杜 戎，虞睿寧，袁 好，張倩瑤，郭亞輝, ，姚衛(wèi)蓉，錢 和

（1.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫 214122；2.桐廬縣檢驗(yàn)檢測中心，浙江杭州 311500）

食品安全是世界各國共同關(guān)注的重大公共衛(wèi)生問題，關(guān)乎人民生命健康、經(jīng)濟(jì)發(fā)展和社會(huì)穩(wěn)定。受原材料、加工技術(shù)以及生態(tài)環(huán)境的影響，食品污染物殘留問題時(shí)常發(fā)生，成為威脅人類健康的一大隱患。常見的食品污染物包括農(nóng)藥殘留、獸藥殘留、真菌毒素、有害微生物等。傳統(tǒng)的食品污染物檢測技術(shù)以儀器分析方法為主，如電化學(xué)法、光譜法、色譜法、質(zhì)譜法等[1?2]，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[3?4]、氣相色譜-質(zhì)譜法[5?6]等聯(lián)用方法在食品化學(xué)污染物的多重定量檢測中取得了重要進(jìn)展。儀器分析方法測定結(jié)果準(zhǔn)確、抗干擾能力強(qiáng)、穩(wěn)定性可靠，但也往往存在操作復(fù)雜、檢測時(shí)間長、檢測成本高、設(shè)備不便攜帶等不足，難以滿足快速、高效、廉價(jià)、便捷的現(xiàn)場檢測和批量篩選需求。免疫分析技術(shù)利用抗體與相應(yīng)抗原或半抗原之間自發(fā)的免疫學(xué)反應(yīng)實(shí)現(xiàn)對(duì)各類食品污染物的快速、準(zhǔn)確、簡便和特異性檢測，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)食品污染物檢測技術(shù)的缺陷。常見的免疫分析技術(shù)有膠體金免疫層析技術(shù)、熒光免疫分析技術(shù)、放射免疫分析技術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)和化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)等。其中，熒光免疫分析技術(shù)（fluorescence immunoassay，F(xiàn)IA）以熒光物質(zhì)標(biāo)記抗體（或抗原），基于抗原-抗體反應(yīng)，利用待測物質(zhì)在反應(yīng)體系中特異結(jié)合位點(diǎn)熒光的強(qiáng)弱，定性或定量分析以得出檢測結(jié)果，近年來憑借較高的靈敏度在生物[7]、醫(yī)藥[8]、環(huán)境[9]等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，在食品污染物檢測領(lǐng)域發(fā)展尤為迅速。

自20世紀(jì)40年代發(fā)展至今，熒光免疫分析技術(shù)正在走向成熟，標(biāo)記材料日趨豐富。Coons等于1941年首次采用熒光素標(biāo)記抗體而成功進(jìn)行了抗原定位，熒光免疫分析技術(shù)由此產(chǎn)生[10]?；跓晒夥肿泳哂幸讓?shí)現(xiàn)多次激發(fā)的特點(diǎn)，Ambrose、Mathies和Nguyen等實(shí)現(xiàn)了熒光單分子檢測[11]；1983年，Soini和Kojola等使用鑭系元素作為標(biāo)記物，建立了時(shí)間分辨熒光免疫分析技術(shù)，有效排除了樣品中的非特異熒光干擾，提高了熒光免疫分析技術(shù)的靈敏度[11]。隨著量子點(diǎn)制備技術(shù)不斷提高，其作為標(biāo)記材料用于生物學(xué)研究逐漸成為可能，陸續(xù)有研究者發(fā)表以量子點(diǎn)作為生物探針的論文，將其作為熒光標(biāo)記應(yīng)用于檢測領(lǐng)域，掀起量子點(diǎn)的研究熱潮。

隨著材料科學(xué)領(lǐng)域的不斷進(jìn)步，上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米材料、熒光蛋白和磁性熒光納米材料等新型材料也逐漸走入研究人員的視線。這些新材料、新技術(shù)的出現(xiàn)，推動(dòng)了熒光免疫分析技術(shù)更好地融合熒光材料、免疫學(xué)和儀器分析技術(shù)的發(fā)展成果，不僅靈敏度高、特異性好，還有實(shí)現(xiàn)檢測自動(dòng)化、智能化的潛力。本文綜述了熒光免疫分析技術(shù)中的3類常用熒光標(biāo)記材料和3類新型熒光標(biāo)記材料，比較了各類熒光材料的光學(xué)特性和分析性能，闡述了熒光免疫分析技術(shù)在食品污染物檢測中的研究進(jìn)展并重點(diǎn)介紹了多重定量檢測、熒光共振能量轉(zhuǎn)移及比率熒光分析等熱門技術(shù)在食品污染物檢測中的應(yīng)用，以期幫助讀者更全面地了解熒光免疫分析技術(shù)中的發(fā)展現(xiàn)狀，更深入地認(rèn)識(shí)熒光免疫分析技術(shù)在食品污染物檢測領(lǐng)域的應(yīng)用價(jià)值，為新型熒光免疫分析技術(shù)的研發(fā)和食品污染物檢測方法的構(gòu)建提供一定的理論指導(dǎo)依據(jù)。

1 常用熒光標(biāo)記材料

1.1 普通熒光染料微球

熒光素是一類能產(chǎn)生明顯熒光的有機(jī)染料，是最早應(yīng)用于免疫分析技術(shù)的熒光物質(zhì)。這類材料價(jià)格低廉，在熒光免疫分析技術(shù)中應(yīng)用非常廣泛。目前，F(xiàn)IA中使用的熒光素主要有兩類：一類可被紫外光直接激發(fā)，如異硫氰酸熒光素、四乙基羅丹明等；另一類則本身沒有熒光效應(yīng)，需要經(jīng)酶催化才能形成強(qiáng)熒光物質(zhì)，如4-甲基傘酮-β-D、4-甲基傘酮磷酸鹽和對(duì)羥基苯乙酸等[10]。任姿靜等[12]以異硫氰酸熒光素為標(biāo)記物，建立了一種高靈敏、高選擇性、低成本檢測赭曲霉毒素的新型免疫熒光分析法，在最佳實(shí)驗(yàn)條件下熒光強(qiáng)度的變化值（ΔF）與赭曲霉毒素濃度的對(duì)數(shù)在1 nmol/L～100μmol/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，檢出限為0.35 nmol/L，這在食品安全領(lǐng)域中具有潛在應(yīng)用價(jià)值。

然而，大部分熒光素穩(wěn)定性差，光照時(shí)易發(fā)生分解和光漂白，低濃度下信號(hào)微弱，高濃度下易淬滅，影響了分析結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性[13]。通過化學(xué)偶聯(lián)法、包封法、物理吸附法、共聚法和自組裝等方法[14]，將熒光素吸附或包埋于載體材料中制成納米級(jí)或微米級(jí)的熒光微球（fluorescent microspheres，F(xiàn)Ms），能有效改善其光學(xué)性質(zhì)和分析性能。熒光微球采用核殼結(jié)構(gòu)，外層載體材料主要有單體材料（如聚苯乙烯、SiO2、ZnS等）和聚合物材料（如聚乳酸微球、淀粉微球、殼聚糖微球等）[15]。熒光微球比表面積大、吸附性強(qiáng)、凝集作用大、表面反應(yīng)能力強(qiáng)，與普通熒光素相比形態(tài)結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定、發(fā)光效率更高，具有良好的單分散性、重復(fù)性和生物相容性，尤其適用于微生物、蛋白質(zhì)及生物小分子的檢測分析[14?15]。程敏等[16]采用熒光微球納米粒子作為免疫標(biāo)記物，偶聯(lián)黃曲霉毒素B1單克隆抗體制備納米探針，建立了針對(duì)決明子基質(zhì)中黃曲霉毒素B1的熒光微球免疫層析定量檢測方法。該方法的線性范圍為0.1～2.0 ng/mL，靈敏度為0.034 ng/mL，特異性良好，檢測結(jié)果與高效液相色譜法一致，可滿足對(duì)現(xiàn)場大批量決明子樣本快速定量篩查的需求。

近5年來，以熒光素為標(biāo)記材料的食品污染物檢測方法研究熱度并不高，而熒光微球的核殼式結(jié)構(gòu)作為一種穩(wěn)定、高效的結(jié)構(gòu)被多次應(yīng)用于量子點(diǎn)、時(shí)間分辨熒光材料中制成量子點(diǎn)微球、時(shí)間分辨熒光微球。同時(shí)，多色熒光微球還為食品污染物多組分分析方法開辟了新思路。Zhang等[17]首次研制了一種以雙色熒光微球?yàn)闃?biāo)記物的多重免疫分析方法，采用該方法對(duì)魚類樣品中微囊藻毒素-LR和岡田酸進(jìn)行檢測，檢測限分別為0.074和2.42μg/kg，回收率達(dá)到89%以上。檢測能在20 min內(nèi)完成，結(jié)果與高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法差異不大，為多種食品污染物的現(xiàn)場檢測提供了高效、可靠、靈敏的方法。

1.2 量子點(diǎn)

量子點(diǎn)（quantum dots，QDs）是一種納米級(jí)別的半導(dǎo)體材料，粒子半徑小于或接近激子玻爾半徑，包括由Ⅰ～Ⅵ族、Ⅲ～Ⅴ族、Ⅳ～Ⅵ族、Ⅴ～Ⅵ族元素組成的納米晶，以及金簇、銀簇、硅點(diǎn)、碳點(diǎn)、復(fù)合熒光納米粒子等[18]。單核型的QDs存在表面缺陷，通常采用Cd Se/CdS、CdSe/ZnS、CdSe/ZnSe、CdS/ZnS、CdS/HgS、CdSe/CdS/ZnS、Cd Te/ZnS等核殼體系，改善量子點(diǎn)的穩(wěn)定性和產(chǎn)率[19]。

量子點(diǎn)具有強(qiáng)而穩(wěn)定的熒光信號(hào)，對(duì)化學(xué)物質(zhì)和生理代謝降解的抵抗力很強(qiáng)，有良好的光漂白能力。其顏色也豐富多樣，通過調(diào)節(jié)量子點(diǎn)的粒徑尺寸就能得到不同的熒光顏色，用于多色標(biāo)記。在實(shí)際應(yīng)用中，為使量子點(diǎn)具有更好的生物相容性，研究者們通常進(jìn)行表面修飾，既有利于QDs與抗原或抗體的偶聯(lián)，也能降低QDs的毒性[20]。量子點(diǎn)因其獨(dú)特的光學(xué)性質(zhì)常被用作新型的熒光標(biāo)記材料，取代原有的熒光染料分子，與熒光免疫分析技術(shù)相結(jié)合，應(yīng)用于生物體內(nèi)病菌和毒素的檢測[21]。

量子點(diǎn)的多色性常用于同一體系中多種食品污染物的同時(shí)檢測，以縮短檢測時(shí)間，提高檢測效率。Duan等[22]建立了一種用3個(gè)試驗(yàn)系和1個(gè)控制系同時(shí)對(duì)玉米樣品中玉米烯酮（ZEN）、赭曲霉毒素A（OTA）和伏馬菌素B1（FB1）進(jìn)行定性檢測的多重免疫色譜法（mICA）。將CdSe/ZnS量子點(diǎn)封裝合成3個(gè)具有黃色、橙色和紅色發(fā)光特性的量子點(diǎn)納米線，與抗OTA單克隆抗體、抗FB1單克隆抗體和抗ZEN單克隆抗體偶聯(lián)，分別用于OTA、FB1和ZEN的檢測，最終得到OTA、FB1和ZEN的檢測限分別達(dá)到5、20和10 ng/mL，可用于農(nóng)產(chǎn)品中的多種霉菌毒素的檢測。廖蕓[23]基于熒光量子點(diǎn)，建立了三唑磷、對(duì)硫磷和毒死蜱農(nóng)藥多殘留熒光免疫分析方法。

多目標(biāo)物定量檢測時(shí)常常會(huì)受到目標(biāo)物濃度的干擾，以傳統(tǒng)的抗鼠IgG 抗體噴涂試紙條C線，T/C比值法進(jìn)行試紙條多重定量的準(zhǔn)確度和穩(wěn)定性差，無法滿足實(shí)際定量檢測的需求。邵艷娜[24]構(gòu)建的基于量子點(diǎn)熒光微球（QBs）免疫層析法多重定量檢測黃曲霉毒素B1、伏馬菌素B1和赭曲霉毒素A的新方法解決了這個(gè)問題，原理如圖1所示。通過引入鏈霉親和素-生物素系統(tǒng)作為一個(gè)獨(dú)立的控制線（control line，C線），消除不同批次試紙條，溫濕度、反應(yīng)時(shí)間，甚至是加樣誤差等不可控因素對(duì)試紙條免疫反應(yīng)的影響，操作也更簡單，檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

圖1 量子點(diǎn)熒光微球多重免疫層析試紙條定量檢測AFB1、FB1和OTA 的原理圖[24]Fig.1 Schematic diagram of quantitative detection of AFB1,FB1 and OTA by multiple immunochromatographic strips with quantum dot fluorescent microspheres[24]

傳統(tǒng)的競爭性酶聯(lián)免疫分析法（cFELISA）是用辣根過氧化物酶（HRP）作為競爭抗原的載體，但其靈敏度往往達(dá)不到快速檢測的標(biāo)準(zhǔn)。新型信號(hào)傳感器的應(yīng)用雖然能有效提高靈敏度，但在實(shí)際工業(yè)化操作過程中實(shí)施起來還存在很多困難。而Lu等[25]用伏馬菌素B1標(biāo)記的過氧化氫酶（CAT）替代HRP，通過降低競爭抗原與抗體的結(jié)合親和力，同時(shí)調(diào)節(jié)酶與抗原的偶聯(lián)比率，有效增強(qiáng)熒光信號(hào)強(qiáng)度，建立了一種高效靈敏檢測伏馬菌素B1的競爭熒光酶聯(lián)免疫吸附法，比傳統(tǒng)的基于HRP的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的結(jié)果低15倍。Zhou等[26]基于同樣方法，用150 nm量子點(diǎn)微珠作為競爭抗原載體，實(shí)現(xiàn)巴氏殺菌乳、酸奶和奶粉中黃曲霉毒素M1的超靈敏檢測。

近年來，量子點(diǎn)也常被用于熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)（fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET）以及比率熒光分析法中。徐威[27]將綠色量子點(diǎn)和紅色量子點(diǎn)分別與抗黃曲霉毒素B1（AFB1）偶聯(lián)，利用抗原抗體之間的特異性反應(yīng)以及FRET體系，建立了AFB1均相競爭免疫新方法，成功應(yīng)用于AFB1的定量檢測。Willard等[28]將生物素化的牛血清白蛋白（bBSA）與四甲基羅丹明標(biāo)記的鏈霉親和素特異性結(jié)合，構(gòu)建基于量子點(diǎn)的熒光共振能量轉(zhuǎn)移體系，使得四甲基羅丹明的熒光強(qiáng)度大大增強(qiáng)，提高了檢測的靈敏度?；诹孔狱c(diǎn)的FRET體系常用于比率熒光探針的制備過程。He等[29]將CQDs作為能量供體，金納米團(tuán)簇（AuNCs）作為受體，制作了一種新型的基于FRET體系的比率熒光傳感器用于檢測多巴胺含量，其檢測結(jié)果肉眼可見、準(zhǔn)確度高，同時(shí)低毒性的供體和受體有利于其在生物分析領(lǐng)域的應(yīng)用。

1.3 時(shí)間分辨熒光材料

時(shí)間分辨熒光材料一般是指鑭系稀土元素，包括銪（Eu）、鋱（Tb）、釤（Sm）和鏑（Dy）等，常用于時(shí)間分辨熒光免疫分析法（time-resolved fluoroimmunoassay，TRFIA）。鑭系稀土元素?zé)晒鈮勖^普通的熒光標(biāo)記物壽命長，且Stokes位移較大，待短壽命背景熒光消失后，測定長壽命的鑭系稀土元素螯合物熒光（如圖2）[30]，可避免背景熒光的干擾，達(dá)到定量分析的目的。

圖2 時(shí)間分辨熒光測定原理[31]Fig.2 Principle of time resolved fluorescent materials[31]

由于實(shí)現(xiàn)了特異性熒光與非特異性熒光分離，發(fā)射熒光與激發(fā)熒光分離，時(shí)間分辨熒光材料具有很高的特異性和靈敏度。較強(qiáng)的熒光性和穩(wěn)定的螯合物也使得時(shí)間分辨熒光材料的線性范圍更寬，重復(fù)性更好。同時(shí)，時(shí)間分辨熒光材料還具有高穩(wěn)定性和多標(biāo)記等優(yōu)勢[32]。因此，這種材料已廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)、生物學(xué)、化學(xué)等各領(lǐng)域。但由于鑭系稀土元素在標(biāo)記過程中的繁瑣操作以及螯合劑的使用，時(shí)間分辨熒光材料的處理過程相比于普通熒光材料更為復(fù)雜。

目前最常見的抗原或抗體標(biāo)記物是銪和釤，且廣泛應(yīng)用于多組分檢測或多標(biāo)記檢測中。而將鋱和鏑作為標(biāo)記物的檢測方法相對(duì)較少，目前處于研究階段。朱建國[33]將抗玉米赤霉烯酮毒素（ZEA）、抗黃曲霉毒素B1（AFB1）和抗百菌清（CTN）3種高特異性單克隆抗體與銪微球偶聯(lián)制備免疫熒光探針，通過優(yōu)化抗體標(biāo)記濃度、熒光探針用量、免疫試劑用量、免疫層析條件等，建立了一種能同時(shí)檢測真菌毒素和農(nóng)藥殘留的時(shí)間分辨免疫熒光層析方法，ZEA、AFB1和CTN的檢出限分別為0.043、0.011和0.084 μg/kg，在做到省時(shí)省試劑的同時(shí)，保證了準(zhǔn)確度和穩(wěn)定性，具有良好的市場應(yīng)用價(jià)值。多標(biāo)記檢測已成為現(xiàn)有檢測技術(shù)發(fā)展的一種趨勢，可用于多種分子的篩查實(shí)驗(yàn)和貴重樣品的檢測。利用不同鑭系金屬離子熒光波長和熒光衰變時(shí)間的差異，通過TRFIA法進(jìn)行測量達(dá)到目的。雙標(biāo)記 TRFIA具有同時(shí)檢測兩種物質(zhì)且無互相干擾的特點(diǎn)，省時(shí)、省力和省試劑，在獸藥和農(nóng)藥殘留中得到廣泛應(yīng)用，最常用的兩對(duì)鑭系金屬離子分別是Eu3+和Sm3+，Eu3+和Tb3+。Bacigalupo等[34]以銪（Eu3+）和鋱（Tb3+）為熒光標(biāo)記物，建立了一種檢測氫化可的松和鹽酸克倫特羅的雙標(biāo)記時(shí)間分辨熒光免疫分析法，并成功應(yīng)用于食品檢測中。Sheng等[35]以銪（Eu3+）和釤（Sm3+）為熒光標(biāo)記物，檢測食品中的噻蟲胺和烯唑醇，在優(yōu)化的檢測條件下，噻蟲胺的最大半抑制濃度（IC50）和檢出限（LOD，IC10）分別為5.08和0.021μg/L，烯唑醇為13.14和0.029μg/L，具有較高的靈敏度。

時(shí)間分辨熒光材料具有靈敏度高、穩(wěn)定性好、檢測范圍廣等優(yōu)勢。其中，靈敏度高最為顯著。許多研究表明，時(shí)間分辨熒光材料檢測的靈敏度和準(zhǔn)確度一般高于酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）和傳統(tǒng)的液相色譜法。Zhou等[36]采用間接TRFIA法定量檢測恩諾沙星，發(fā)現(xiàn)其靈敏度顯著高于酶聯(lián)免疫吸附法、液相色譜法。時(shí)間分辨熒光材料通常依托鑭系金屬螯合物進(jìn)行檢測，但螯合物的發(fā)光信號(hào)很容易受到各種猝滅劑的影響，其使用會(huì)受到各種限制，靈敏度也會(huì)隨之降低。為克服這一缺點(diǎn)，通常用納米顆粒包裹鑭系金屬螯合物，避免外界干擾，同時(shí)采用生物素－鏈霉親和素放大系統(tǒng)，可大大提高靈敏度，原理如圖3所示。Tang等[37]在檢測炭疽病毒保護(hù)性抗原（PA）時(shí)，采用銪納米技術(shù)捕捉樣品中的炭疽PA，并結(jié)合生物素-鏈霉親和素放大系統(tǒng)，將靈敏度提升為酶聯(lián)免疫吸附法的100倍。

圖3 基于納米顆粒的TRFIA測定原理[38]Fig.3 Determination principle of TRFIA based on nanoparticles[38]

近年來，時(shí)間分辨熒光材料在熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)以及比率熒光分析法中的應(yīng)用成為一種發(fā)展趨勢。鑭系稀土元素?zé)晒鈽?biāo)記物壽命長、Stokes位移較大的優(yōu)勢彌補(bǔ)了FRET供受體熒光相互干擾的不足。以磷酸三丁酯（TBP）-Eu3+和別藻藍(lán)蛋白（APC）為標(biāo)記物建立的熒光共振能量轉(zhuǎn)移TRFIA是目前成功的均相分析體系之一。Hepojoki等[39]利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移TRFIA技術(shù)檢測漢坦病毒，發(fā)現(xiàn)這種新型結(jié)合技術(shù)在病毒研究方面有很大的應(yīng)用價(jià)值。楊偉強(qiáng)等[40]基于四環(huán)素對(duì)碳點(diǎn)和銪（Eu3+）的不同影響，建立了一種肉眼可辨的比率熒光分析法檢測四環(huán)素殘余量，操作方便，靈敏度高。

展望現(xiàn)有技術(shù)，時(shí)間分辨熒光材料具有廣闊的發(fā)展前景和上升空間，一方面需要在原有基礎(chǔ)上進(jìn)一步提高檢測靈敏度，另一方面需要結(jié)合熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)、比率熒光分析法等進(jìn)一步深入發(fā)展。

2 新型熒光標(biāo)記材料

2.1 上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米材料

上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米材料（upconverting nanoparticles，UCNPs）是一種能夠接收低能量激發(fā)光并將其轉(zhuǎn)換成高能量發(fā)射光的新型熒光探針材料。上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米材料采用近紅外作為激發(fā)光源，具有發(fā)射光譜特性突出、熒光量子產(chǎn)生率高、反斯托克位移大、熒光壽命長等特點(diǎn)。相對(duì)于傳統(tǒng)以有機(jī)染料和半導(dǎo)體量子點(diǎn)為代表的下轉(zhuǎn)換發(fā)光材料，上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料毒性較低，能在提高對(duì)生物組織的穿透深度同時(shí)減少長時(shí)間照射引起的傷害，消除來自內(nèi)源性熒光物質(zhì)和同時(shí)標(biāo)記熒光染料的背景熒光干擾，具有較高的靈敏度和選擇性[41]?；赨CNPs的上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米技術(shù)（upconversion fluorescence nanoparticles technology，UPNT）能解決食品污染物傳統(tǒng)檢測方法中樣品前處理程序復(fù)雜等問題，快速有效地對(duì)一些食品污染物進(jìn)行檢測[42]。

上轉(zhuǎn)換發(fā)光具有多種發(fā)光體系，而稀土摻雜（rare-earthdoped，RED）體系是目前效率最高、應(yīng)用最多的上轉(zhuǎn)換發(fā)光體系。稀土摻雜上轉(zhuǎn)換納米粒子具有特殊的頻率上轉(zhuǎn)換能力，主要利用鑭系稀土離子（如Yb3+和Er3+）之間的能量轉(zhuǎn)移來實(shí)現(xiàn)長波長激發(fā)光到短波長發(fā)射光的轉(zhuǎn)換，與其他上轉(zhuǎn)換納米材料相比靈敏度更高。Sheng等[43]結(jié)合磁性分離技術(shù)建立了阿特拉津的高靈敏度熒光免疫分析方法。如圖4所示，該方法以親水性NaYF4:Yb/Er UCNPs與抗阿特拉津抗體結(jié)合作為信號(hào)探針，聚苯乙烯磁性微球與包被抗原結(jié)合作為捕獲探針，可用于玉米、大米和甘蔗汁基質(zhì)中阿特拉津的定量檢測，在玉米和大米樣品中的檢測限為20 ng/kg，在甘蔗汁樣品中檢測限為2 ng/L。該方法也能識(shí)別丙嗪和異丙嗪，因此可用于對(duì)三種除草劑的同時(shí)檢測。

圖4 探針的制備過程和使用競爭模型的熒光免疫分析方法的檢測原理[43]Fig.4 Preparation process of the probes and test principle of the fluorescence immunoassay using a competitive format[43]

上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米材料的激發(fā)和發(fā)射光譜較窄，憑借自身優(yōu)異的光化特性成為FRET的理想能量供體。張瑩瑩等[44]通過上轉(zhuǎn)換熒光納米材料與金納米粒子之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移建立了赭曲霉毒素A（OTA）適配體傳感器，實(shí)現(xiàn)對(duì)OTA的定量檢測。將UCNPs及AuNPs分別修飾OTA適配體和互補(bǔ)鏈制成能量供體探針及受體探針，在最優(yōu)條件下檢測范圍為0.001～10 ng/mL，檢出限可達(dá)0.001 ng/mL。特異性研究及加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)證明，該方法可用于實(shí)際樣品檢測，具有靈敏度高、特異性好、操作簡單、成本低的優(yōu)點(diǎn)。

上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米材料制備成本較高，且本身不具有親水鍵和活性基團(tuán)，在應(yīng)用過程中必須進(jìn)行表面修飾[45]或合成水溶性稀土化合物[46]。作為一類新型熒光標(biāo)記材料，上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米材料尚存在巨大的發(fā)展空間?；谏限D(zhuǎn)換發(fā)光熒光免疫分析技術(shù)的食品污染物檢測方法在發(fā)射光的可調(diào)節(jié)性方面已取得了近紅外區(qū)激發(fā)-可見光區(qū)發(fā)射、近紅外區(qū)激發(fā)-近紅外區(qū)發(fā)射等成果，但仍具有極大的開發(fā)潛力。已有研究通過改變鑭系摻雜劑改變上轉(zhuǎn)換納米探針的光學(xué)性質(zhì)并實(shí)現(xiàn)了雙色上轉(zhuǎn)換納米探針的制備[47]，但雙色探針仍不能滿足多組分分析對(duì)檢測效率的需求，需對(duì)多色上轉(zhuǎn)換納米探針的研發(fā)和應(yīng)用予以更多關(guān)注。

2.2 磁性熒光納米材料

磁性納米顆粒（magnetic nanoparticles，MNPs）具有快速磁響應(yīng)性，可用于復(fù)雜基質(zhì)的樣品前處理中，以實(shí)現(xiàn)對(duì)待測物的高效分離和富集[48?50]。磁性熒光納米材料是一種雙功能復(fù)合納米材料，常采用穩(wěn)定的核殼式結(jié)構(gòu)，以Fe3O4等磁性材料為內(nèi)核，SiO2、C、TiO2等無機(jī)材料為夾層，在其內(nèi)部或表面吸附有熒光素、量子點(diǎn)等熒光材料后經(jīng)表面修飾制成。這類復(fù)合材料實(shí)現(xiàn)了免疫磁分離和熒光免疫分析兩個(gè)過程的合并，大大簡化了檢測過程，有望解決一些熒光標(biāo)記物在標(biāo)記后難以分離的問題，提高檢測的準(zhǔn)確性，在食品污染物的免疫分析中具有潛在應(yīng)用價(jià)值[51]。Huang等[52]以熒光磁性納米管為標(biāo)記物，建立了豬尿基質(zhì)中克倫特羅的磁性熒光免疫分析方法（如圖5），其定量檢測的范圍為0.25～5 ng/mL，在磷酸鹽緩沖鹽和豬尿樣品中具有相似的檢測限，分別為0.22和0.16 ng/mL，靈敏度比傳統(tǒng)的膠體金試紙條高4倍。該方法的檢測結(jié)果與液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法高度相關(guān)，與其他8種高濃度β-腎上腺素受體激動(dòng)劑區(qū)分時(shí)也表現(xiàn)出了很強(qiáng)的特異性，可應(yīng)用于其它的β-腎上腺素激動(dòng)劑殘留的檢測。

圖5 IMS–FLFIA的步驟示意圖[52]Fig.5 Schematic illustration of the IMS–FLFIA process[52]

然而，磁性材料在提供磁性的同時(shí)會(huì)引起熒光猝滅，夾層材料的引入能在一定程度上降低影響，但也帶來了粒徑增加和磁響應(yīng)性降低的問題，仍需尋找最佳的材料組合及組裝方式，在引入其他性能的同時(shí)實(shí)現(xiàn)對(duì)原有性能的保持或增強(qiáng)[53]。Fe3O4應(yīng)用于熒光磁性納米材料時(shí)，其內(nèi)部過濾效應(yīng)也可能會(huì)對(duì)檢測產(chǎn)生干擾。Huang等[54]在磁珠表面共價(jià)偶聯(lián)量子點(diǎn)制成磁性熒光納米微球，構(gòu)建了檢測E.coliO157:H7的熒光免疫分析方法，通過控制微球和單克隆抗體的濃度獲得最大的發(fā)光強(qiáng)度，有效減弱了材料的內(nèi)部過濾效應(yīng)，在試紙條上檢測限達(dá)到2.39×102CFU/mL。作為一種新型復(fù)合材料，磁性熒光納米材料在材料組合、組裝方式、表面修飾等方面仍需進(jìn)一步的研究，以改善其分析性能、簡化其制備工藝、降低其使用成本，真正運(yùn)用于實(shí)際監(jiān)管與篩查工作中。

2.3 熒光蛋白標(biāo)記材料

熒光蛋白最初來源于自然界，天然無毒，主要分為綠色熒光蛋白、黃色熒光蛋白和紅色熒光蛋白3種類型[55]。熒光蛋白是一種新型熒光標(biāo)記物，克服了傳統(tǒng)熒光標(biāo)記物熒光背景高、易猝滅等缺點(diǎn)，不易受生物樣品自身熒光干擾，量子產(chǎn)率高，吸收帶譜寬，幾乎覆蓋所有可見光范圍，提高了熒光蛋白標(biāo)記選擇的靈活性，目前已廣泛應(yīng)用于免疫分析檢測領(lǐng)域[56]。

熒光蛋白與量子點(diǎn)等傳統(tǒng)熒光材料不同，它不需要任何化學(xué)修飾，簡化檢測步驟，更方便迅速。Riikka等[57]將伏馬菌素模擬體克隆為一種黃色熒光蛋白的融合蛋白，無需標(biāo)記或二次抗體，可直接作為FB1檢測的示蹤劑，再結(jié)合AuNPs的熒光猝滅能力，可在一個(gè)步驟中進(jìn)行均相免疫分析。得到FB1動(dòng)態(tài)范圍為7.3～22.6 ng/mL，檢測限為1.1 ng/mL，IC50值為12.9 ng/mL，靈敏度較高，可用于檢測食品中霉菌毒素。王盛等[56]制備了一種檢測植物病毒煙草花葉病毒（tobacco mosaic virus，TMV）的藻紅蛋白免疫熒光探針，其中應(yīng)用的蛋白質(zhì)交聯(lián)技術(shù)是藻膽蛋白熒光探針研制和應(yīng)用的關(guān)鍵。如圖6，通過利用雙功能試劑SPDP在蛋白質(zhì)分子中引入巰基，結(jié)合2-巰醇吡啶分析方法，定量測定引入活性基團(tuán)比例，制得珊瑚藻R-藻紅蛋白（r-phycoerythrin,R-PE），再用珊瑚藻R-藻紅蛋白標(biāo)記羊抗兔抗體，以硝酸纖維素膜為固相載體，用于煙草花葉病毒的檢測。

圖6 交聯(lián)反應(yīng)流程[56]Fig.6 Crosslinking reaction process[56]

雖然熒光蛋白標(biāo)記讓免疫檢測過程更便捷經(jīng)濟(jì)，但其靈敏度低的問題也不容小覷。以生物素偶聯(lián)抗體或抗原，以親合素標(biāo)記示蹤物，是免疫反應(yīng)中通用的放大手段。為提高藻膽蛋白免疫熒光法檢測的靈敏度，吳萍等[58]引入橋式親合素-生物素系統(tǒng)（BRAB），通過將ELISA法與藻膽蛋白免疫熒光直接法、橋式BAS法相結(jié)合，利用橋式BAS的二級(jí)信號(hào)放大作用，最終得到血清中HBsAg的檢測率提高了1.5倍。當(dāng)然，除了該方法之外，對(duì)反應(yīng)條件的優(yōu)化或是以惰性材料微球替代NC膜為固相載體進(jìn)行富集反應(yīng)，又或是采用雙抗體夾心法等也是提高檢測靈敏度的途徑[56]，還需進(jìn)行進(jìn)一步研究。

3 前景與展望

食品污染物中，除了常見的農(nóng)藥、獸藥、真菌毒素、有害微生物等，更多新型污染物也在不斷產(chǎn)生。為對(duì)食品污染物進(jìn)行快速、定量的低成本、大批量篩查，基于免疫分析技術(shù)建立了許多食品污染物的檢測方法。其中，膠體金免疫層析法發(fā)展較為成熟，但存在靈敏度不足、難以定量等問題。熒光免疫分析技術(shù)的高靈敏度很好地彌補(bǔ)了這些不足，符合免疫分析技術(shù)定量、快速、智能化的發(fā)展趨勢。熒光素是最先應(yīng)用于熒光免疫分析技術(shù)的標(biāo)記材料，但其穩(wěn)定性和信號(hào)強(qiáng)度未能令人滿意。以特定載體材料將熒光素包裹成熒光微球是提高其穩(wěn)定性和信號(hào)強(qiáng)度的一種解決方案；量子點(diǎn)、時(shí)間分辨熒光微球等標(biāo)記材料的引入也改善了熒光免疫分析技術(shù)的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性。量子點(diǎn)熒光信號(hào)強(qiáng)而穩(wěn)定，可實(shí)現(xiàn)多色標(biāo)記；時(shí)間分辨熒光微球熒光壽命長，靈敏度高。上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米材料、磁性熒光納米材料、熒光蛋白等新型標(biāo)記物功能性較強(qiáng)，但其在成本、成熟性方面有待改善?；跓晒饷庖叻治黾夹g(shù)的食品污染物檢測方法，其主要發(fā)展方向如下：

一是多重定量檢測。在實(shí)際檢測中，多種污染物往往同時(shí)存在于一種食品中（如多種真菌毒素同時(shí)存在于糧食中），需要進(jìn)行多組分同時(shí)分析以提高效率。多色熒光微球和彩色量子點(diǎn)在多組分分析方面具有顯著優(yōu)勢，以其作為標(biāo)記物建立對(duì)特定食品基質(zhì)的多組分分析檢測方法是一大發(fā)展趨勢。

二是新型標(biāo)記材料的研發(fā)。研發(fā)新型標(biāo)記材料是提高檢測結(jié)果準(zhǔn)確性，實(shí)現(xiàn)定量、半定量分析的重要途徑。現(xiàn)有的新型標(biāo)記材料往往成本較高，難以在現(xiàn)實(shí)檢測場景中得到廣泛應(yīng)用，需要對(duì)其制備方法進(jìn)行改良以降低成本；結(jié)合其他材料的特性，研制多功能復(fù)合材料也是新型標(biāo)記物研發(fā)的重要方向，如磁性熒光材料將免疫磁分離與熒光免疫分析兩個(gè)步驟結(jié)合在一起，在提升檢測效果的同時(shí)大大簡化了檢測過程。

三是改善檢測環(huán)境和預(yù)處理方法。食品基質(zhì)成分較為復(fù)雜，對(duì)熒光免疫分析造成了一定的干擾。改善檢測環(huán)境可以在一定程度上減弱基質(zhì)帶來的干擾、提高檢測結(jié)果準(zhǔn)確性；改良樣品預(yù)處理方法還可以使整個(gè)檢測過程更加便捷。

四是便攜式讀取儀器的研發(fā)和檢測方法智能化。多數(shù)商品化的熒光讀取儀器較為笨重，對(duì)操作者專業(yè)知識(shí)也有一定要求，并不適合現(xiàn)場篩查。進(jìn)入信息化時(shí)代，不僅要實(shí)現(xiàn)讀取儀器便攜化，還要實(shí)現(xiàn)檢測過程自動(dòng)化和檢測方法智能化。將熒光免疫分析技術(shù)更好地與信息技術(shù)結(jié)合起來，可以為食品污染物的日常篩查提供更有力的技術(shù)支持。