duì)金黃色葡萄球菌及綠膿桿菌的抑制率也均超過(guò)97%[22?23]。有機(jī)硅季銨鹽具有良好的綜合性能，對(duì)人體皮膚無(wú)刺激性，能吸附各種帶有負(fù)電荷的微生物，抑菌效果優(yōu)良，并且抑菌譜廣[3]。

圖3 培養(yǎng)5 d后不同濃度的有機(jī)硅季銨鹽對(duì)菌絲生長(zhǎng)抑制作用效果Fig.3 Antifungal activity of different concentrationsof OQAS on mycelial growth after 5 daysincubation

2.1.3 脫氫乙酸鈉鹽對(duì)四種真菌的抑制效果 如圖4所示，脫氫乙酸鈉鹽對(duì)四種真菌菌絲生長(zhǎng)的抑制率隨著用量的增加而增加，脫氫乙酸鈉鹽對(duì)四種真菌的實(shí)際作用效果有所差異。經(jīng)實(shí)驗(yàn)分析驗(yàn)證，當(dāng)達(dá)到菌絲生長(zhǎng)完全抑制時(shí)，芽枝狀枝孢霉所需脫氫乙酸鈉鹽的最少用量為2.52 mg/mL，黑曲霉所需脫氫乙酸鈉鹽最少用量為1.62 mg/mL，金灰青霉所需脫氫乙酸鈉鹽的最少用量為0.96 mg/mL，多主枝孢霉所需脫氫乙酸鈉鹽的最少用量為0.22 mg/mL。

圖4 培養(yǎng)5 d后不同濃度的脫氫乙酸鈉鹽對(duì)四種真菌菌絲生長(zhǎng)的抑制率Fig.4 Inhibition rateof different concentrations of SD on mycelial growth of fungiafter 5 daysincubation

圖5展示了培養(yǎng)5 d后不同濃度的脫氫乙酸鈉鹽對(duì)四種真菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用效果圖，可以看出4種真菌對(duì)有機(jī)硅季銨鹽的反應(yīng)有明顯不同，多主枝孢霉對(duì)脫氫乙酸鈉鹽非常敏感，隨著抑菌劑用量的增加，多主枝孢霉菌絲半徑迅速減小，而芽枝狀枝孢霉只有在抑菌劑濃度較大時(shí)才表現(xiàn)出明顯的抑制效果，這也和圖4折線圖相吻合。有研究表明，0.4 mg/mL脫氫乙酸鈉鹽對(duì)柑橘指狀青霉抑菌率達(dá)到99%[24]。此外，脫氫乙酸鈉鹽不僅有抗菌效果，還具有防腐效能，添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%脫氫乙酸鈉的改性PVA薄膜對(duì)蛋糕的保鮮效果較好，應(yīng)用于食品材料及設(shè)備表面抑菌，可保證在發(fā)揮其高效廣譜的抑菌能力的同時(shí)，又不會(huì)對(duì)人員的健康帶來(lái)任何威脅[13?14]。

圖5 培養(yǎng)5 d后不同濃度的脫氫乙酸鈉鹽對(duì)菌絲生長(zhǎng)抑制作用效果Fig.5 Antifungal activity of different concentrations of SD on mycelial growth after 5 days incubation

2.1.4 聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽對(duì)四種真菌的抑制效果 如圖6所示，聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽對(duì)四種真菌菌絲生長(zhǎng)的抑制率均隨著用量的增加而增加，聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽對(duì)四種真菌的實(shí)際作用效果有所差異。經(jīng)實(shí)驗(yàn)與分析驗(yàn)證，當(dāng)達(dá)到菌絲生長(zhǎng)完全抑制時(shí)，芽枝狀枝孢霉所需聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽的最少用量為2.9 mg/mL，黑曲霉所需聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽最少用量為0.4 mg/mL，金灰青霉所需聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽的最少用量為0.56 mg/mL，多主枝孢霉所需聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽最少用量為0.52 mg/mL。

圖6 培養(yǎng)5 d后不同濃度的聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽對(duì)四種真菌菌絲生長(zhǎng)的抑制率Fig.6 Inhibition rate of different concentrationsof PHMBon mycelial growth of fungiafter 5 daysincubation

如圖7所示，可以看出四種真菌對(duì)聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽的反應(yīng)有明顯不同，隨著抑菌劑用量的增加，黑曲霉、金灰青霉和多主枝孢霉對(duì)聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽反應(yīng)敏感，菌絲半徑迅速減小，而芽枝狀枝孢霉只有在抑菌劑濃度較大時(shí)才表現(xiàn)出明顯的抑制效果，這也和圖6折線圖相吻合。相似的，2 mg/mL聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽在紡織物上的抑菌效果可達(dá)95%以上[25]，此外，在食品包裝薄膜上應(yīng)用聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽母粒4%時(shí)，抗菌薄膜對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和雜菌樣品的抗菌率分別為99.1%、99.2%和83.4%，且存放6個(gè)月后抗菌薄膜仍保持較強(qiáng)的抗菌作用[15]。含有胍基官能團(tuán)的聚合物是一種具有特殊生物活性的有機(jī)化合物，在醫(yī)療衛(wèi)生、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、服裝等領(lǐng)域使用非常普遍，并對(duì)食品的抑菌、除臭具有一定的效果[16]。

圖7 培養(yǎng)5 d后不同濃度的聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽對(duì)菌絲生長(zhǎng)抑制作用效果Fig.7 Antifungal activity of different concentrationsof PHMB on mycelial growth after 5 days incubation

單一抑菌劑抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果的圖2、圖4和圖6表明，抑菌率隨著抑菌劑用量的增加而增加，但是四種真菌對(duì)三種抑菌劑的反應(yīng)明顯不同。參照三種抑菌劑對(duì)四種真菌的抑制作用效果圖（圖3、圖5、圖7）及空白對(duì)照組（圖1），可以看出在相同的培養(yǎng)條件下，芽枝狀枝孢霉生長(zhǎng)繁殖能力強(qiáng)，對(duì)抑菌劑敏感度低，需要最多劑量的抑菌劑來(lái)完全抑制菌絲生長(zhǎng)；而多主枝孢霉雖然生長(zhǎng)繁殖能力強(qiáng)，但對(duì)抑菌劑敏感度略高，用較小劑量的抑菌劑就可以完全抑制菌絲生長(zhǎng)。這從一定角度也揭示了芽枝狀枝孢霉、黑曲霉的生長(zhǎng)繁殖能力強(qiáng)。此外，已有大量研究表明，不同的微生物對(duì)抑菌劑的反應(yīng)會(huì)有明顯的差異[26]。這也很好的解釋了在本研究中芽枝狀枝孢霉和黑曲霉需要較高劑量的抑菌劑來(lái)完全抑制菌絲生長(zhǎng)的原因。

本研究通過(guò)單一抑菌劑對(duì)4種測(cè)試菌株的抑菌試驗(yàn)，確定了單一抑菌劑的有效濃度使用范圍。試驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)于有機(jī)硅季銨鹽，其需要使用更大的劑量來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)四種測(cè)試菌株的完全抑制。對(duì)于抑菌劑的使用，應(yīng)盡可能減少抑菌劑的使用劑量，從而保證減少對(duì)人體及環(huán)境的危害。復(fù)合抑菌劑通過(guò)將不同抑菌機(jī)理的抑菌劑復(fù)合，可以使復(fù)合抑菌劑的抑菌機(jī)理更為復(fù)雜，從而使其更為高效，且減緩微生物對(duì)抑菌劑的耐藥性。

2.2 三元復(fù)合抑菌劑研究結(jié)果

從單一抑菌劑抑菌試驗(yàn)結(jié)果中可以得出，芽枝狀枝孢霉達(dá)到菌絲完全抑制時(shí)所需的三種抑菌劑的濃度顯著高于其他三種真菌，說(shuō)明芽枝狀枝孢霉是這四種真菌中存活能力最強(qiáng)的。本著研制高效安全復(fù)合的原則，本研究在進(jìn)行三元復(fù)合抑菌劑的復(fù)配時(shí)，期望通過(guò)增加脫氫乙酸鈉鹽和聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽的相對(duì)比例，來(lái)降低有機(jī)硅季銨鹽在復(fù)合抑菌劑的相對(duì)用量，從而降低復(fù)合抑菌劑的使用劑量。同時(shí)，根據(jù)大量同類研究表明，在復(fù)合抑菌劑中單一組分的含量一般要低于其單獨(dú)使用的用量[27]。所以，本研究在響應(yīng)面法水平選取中，不單要結(jié)合單一抑菌劑抑菌試驗(yàn)結(jié)果，還要從復(fù)合抑菌劑的角度加以綜合考慮。因此在復(fù)合抑菌劑研究中，先以復(fù)合抑菌劑對(duì)芽枝狀枝孢霉的抑菌率進(jìn)行考量，得出最佳復(fù)配比例后，再對(duì)其他三種真菌進(jìn)行驗(yàn)證。

2.2.1 復(fù)合抑菌劑試響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果 采用Design-Expert.8.05軟件設(shè)計(jì)并進(jìn)行Box-Benhnken試驗(yàn)，結(jié)果如表3所示。

復(fù)合抑菌劑抑菌率方差分析表明（表4），對(duì)復(fù)合抑菌劑抑菌率所建立的回歸模型極顯著（P<0.01），有機(jī)硅季銨鹽、脫氫乙酸鈉鹽和聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽的用量對(duì)芽枝狀枝孢霉抑菌率均有極顯著影響（P<0.0001），以復(fù)合抑菌劑抑菌率為響應(yīng)指標(biāo)，利用Design-Expert.8.05軟件對(duì)表3的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二次多元回歸擬合分析，得到復(fù)合抑菌劑抑菌率對(duì)編碼自變量X1（有機(jī)硅季銨鹽使用濃度）、X2（脫氫乙酸鈉鹽的使用濃度）、X3（聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽的使用濃度）的二次多項(xiàng)回歸方程：

表3 Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Test results of Box-Behnken

表4 回歸方程方差分析Table4 Regression equation analysisof variance

回歸分析表明，該回歸模型P<0.0001，F(xiàn)為92.31，決定系數(shù)（R2）=0.9916，說(shuō)明該方程的擬合程度和可靠性很高，可用于預(yù)測(cè)復(fù)合抑菌劑的抑菌率。CV，即Y的變異系數(shù)，代表實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確度，CV值越高，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)的可靠性越差。在本研究中，CV值為0.67%，這表明本研究所采用的研究方法及試驗(yàn)流程是可靠的。此外，在回歸方程交互項(xiàng)和二次項(xiàng)X12、X32的P值小于0.001，具有極其顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。而X22的P值小于0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。因此，本研究得到的二次多項(xiàng)回歸方程可以很好地解釋三種單一抑菌劑濃度的變化對(duì)復(fù)合抑菌劑的抑菌率產(chǎn)生的影響。

為了更直觀地解釋各種因素及其相互作用對(duì)復(fù)合抑菌劑抑菌率的影響，并表征其響應(yīng)函數(shù)特征，借助于Design-Expert.8.05軟件在固定其他因素不變的情況下，得到任意兩個(gè)因素及其相互作用對(duì)復(fù)合抑菌劑抑菌率的響應(yīng)面圖，結(jié)果如圖8所示。在響應(yīng)面分析中，如果響應(yīng)面的斜率相對(duì)平坦，則表明在一定范圍內(nèi)，該抑菌劑使用濃度對(duì)復(fù)合抑菌劑的抑菌率影響不大；相反，假如一個(gè)響應(yīng)面斜率非常大，則說(shuō)明復(fù)合抑菌劑抑菌率對(duì)于該組分的濃度變化十分敏感[28]。有機(jī)硅季銨鹽、脫氫乙酸鈉鹽和聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽的用量三因素彼此之間存在比較顯著的交互作用，對(duì)復(fù)合抑菌劑抑菌率的影響顯著性依次是：脫氫乙酸鈉鹽用量>聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽用量>有機(jī)硅季銨鹽用量。這可能與三種抑菌劑的抑菌機(jī)理相關(guān)，有機(jī)硅季銨鹽以有機(jī)硅作為媒介，將具有抑菌功能的銨陽(yáng)離子基團(tuán)強(qiáng)有力地吸附于微生物細(xì)胞壁的表面，通過(guò)改變微生物細(xì)胞壁的通透性，使微生物呼吸作用所需的物質(zhì)溢出，這使得微生物停止呼吸作用而導(dǎo)致死亡[29]；脫氫乙酸鈉鹽通過(guò)改變膜的通透性來(lái)影響微生物的能量代謝，來(lái)達(dá)到抑制微生物生長(zhǎng)的目的[30]；聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽的陽(yáng)離子官能團(tuán)能夠裂解微生物細(xì)胞壁，并使細(xì)胞膜破裂[31]。

圖8 各因素交互影響抑菌率的響應(yīng)面圖Fig.8 Response surface curves of the interactions between any two factors on the inhibition rate

2.2.2 復(fù)合抑菌劑配方 本研究基于以上獲得的響應(yīng)面回歸方程作為目標(biāo)函數(shù)，采用二次規(guī)劃法（Quadratic Programming），對(duì)各個(gè)因素的水平進(jìn)行優(yōu)化，由于只有3個(gè)因素，因此這里采用的是它的中型優(yōu)化算法，通過(guò)類似求解線性規(guī)劃問(wèn)題來(lái)獲得初始可行解，再通過(guò)投影法確定最終的優(yōu)化結(jié)果。二次規(guī)劃法的數(shù)學(xué)模型為：

目標(biāo)函數(shù)滿足以下約束：

在Matlab/Optimization Toolbox中對(duì)以上模型進(jìn)行求解，得到3種抑菌劑用量的最優(yōu)配比方案（表5），抑菌率的理論優(yōu)化值為99.75%。通過(guò)該配方得到復(fù)合抑菌劑中有機(jī)硅季銨鹽的用量為0.38 mg/mL，脫氫乙酸鈉鹽的用量為0.69 mg/mL，聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽的用量為0.49 mg/mL，三種抑菌劑的總用量為1.56 mg/mL，達(dá)到的實(shí)際抑菌率為100%。

表5 復(fù)合抑菌劑配方優(yōu)化方案Table 5 Formulation optimization of compound bacteriostatic agent

將基于芽枝狀枝孢霉分析得到的抑菌劑優(yōu)化配方對(duì)其它三種真菌進(jìn)行驗(yàn)證。將優(yōu)選得到的抑菌劑配方添加到PDA培養(yǎng)基中，并將試樣在溫度為28℃的條件下培養(yǎng)5 d。從圖9可以看出，優(yōu)化得到的抑菌劑配方可以完全抑制黑曲霉、金灰青霉和多主枝孢霉的生長(zhǎng)。

本研究經(jīng)優(yōu)化得到的復(fù)配抑菌劑，對(duì)四種真菌均呈現(xiàn)出良好的抑制效果（圖9）。在優(yōu)化配方中，抑菌劑的總用量為1.56 mg/mL（在安全使用濃度范圍之內(nèi)），并且值得注意的是，其中有機(jī)硅季銨鹽的用量為0.38 mg/mL，相對(duì)于其單獨(dú)使用時(shí)的用量有了顯著的降低。同時(shí)，就四種真菌中生長(zhǎng)繁殖能力最強(qiáng)的芽枝狀枝孢霉而言，優(yōu)化配方中抑菌劑總用量，要明顯低于三種抑菌劑單獨(dú)作用時(shí)的用量（表6）。可以說(shuō)，本研究通過(guò)復(fù)配得到一種高效的復(fù)合抑菌劑。此前有研究表明，通過(guò)將幾種不同的抑菌劑復(fù)配使用，可以減少抑菌劑的用量，并且可以達(dá)到協(xié)同或互補(bǔ)作用，從而使抑菌劑更為高效[32?33]，同時(shí)可以減緩耐藥性的產(chǎn)生。

圖9 在28℃培養(yǎng)5 d后優(yōu)化配方對(duì)黑曲霉（a）、金灰青霉（b）和多主枝孢霉（c）的菌絲生長(zhǎng)抑制效果圖Fig.9 Effect of theoptimized formula on mycelial growth inhibition of Aspergillus niger (a), Penicilliumaurantiogriseum(b)and Cladosporiumherbarum(c)cultured after 28℃for 5 d

表6 完全抑菌時(shí)三種抑菌劑單獨(dú)作用時(shí)的用量Table 6 Thedosage of three kindsof bacteriostatic agents acting alone in complete bacteriostasis

3 結(jié)論

抑菌率隨抑菌劑量的增加而升高，但四種真菌對(duì)三種抑菌劑的反應(yīng)明顯不同。本研究經(jīng)優(yōu)化得到的復(fù)配抑菌劑，對(duì)四種真菌均呈現(xiàn)出良好的抑制效果。完全抑菌時(shí)（抑菌率100%），復(fù)合抑菌劑中有機(jī)硅季銨鹽的用量為0.38 mg/mL，脫氫乙酸鈉鹽的用量為0.69 mg/mL，聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽的用量為0.49 mg/mL，三種抑菌劑的總用量為1.56 mg/mL。通過(guò)復(fù)配可以明顯減少單一抑菌劑的用量，從而使抑菌劑變得更為安全高效。有機(jī)硅季銨鹽、脫氫乙酸鈉鹽和聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽的用量三因素彼此之間存在比較顯著的交互作用，對(duì)復(fù)合抑菌劑抑菌率的影響顯著性依次是：脫氫乙酸鈉鹽用量>聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽用量>有機(jī)硅季銨鹽用量。