龔婧如，楊 濤，馬芬芬，陸惠平

（上海市浦東醫(yī)院藥劑科，上海 201399）

中藥注射劑是以中醫(yī)藥理論為指導(dǎo)，利用現(xiàn)代技術(shù)從中藥材中提取有效成分而供靜脈注射的制劑，它突破了中藥傳統(tǒng)給藥方式，具有生物利用度高、作用迅速等特點[1]。然而，中藥注射劑的藥品不良（ADR）反應(yīng)一直是社會關(guān)注焦點[2]。而ADR 發(fā)生的重要風(fēng)險因素之一就是聯(lián)合用藥[3]。藥物相互作用最常見的原因是細胞色素P450（CYP450）酶的抑制和誘導(dǎo)所產(chǎn)生的代謝性相互作用，引發(fā)ADR 或降低療效[4]。注射用血栓通（凍干）是主要成分為三七總皂苷的中藥注射劑，具有活血祛瘀、通脈活絡(luò)功效，臨床廣泛用于心腦血管疾病的治療[5－7]。目前，以三七總皂苷為主要成分的血栓通制劑對相關(guān)CYP450 酶的影響作用尚不十分明確，相關(guān)研究的結(jié)論并不一致[8－9]。阿托伐他汀是他汀類藥物中應(yīng)用最廣泛的藥物，主要由肝臟中的CYP3A4 酶代謝，具有調(diào)節(jié)血脂、抗炎、改善內(nèi)皮功能及穩(wěn)定斑塊等作用，多用于心血管疾病的預(yù)防和治療[10－11]。臨床常以注射用血栓通（凍干）及其他以三七總皂苷為主要成分的同類藥品聯(lián)合阿托伐他汀鈣治療心腦血管疾病[12－15]，故有必要探討它們之間基于CYP450 酶相互作用的可能性。本研究中擬通過在體外人肝微粒體孵育體系，考察注射用血栓通對CYP450 常見亞酶的抑制作用及對阿托伐他汀體外代謝的影響，揭示可能的藥物相互作用?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與肝微粒體

儀器：液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)，包括Shimadzu LC20型液相色譜（日本Shimadzu 公司），API4000 型自動進樣器及API5000 型三重四極桿檢測器（美國AB 公司）。

試藥：注射用血栓通（凍干）（廣西梧州制藥＜集團＞股份有限公司，批號為19010107）；右美沙芬（瑞士Adamas－Beta 公司，批號為P1057725）；S－美芬妥英（上海相輝醫(yī)藥科技有限公司，批號為SW－LN001－112）；睪酮（德國Dr.Ehrenstoefer 公司，批號為50213）；磺胺苯吡唑（美國J＆K 公司，批號為LFCOQ02）；奎尼?。幽么骉RC 公司，批號為5－JTN－32－1）；酮康唑（批號為ZJVZI－PM），對乙酰氨基酚（批號為5IXZKTD），均購自日本TCI 公司；4－羥基美芬妥英（香港Sohon.Chemtech 公司，批號為NA）；6β－羥基睪酮（上海ZZBIO，.CO，LTD 公司，批號為ZZS－19－012－C1）；阿托伐他汀鈣（批號為LRAC0148），6－羥基氯唑沙宗（批號為1385519），特非那定（批號為MKBX6318V），丁螺環(huán)酮（批號為BCBR8275V），甲苯磺丁脲（批號為SLBV1577），右啡烷（批號為1385499V），4－甲基吡唑（批號為SLBQ1084V），α－萘黃酮（批號為SLCD1488），4－羥基雙氯芬酸（批號為BCBS5961V），還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH，批號為110M5162V），非那西?。ㄅ枮閃XBC8937V），雙氯芬酸鈉（批號為BCBS5961V），氯唑沙宗（批號為MKBV6395V），噻氯匹定（批號為BCBK5476V），NADPH（批號為110M5162V）均購自美國Sigma 公司；其余試劑均為分析純。

肝微粒體：人肝微粒體購自Bioreclamation IVT 公司，批號為VIN。

1.2 方法

1.2.1 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法的建立

色譜條件：1)注射用血栓通體外酶抑制作用，色譜柱為Dikma Inspire C18柱（50 mm×2.1 mm，5 μm）；流動相為0.1%甲酸水溶液（A）和0.1%甲酸甲醇溶液（B），梯度洗脫，流速為450 μL ／ min，運行時 間2 min 或2.5 min（依分析成分）；柱溫為40 ℃；進樣量為4 μL 或5 μL（依分析成分）。2)注射用血栓通與阿托伐他汀體外相互作用，色譜柱為Phenomenex Synegi Hydro RP 柱（30 mm×2 mm，4 μm）；流動相為0.1%甲酸水溶液（A）和0.1% 甲 酸 乙 腈 溶 液（B），梯 度 洗 脫；流 速 為450 μL ／ min；柱溫為45 ℃；進樣量為2 μL，運行時間為1.8 min（阿托伐他?。?；進樣量為5 μL，運行時間為2.5 min（6β－羥基睪酮）。

質(zhì)譜條件：API4000 及API5000 三重四極桿檢測器，采用電噴霧離子源正離子掃描模式（ESI＋），多反應(yīng)監(jiān)測掃描模式（MRM），離子電壓為5 000 V，碰撞氣氣壓為6 psi，氣簾氣氣壓為20 psi，霧化氣氣壓為50 psi，輔助氣氣壓為50 psi，溫度為500 ℃。

方法學(xué)考察：按相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)進行方法學(xué)考察，結(jié)果精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗的RSD 均小于10%，表明儀器精密度良好，樣品溶液在室溫放置24 h 內(nèi)基本穩(wěn)定，方法重復(fù)性良好。

1.2.2 溶液制備與樣品處理

取注射用血栓通150 mg，精密稱定，溶于2 mL 0.9% 氯化鈉溶液中，質(zhì)量分?jǐn)?shù)計為100% 。然后用0.9% 氯化鈉溶液依次稀釋為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01% ，0.10%，0.50%，1.0%，10%，20%的系列工作溶液。

1.2.3 肝微粒體體外孵育體系的建立[16－17]

注射用血栓通體外酶抑制作用：CYP450 各亞酶（1A2，2C9，2C19，2D6，2E1，3A4）的底物非那西汀、雙氯芬酸鈉、S－美芬妥英、右美沙芬、6 羥基氯唑沙宗和睪酮的終濃度分別為30，25，50，8，100，100 μmol／L，對應(yīng)的抑制劑α－萘黃酮、磺胺苯吡唑、噻氯匹定、奎尼丁、4－甲基吡唑和酮康唑的濃度分別為30，10，5，10，60，5 μmol／L，混合人肝微粒體的終質(zhì)量濃度為0.5 mg／mL，37 ℃電熱恒溫水浴孵育。試驗設(shè)試驗組、空白組和陽性對照組，均設(shè)3 個平行樣本。肝微粒體分別與系列工作溶液、空白緩沖液（與測試物含等量有機溶液的PBS）和選擇性抑制劑孵育15 min 后，分別加入各亞酶的探針底物和輔酶NADPH 孵育30 min。于體外孵育體系中加入預(yù)冷的甲醇終止反應(yīng)，蛋白沉淀后，12 000 r／min 離心5 min，取上清液（下同），檢測樣品。CYP450 亞酶的相對活性以相對空白陰性對照的百分比表示，相對活性＝試驗組或陽性對照組中的代謝產(chǎn)物生成量／空白陰性對照組中的代謝產(chǎn)物生成量×100%。采用GraphPad Prism 5 Project 軟件計算半數(shù)抑制濃度（IC50）。

注射用血栓通與阿托伐他汀體外相互作用：CYP3A4 的底物睪酮與阿托伐他汀的終濃度分別為100 μmol／L 和0.5 μmol／L，抑制劑酮康唑的終濃度為5 μmol／L，混合人肝微粒體的終質(zhì)量濃度為0.5 mg／mL，37 ℃電熱恒溫水浴孵育，試驗設(shè)置試驗組、陰性對照組和陽性對照組，均設(shè)3 個平行樣本。試驗組孵育體系中分別加入系列工作溶液預(yù)孵育15 min 后，分別加入阿托伐他汀（濃度0.5 μmol／L）和輔酶NADPH 孵育30 min。陰性對照1 組孵育體系中加入空白緩沖液和阿托伐他?。?.5 μmol／L）后立即加入含內(nèi)標(biāo)甲醇終止。陰性對照2 組孵育體系中加入空白緩沖液預(yù)孵育15 min后，加入阿托伐他汀（0.5 μmol／L）和輔酶NADPH 孵育30 min。陽性對照組孵育體系中加入CYP3A4 的選擇性抑制劑酮康唑（5 μmol／L）預(yù)孵育15 min 后，加入阿托伐他汀（0.5 μmol／L）和輔酶NADPH 孵育30 min。同法處理樣品檢測。以CYP3A4 亞酶底物阿托伐他汀的減少量或探針底物睪酮的代謝產(chǎn)物生成量評估測試物對CYP3A4 亞酶的抑制作用。計算試驗組中阿托伐他汀的代謝量，代謝量＝陰性對照組中母體剩余量－試驗組中母體剩余量。

1.2.4 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 注射用血栓通體外酶抑制作用

結(jié)果見表1 和圖1?？梢?，注射用血栓通對人肝微粒體中的CYP2C19，CYP2D6，CYP3A4 的酶活性抑制存在濃度依賴性，其中對CYP3A4 的IC50為10.7%。

圖1 注射用血栓通對CYP2C19，CYP2D6，CYP3A4 的抑制曲線Fig.2 Inhibition curve of Xueshuantong for Injection on CYP2C19，CYP2D6 and CYP3A4

表1 注射用血栓通對6 種CYP450 亞酶的抑制作用（± s）Tab.1 Inhibitory effect of Xueshuantong for Injection on six kinds of CYP450 subenzymes（± s）

表1 注射用血栓通對6 種CYP450 亞酶的抑制作用（± s）Tab.1 Inhibitory effect of Xueshuantong for Injection on six kinds of CYP450 subenzymes（± s）

注：NA 為不適用。Note：NA ＝not applicable.

相對活性(% of NC)測試濃度（%）陰性對照陽性對照0.01 0.1 0.5 1 10 20 IC50（%）95% CI（%）CYP1A2 100.00±5.12 36.70±2.22 111.00±9.17 108.00±5.03 105.00±6.19 111.00±4.38 123.00±6.72 103.00±26.7 NA NA CYP2C9 100.00±2.69 14.50±0.50 99.30±1.97 102.00±1.29 103.00±4.54 100.00±3.53 93.50±1.88 97.30±2.83 NA NA CYP2E1 100.00±6.37 30.20±2.23 170.00±6.52 174.00±3.70 163.00±6.38 181.00±2.30 231.00±5.00 229.00±7.17 NA NA CYP2C19 100.00±3.28 24.20±1.27 102.00±4.52 113.00±4.41 113.00±12.00 115.00±0.74 76.50±7.14 51.40±4.17＞20 NA CYP2D6 100.00±3.29 6.69±0.31 107.00±3.89 107.00±0.93 104.00±2.20 97.30±5.28 80.20±1.18 67.50±2.20＞20 NA CYP3A4 100.00±4.09 4.43±0.08 94.90±1.35 102.00±5.73 110.00±5.85 95.80±5.29 53.00±1.27 28.00±1.34 10.70(8.74，13.00)

2.2 注射用血栓通與阿托伐他汀體外相互作用

結(jié)果見表2 和圖2。結(jié)果顯示，注射用血栓通在阿托伐他汀和CYP3A4 孵育體系中，對阿托伐他汀抑制作用的IC50為1.76%，即抑制阿托伐他汀50%的代謝時，注射用血栓通的濃度為1.76%。

圖2 注射用血栓通對CYP3A4 的抑制曲線（按阿托伐他汀母體剩余率）Fig.2 Inhibition curve of Xueshuantong for Injection on CYP3A4（according to maternal residual rate of atorvastatin）

表2 注射用血栓通通過CYP3A4 亞酶對阿托伐他汀代謝的影響Tab.2 Effect of Xueshuantong for Injection on metabolism of atorvastatin via CYP3A4 subenzyme

3 討論

本研究中，首先評估了注射用血栓通在人肝微粒體體外孵育體系中對CYP450 常見的6 種亞酶的抑制作用，結(jié)果顯示，注射用血栓通對CYP3A4 酶活性的IC50最低，為10.7 %。在此基礎(chǔ)上，進一步考察了注射用血栓通在上述孵育體系中對阿托伐他汀代謝的影響，結(jié)果顯示，注射用血栓通對阿托伐他汀體外代謝的IC50為1.76%（按阿托伐他汀的母體剩余率計）。

CYPP450 酶系是體內(nèi)藥物代謝的主要酶系，超過90%的藥物經(jīng)CYP 酶代謝，其中涉及藥物代謝的主要有CYP1，CYP2，CYP3 三大家族，其中CYP3A 家族中的CYP3A4 占 肝 內(nèi)CYP 總 量 的30% ～40%[8，18－19]。CYP3A 作為在肝臟中表達最重要的酶，據(jù)統(tǒng)計，超過30%的上市藥品在體內(nèi)的代謝都主要由其催化[20]。注射用血栓通的主要成分為三七總皂苷，主要包括二醇型人參皂苷Rb1、三醇型人參皂苷Rg1、三醇型三七皂苷R1 等[21]。石杰等[22]報道了血塞通注射劑（黑龍江珍寶島制藥公司）對CYP3A4 酶活性無影響，而韓永龍等[23]和李曉宇等[24]報道了三七總皂苷（血塞通注射劑，昆明制藥公司）對大鼠肝CYP3A4 酶活性有抑制作用。王凌等[25]則從單體角度研究了三七總皂苷的不同成分對CYP3A4 酶活性的影響，結(jié)果顯示，R1 呈劑量依賴地抑制CYP3A4 酶活性，Rg1 不抑制CYP3A4 酶活性，Rb1在濃度為1 000 μmol／L 時可輕微抑制CYP3A4 酶活性，即臨床正常劑量下Rg1 和Rb1 成分對CYP3A4 酶活性無影響。本研究結(jié)果表明，所用注射用血栓通對人肝微粒體CYP3A4 酶活性抑制作用呈濃度依賴性。綜上可知，含三七總皂苷的相關(guān)藥品其對CYP3A4 酶活性的抑制作用可能和藥品種類及三七總皂苷的各成分含量有關(guān)。由于此前關(guān)于注射用血栓通對CYP450 酶活性的影響鮮有報道，凸顯本研究的必要性。

在第一階段研究的基礎(chǔ)上，研究了主要由肝臟中的CYP3A4 酶代謝的常用心血管藥物阿托伐他汀鈣與注射用血栓通的體外相互作用，結(jié)果表明，注射用血栓通可通過CYP3A4 酶活性而影響阿托伐他汀的代謝。由于阿托伐他汀在體內(nèi)經(jīng)CYP3A4 主要代謝為活性與本藥相當(dāng)?shù)泥徫缓蛯ξ涣u基衍生物[26]，若CYP3A4 酶活性被抑制，那么阿托伐他汀對羥甲基戊二酰輔酶A 還原酶抑制活性的半衰期將有可能縮短。當(dāng)然，其具體的臨床意義還有待進一步深入研究，如對抑制常數(shù)（Ki）的測定、對時間依賴性抑制還是可逆性抑制的判斷等[27]。

本研究中的注射用血栓通，主要是在患者住院期間使用。然而，目前以主要成分為三七總皂苷的同類上市產(chǎn)品還有血栓通膠囊、復(fù)方血栓通片／顆粒／膠囊／滴丸／軟膠囊等（源自國家藥品監(jiān)督管理局?jǐn)?shù)據(jù)）用來治療相關(guān)慢病的口服劑型。另外，除阿托伐他汀外，CYP3A4 酶主要參與代謝的常見藥品還有鈣通道阻斷劑、他克莫司、辛伐他汀、洛伐他汀、洛匹那韋／利托那韋、司唑侖、唑吡坦、卡馬西平等[28]。有研究表明，某些中成藥雖然短期使用不會對CYP450 酶產(chǎn)生明顯的抑制作用，但長期應(yīng)用則會產(chǎn)生CYP450 酶抑制或誘導(dǎo)作用[29]。這就提示長期使用當(dāng)上述藥品和血栓通系列制劑聯(lián)合使用時，特別是長期聯(lián)合使用時而引起的相關(guān)藥品的療效降低或產(chǎn)生蓄積都值得進一步關(guān)注和研究。

目前關(guān)于注射用血栓通大型上市后的安全性的研究已有開展[30]。但報道的ADR 尚缺乏藥物相互作用方面的評估。本研究中初步顯示了血栓通與相關(guān)藥物聯(lián)用時，具有發(fā)生基于藥物相互作用ADR 的可能，但尚需要專門的大型研究來評估。