陳榮珠 賴鐘雄

(1漳州衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院藥學(xué)系福建漳州 363000;2福建農(nóng)林大學(xué)園藝植物生物工程研究所福建福州 350002)

DNA甲基化在真核基因組中作為一種常見的表觀遺傳修飾，具有調(diào)控特定基因表達的功能，其過程以S-腺苷蛋氨酸（SAM）作為甲基的供體，在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的作用下，將甲基轉(zhuǎn)移到胞嘧啶第5位碳原子上，使之變?yōu)?-甲基胞嘧啶（5-mC）［1］。在植物中，DNA甲基化被分為三種序列，分別是CG、CHG和CHH（H代表A、T或C），它們通過不同的酶來維持［2-3］。在擬南芥的研究中發(fā)現(xiàn)，CG、CHG和CHH分別需要甲基轉(zhuǎn)移酶1（METHYLTRANS‐FERASE1，MET1）、CHROMOMETHYLASE3（CMT3）和CMT2來維 持［4-6］。RNA介導(dǎo) 的DNA甲 基化（RdDM）途徑能使以上3種序列的DNA甲基化，其活性與轉(zhuǎn)座子、重復(fù)序列以及某些基因被抑制有關(guān)［7］。經(jīng)典的RdDM途徑始于植物特異性RNA聚合酶Pol IV產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄本［8］，這些轉(zhuǎn)錄本由RNA依賴的RNA聚合酶2（RDR2）被轉(zhuǎn)化為雙鏈RNA［9］，然后在DIC‐ER-LIKE3（DCL3）酶的作用下被切割成24 nt的干擾小RNA（siRNA）［10］。最后，這些24 nt的siRNAs被裝載到ARGONAUTE4（AGO4）中［11］，并招募從頭甲基轉(zhuǎn)移酶（DOMAINS REARRANGED METHYLTRANS‐FERASE2，DRM2），從而使靶向區(qū)域甲基化［12-13］。5-氮胞苷（5-azacytidine，5-azac）是DNA甲基化抑制劑，為核苷類似物，能夠選擇性地使某些基因被激活，從而使一些真核細胞的分化狀態(tài)得到改變。DNA甲基化可以影響植株的生長發(fā)育，用5-azac處理甘藍幼苗、水稻種子和麻風(fēng)樹，其DNA甲基化水平降低，葉片顯著變小、植株出現(xiàn)矮化［14-16］。5-azac處理對植物的開花也具有一定的影響，一定濃度的5-azac處理亞麻種子［17］、擬南芥［18］、菊花［19］、杜鵑［20］和花椰菜［21］等均能降低DNA甲基化水平，促使它們提前開花，推測DNA甲基化水平的改變，能使開花相關(guān)基因的啟動子DNA去甲基化，活化基因表達，從而使植物開花的時間提前。DNA甲基化水平也能影響果實的成熟時間和果皮的顏色，用不同濃度的5-azac噴施巨峰葡萄［22］、番茄果實［23］和草莓［24］等均能促進果實提前成熟。同樣，在植物體胚發(fā)生過程中，伴隨著DNA甲基化/去甲基化的動態(tài)平衡，一定程度的DNA甲基化水平對植物體胚的正常發(fā)育具有非常重要的作用。von Aderkas等［25］認為，植物體胚發(fā)生受到DNA甲基化調(diào)控，球形胚階段DNA甲基化水平降低，但在魚雷形胚階段急劇上升，說明體胚發(fā)生過程伴隨著DNA甲基化水平的變化。郝玉金等［26］研究發(fā)現(xiàn)，柑橘具有體胚發(fā)生能力的愈傷組織比非體胚發(fā)生能力的愈傷組織的DNA甲基化水平更低，說明胚性愈傷組織通過DNA去甲基化致使部分基因選擇性表達。Chakrabarty等［27］發(fā)現(xiàn)，刺五加種胚性愈傷組織與非胚性愈傷組織相比，具有較低的甲基化水平，胚性愈傷組織具有發(fā)育成再生苗的能力，而非胚性愈傷組織卻沒有，說明較低水平的甲基化的愈傷組織有利于胚胎的發(fā)生。巴西橡膠樹體細胞胚發(fā)生過程中不同體胚階段，其DNA甲基化程度不同［28］。SANTOS等［29］分析了DNA甲基化對擬南芥體胚發(fā)生（SE）的影響，SE過程中整體DNA甲基化水平降低，用5-azac處理后SE反應(yīng)能力降低。

龍眼（Dimocarpus longanLour.）屬于無患子科龍眼屬熱帶或亞熱帶的常綠木本果樹，其果肉富含豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，是我國南方名貴的珍品，歷來就有“南桂圓北人參”的說法。本課題組研究發(fā)現(xiàn)，龍眼體胚發(fā)生伴隨著DNA甲基化水平的變化，參與RNA介導(dǎo)的DNA甲基化途徑中的DlAGO4、DlDCL4和甲基轉(zhuǎn)移酶DlDRM1均影響龍眼早期體胚的發(fā)生［30-32］。但是，5-azac與2，4-D處理對植物體胚發(fā)生的影響目前報道還比較少。因此，本研究以龍眼胚性愈傷組織為材料，用不同濃度的5-azac和2，4-D進行處理，觀察其對龍眼早期體胚發(fā)生的影響，并利用RT-qPCR檢測DlAGOs的表達水平，為揭示龍眼體胚發(fā)生過程的DNA甲基化作用機制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

福建農(nóng)林大學(xué)園藝植物生物工程研究所長期繼代培養(yǎng)的龍眼松散型胚性愈傷組織（紅核子品種LC2細胞系），試驗儀器為LightCycler480 Re‐al-time PCR儀。

1.2 方法

1.2.1 不同濃度5-氮胞苷配置

5-azac購自sigma公司，稱取0.1 g的5-azac用無菌水進行溶解，定容至終濃度為100 mmol/L，在無菌操凈工作臺中對其進行抽濾滅菌，并分別稀釋成5、25、50μmol/L，最后加入到已高壓滅菌的MS＋2，4-D（0.1、0.5 mg/L）固體培養(yǎng)基中置于無菌培養(yǎng)室中備用。

1.2.2 材料處理

稱取約0.15 g生長狀態(tài)良好的龍眼胚性愈傷組織置于不同濃度5-azac（0、5、25、50μmol/L）的MS＋2，4-D（0.1、0.5 mg/L）的培養(yǎng)皿中，暗培養(yǎng)18 d。以上每種處理3次重復(fù)。

1.2.3 龍眼早期體胚形態(tài)觀察

用OLYMPUS倒置熒光顯微鏡觀察不同處理龍眼早期體胚的形態(tài)。

1.2.4 總RNA的提取和cDNA逆轉(zhuǎn)錄

總RNA的提取及實時熒光定量PCR（RT-qPCR）所用cDNA的逆轉(zhuǎn)錄分別用Tripue（Transgen，China）和PrimerScript RT Reagent Kit（Takara）試劑盒進行。

1.2.5DlAGOs實時熒光定量PCR

以龍眼DlFeSOD作為內(nèi)參基因，依據(jù)RT-qPCR引物設(shè)計的原則，用DNAMAN 6.0軟件進行DlAGOs家族引物的設(shè)計（表1）。RT-qPCR反應(yīng)體系參照SYBR Premix Ex Taq II（TAKARA）試劑盒使用說明書，SYBR Premix Ex Taq II 10μL，上下游引物（10μmol/L）各0.8μL，cDNA 1.0μL，用ddH2O補足20.0μL。

RT-qPCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，58～61℃退火30 s，72℃延伸10 s，共進行40個循環(huán)，通過分析溶解曲線來確定擴增反應(yīng)的特異性。為了減少誤差，所有樣品均做3次重復(fù)，將Ct值用內(nèi)參基因校正后，用2-ΔΔCt法計算，獲得每個基因的相對表達量。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)分析用Excel和SPSS，繪圖用GraphPad Prism進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 5-azac與2，4-D處理對龍眼早期體胚發(fā)生的影響

利用顯微鏡觀察不同濃度5-azac與0.1 mg/L 2，4-D處理對龍眼早期體胚發(fā)生的影響，結(jié)果如圖1所示，對照組（圖1-a）、5-azac濃度為5μmol/L（圖1-b）和25μmol/L（圖1-c）處理組均出現(xiàn)了球形胚。進一步觀察發(fā)現(xiàn)，當(dāng)培養(yǎng)基中5-azac濃度為25μmol/L比添加5μmol/L和對照組中球形胚更典型、數(shù)量更多，而5-azac濃度為50μmol/L的處理組中未形成球形胚（圖1-d）。

圖1 不同濃度5-azac和2，4-D 0.1 mg/L處理對龍眼早期體胚發(fā)生的影響

顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，不同濃度5-azac與0.5 mg/L 2，4-D配合使用影響了龍眼早期體胚的發(fā)生（圖2），只有5-azac濃度為5μmol/L的處理組可以觀察到球形胚的產(chǎn)生（圖2-b），而對照組（圖2-a）和其它處理組均沒有球形胚產(chǎn)生。而5-azac濃度為25和50μmol/L的處理組中龍眼胚性愈傷組織（圖2-c、2-d）與對照組相比顯得更松散。

2.2 5-azac和2，4-D處理對DlAGOs表達的影響

為了進一步分析不同濃度5-azac和2，4-D處理對DlAGOs相對表達量的影響，利用RT-qPCR技術(shù)進行檢測。不同濃度5-azac與0.1 mg/L 2，4-D配合使用對DlAGOs表達的影響，如圖3所示。不同濃度5-azac與0.1 mg/L 2，4-D配合使用與對照組相比，能降低DlAGO1、DlAGO2、DlAGO7和DlAGOMEL1的表達水平。DlAGO5、DlAGO6和DlAGO10的相對表達量先下降后上升，當(dāng)5-azac濃度為50μmol/L時有最高的相對表達量，高于對照組。DlAGO4基因的相對表達量呈先上升后下降趨勢，且在5-azac濃度為25μmol/L時有最高的表達量。

DlAGOs在不同濃度5-azac與2，4-D 0.5 mg/L處理下的表達模式如圖4所示。5μmol/L 5-azac與0.5 mg/L 2，4-D配合使用能顯著降低DlAGO1、DlAGO5、DlAGO6和DlAGOMEL1基因的相對表達量，當(dāng)5-azac濃度提高到25和50μmol/L時，這些基因的相對表達量顯著升高。不同濃度5-azac與0.5 mg/L 2，4-D配合使用能顯著提高DlAGO2和DlAGO4的相對表達量，當(dāng)5-azac濃度為5時，DlAGO4有最高的相對表達量，結(jié)合顯微觀察到的球形胚結(jié)構(gòu)，推測該基因在龍眼球形胚的形成中發(fā)揮著重要的作用；5μmol/L 5-azac與0.5 mg/L 2，4-D配合使用能顯著提高DlAGO7的相對表達量，增加5-azac的濃度反而顯著降低該基因的相對表達量。

圖2 不同濃度5-azac和2，4-D 0.5 mg/L處理對龍眼早期體胚發(fā)生的影響

圖3 不同濃度5-azac和2，4-D 0.1 mg/L處理下DlAGOs的表達模式分析

綜上所述，本研究推測DlAGOs基因家族成員能夠響應(yīng)5-azac與2，4-D的處理，但是不同的成員有不同響應(yīng)模式，5-azac能降低龍眼胚性愈傷組織的DNA甲基化水平，2，4-D能增加其DNA甲基化水平，當(dāng)2，4-D濃度較低時，一定濃度的5-azac能促進龍眼球形胚的產(chǎn)生，結(jié)合顯微觀察及相對表達量的結(jié)果可知，DlAGO4在龍眼球形胚的形成中發(fā)揮著重要的作用。

3 討論與結(jié)論

3.1 5-azac通過降低龍眼胚性愈傷組織的甲基化水平而促進龍眼早期體胚的形成

圖4 不同濃度5-azac和2，4-D 0.5 mg/L處理下DlAGOs的表達模式分析

DNA甲基化是迄今為止研究最廣泛的表觀遺傳學(xué)內(nèi)容之一，在所有植物中都發(fā)現(xiàn)有DNA甲基化現(xiàn)象存在。DNA甲基化水平對于維持正常的細胞功能和胚胎發(fā)育具有重要的作用。5-azac是常用的甲基化抑制劑，一定濃度可以促進細胞的生長，但是高濃度卻會對細胞造成毒害作用。李順福［33］在研究山核桃幼胚不同發(fā)育時期的DNA甲基化水平和模式時發(fā)現(xiàn)，不同發(fā)育時期DNA甲基化水平不一樣、DNA甲基化類型也有所不同；對南瓜體細胞胚胎發(fā)生過程中DNA甲基化的變化進行研究發(fā)現(xiàn)，在體胚成熟階段DNA甲基化水平是下降［34］。

5-azac已經(jīng)在一些植物體胚形成過程中被使用，能夠降低植物的DNA甲基化水平，從而促進植物體胚的形成。在海岸松（Pinus pinaster）體胚形成的過程中發(fā)現(xiàn)，體胚形成的數(shù)量與5-azac的濃度和處理的時間有關(guān)，當(dāng)5-azac的濃度為10和15μmol/L時，體胚形成率最高［35］。歐洲的油菜（Brassica napus）和大麥（Hordeum vulgare）體胚誘導(dǎo)過程中發(fā)現(xiàn)，用2.5μmol/L 5-azac處理4d能顯著提高體胚的誘導(dǎo)率［36］。對可可體胚發(fā)生潛能與基因組甲基化水平的關(guān)系進行分析，結(jié)果表明基因組甲基化水平隨著繼代時間的延長而升高，當(dāng)可可體胚中基因組甲基化水平較高時，其誘導(dǎo)胚胎發(fā)生的能力降低，當(dāng)使用5-azac處理后誘導(dǎo)效果明顯增強［37］。Xu等［38］以柑橘愈傷組織為材料，設(shè)置不添加5-azac、添加5-azac和處理恢復(fù)組，通過分析發(fā)現(xiàn)，DNA甲基化抑制劑5-azac造成全基因組的去甲基化效應(yīng)；呂曉婷等［39］在蘋果愈傷組織形成過程中DNA甲基化的研究中發(fā)現(xiàn)，低濃度的5-azac對蘋果愈傷的形成沒有顯著的影響，100μmol/L 5-azac濃度處理后蘋果愈傷組織提前3 d形成，高濃度的5-azac濃度處理后外植體干枯死亡；Santos等［29］分析5-azac與蒺藜苜蓿體細胞胚胎發(fā)生DNA甲基化水平的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)100μmol/L的5-azac能抑制體細胞胚胎發(fā)生，說明體細胞胚胎發(fā)生需要一定水平的DNA甲基化。本實驗室前期的研究發(fā)現(xiàn)，采用0.1 mg/L 2，4-D黑暗處理20 d，龍眼胚性愈傷組織能發(fā)育形成球形胚。而本研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度5-azac與0.1 mg/L 2，4-D黑暗處理18 d，與對照組相比隨著5-azac濃度的增加，龍眼球形胚更典型，數(shù)量更多，且當(dāng)5-azac濃度為25μmol/L時球形胚最典型、數(shù)量最多，繼續(xù)增加5-azac的濃度，未產(chǎn)生球形胚，但當(dāng)5-azac濃度為25μmol/L時，顯著提高DlAGO4的相對表達量；不同濃度的5-azac與0.5 mg/L 2，4-D黑暗處理18 d，只 有5-azac的濃度為5μmol/L處理組中有球形胚產(chǎn)生，在此處理下DlAGO4的相對表達量顯著上升。因此，龍眼球形胚的產(chǎn)生是一個DNA甲基化水平降低的過程，DlAGO4在龍眼球形胚產(chǎn)生過程中發(fā)揮了重要的作用。

3.2 5-azac抑制2，4-D的作用，促進龍眼早期體胚的發(fā)生

植物激素，特別是2，4-D，通過S-腺苷甲硫胺酸（SAM）或S-腺苷半胱胺酸（SAH）的積累或消失來改變植物全基因組的甲基化水平，2，4-D能夠提高基因組的甲基化水平，而5-azac為甲基化抑制劑，因此，二者具有拮抗的關(guān)系［40-41］。在胡蘿卜體胚發(fā)生的過程中用20.5μmol/L 5-azac和4.52 mmol/L 2，4-D處理24 h培養(yǎng)14 d，其體胚發(fā)生率與添加4.52 mmol/L 2，4-D一樣，但是如果只用20.5μmol/L 5-azac處理24 h，培養(yǎng)3 d后發(fā)現(xiàn)其體胚的形成受到了嚴重的影響［42］。在南瓜（Cu‐curbita pepo）體胚發(fā)生過程中添加12.3μmol/L 5-azac和一定濃度的2，4-D，胚胎早期細胞系的DNA甲基化水平降低而原胚細胞系的甲基化水平并沒有降低［34］。因此，在添加5-azac和2，4-D的MS培養(yǎng)基中，與在相同培養(yǎng)基中添加5-azac相比，不同階段的胚胎比例沒有發(fā)生顯著變化。但是，用200μmol/L 2，4-D和50μmol/L 5-azac處理斐濟果（Acca sellowiana）胚性愈傷組織，發(fā)現(xiàn)2，4-D和5-azac配合使用能降低體胚的全基因組甲基化水平，提高體胚的誘導(dǎo)［43］，因此，2，4-D與5-azac對不同植物體胚發(fā)生的作用具有異同性。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，在MS培養(yǎng)基和添加0.1 mg/L 2，4-D的MS培養(yǎng)基中均能誘導(dǎo)球形胚的產(chǎn)生，只是誘導(dǎo)天數(shù)不一樣，前者需要12 d，后者需要20 d。本研究發(fā)現(xiàn)，一定濃度的5-azac能促進龍眼球形胚產(chǎn)生，在2，4-D濃度為0.1 mg/L的培養(yǎng)基中，5-azac濃度為5μmol/L促進效果最佳，在2，4-D濃度為0.5 mg/L的MS培養(yǎng)基中添加5μmol/L 5-azac，有球形胚產(chǎn)生。因此，推測，一定濃度的5-azac能誘導(dǎo)龍眼球形胚的產(chǎn)生。

3.3 龍眼DlAGOs可能參與RNA介導(dǎo)的DNA甲基化機制

擬南芥AGO蛋白參與介導(dǎo)mRNA的剪切、轉(zhuǎn)錄抑制或DNA的甲基化修飾，不同成員功能各異或部分冗余，其中，AtAGO1、AtAGO4和AtAGO7被證明具有切割活性，分別與21-nt sRNA、24-nt sRNA和tasiRNA等不同類型sRNA結(jié)合，擬南芥AtAGO4、AtAGO6和AtAGO9存在功能上部分冗余，介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄水平的基因沉默（TGS），AtAGO4主要與24 nt的小RNA結(jié)合［13］。通過對龍眼體胚發(fā)生過程小RNA組學(xué)測序發(fā)現(xiàn)，龍眼體胚small RNAs（sRNS）的長度以22～24 nt為主，其中24 nt的序列最多［44］。本研究發(fā)現(xiàn)，0.1、0.5 mg/L分別與5μmol/L的5-azac配合使用均促進了龍眼球形胚的產(chǎn)生，同時提高了DlAGO4的相對表達量。本研究推測，龍眼DlA‐GO4主要與24-nt sRNA結(jié)合，參與介導(dǎo)龍眼體胚發(fā)生過程RNA介導(dǎo)的甲基化機制，在龍眼球形胚的發(fā)生過程中發(fā)揮著重要的作用。