姚華開 羅英艦 鄭元利 黎禮謙

摘要 [目的]研究10個馬鈴薯品種之間的遺傳差異性，了解其親緣關(guān)系。[方法]利用SRAP分子標記技術(shù)，共計56對引物組合，對10份馬鈴薯的DNA進行遺傳多樣性分析，共篩選出10對背景干凈、條帶清晰、擴增條帶豐富、重復性好的SRAP引物組合進行PCR擴增。[結(jié)果]擴增出的96條條帶中多態(tài)性條帶有36條，占比為37.50%。以閾值0.758作為標準，可將馬鈴薯分為四大類：地泰高原紅土豆、云南烏洋芋、威芋3號、云斯特和轉(zhuǎn)心烏;威芋7號和黔芋7號;云南七彩土豆;黑金剛和黑美人。[結(jié)論]選用SRAP分子標記技術(shù)能較好地區(qū)分供試品種之間的親緣關(guān)系，且品種之間的遺傳差異性較大，SRAP分子標記技術(shù)有助于馬鈴薯遺傳資源的進一步挖掘和利用，對下一步馬鈴薯改良雜交材料的組配利用和新品種選育具有指導意義。

關(guān)鍵詞 馬鈴薯;SRAP;遺傳多樣性

中圖分類號 S 532 ?文獻標識碼 A ?文章編號 0517-6611（2021）15-0104-04

Abstract [Objective]In order to study the genetic differences among 10 potato varieties and understand their genetic relationship. [Method]Using SRAP molecular marker technology， a total of 56 primer combinations were used to analyze the genetic diversity of 10 potato DNA samples. Ten pairs of SRAP primer combinations with clean background， clear bands， rich amplification bands and good repeatability were selected for PCR amplification. [Result]Among the 96 bands amplified， 36 were polymorphic， accounting for 37.50%. According to the threshold value of 0.758， potatoes can be divided into four categories： Ditai potato， Yunnan black potato， Weiyu No.3， Yunsite and Zhuanxinwu;Weiyu No.7 and Qianyu No.7;Yunnan colorful potato;Heijingang and Heimeiren. [Conclusion] In this study， SRAP molecular marker technology can better distinguish the genetic relationship between the tested varieties， and the genetic differences between varieties are large. SRAP molecular marker technology is helpful to further mining and utilization of potato genetic resources， and it is helpful for the combination and utilization of potato improved hybrid materials and new variety breeding in the next step.

Key words Potato;SRAP;Genetic diversity

基金項目 貴州省科技計劃項目“根類紫色蔬菜種質(zhì)資源收集、篩選及應(yīng)用”（黔科技合支撐〔2018〕2332）。

作者簡介 姚華開（1993—），男，貴州石阡人，農(nóng)藝師，碩士，從事蔬菜栽培與育種研究。

*通信作者，農(nóng)藝師，碩士，從事蔬菜栽培與育種研究。

收稿日期 2021-01-05;修回日期 2021-01-26

馬鈴薯，又稱洋芋、土豆，為一年生具塊莖的糧、菜、飼兼用作物[1-2]，具有環(huán)境適應(yīng)能力強、單產(chǎn)高、種植成本較低、易種植、耐貯藏等特點，素有“地下蘋果”“世界十大營養(yǎng)食品之一”“能源植物”等多項美稱[3-4]。

貴州省在明末清初就開始種植馬鈴薯，歷史較為悠久，尤其是近幾年種植面積的不斷擴大，目前已位列全國三甲[5-7]。馬鈴薯產(chǎn)業(yè)作為貴州省重要的農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)，在脫貧攻堅和鄉(xiāng)村振興中發(fā)揮著舉足輕重的作用，近幾年隨著馬鈴薯品種更新?lián)Q代的速度日益加快，對優(yōu)質(zhì)、高效、高產(chǎn)馬鈴薯新品種也提出了更高要求。優(yōu)良品種的選擇是當下馬鈴薯產(chǎn)業(yè)發(fā)展面臨的一個關(guān)鍵性問題，快速、準確地選擇品種是今后推廣優(yōu)質(zhì)馬鈴薯品種的主要途徑[8]。傳統(tǒng)育種過程中對馬鈴薯品種的鑒別主要采用農(nóng)藝性狀調(diào)查和生物形態(tài)學統(tǒng)計分析法，但是由于傳統(tǒng)方法所需周期較長，且鑒別結(jié)果易受人為因素的干擾，導致誤差較大。為進一步探索不同馬鈴薯品種之間的遺傳差異性，規(guī)范馬鈴薯管理規(guī)程和標準，須對馬鈴薯品種開展分子標記研究工作，這對今后馬鈴薯親本鑒定、品種選育、品種推廣都有重要的指導意義[9]。近年來，分子標記技術(shù)被廣泛用于馬鈴薯遺傳多樣性鑒定和育種中，邸宏等[10]和李鳳云等[11]采用AFLP和RAPD兩種分子標記方法對國內(nèi)部分馬鈴薯進行了分子標記和遺傳多樣性分析;艾星梅等[12]選用12對引物對馬鈴薯品種“劍川紅”開展了自交和雜交群體遺傳多樣性分析的鑒定;SRAP分子標記技術(shù)具有操作簡單、效率高、可批量顯示標記物、易分離等優(yōu)點，因此在植物、動物、微生物遺傳多樣性分析[13]、遺傳圖譜構(gòu)建[14]和基因定位[15]等方面都有廣泛的應(yīng)用。

筆者利用SRAP分子標記技術(shù)對引進國內(nèi)育成的馬鈴薯品種及貴州省本地的10個馬鈴薯品種進行分析，明確貴州本地馬鈴薯品種與國內(nèi)外引進的馬鈴薯品種之間的遺傳多樣性，為進一步豐富貴州馬鈴薯種質(zhì)資源，同時為挖掘、開發(fā)和利用馬鈴薯優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源，加速育種進程提供科技支撐和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗材料為塊莖馬鈴薯，供試品種見表1。

1.2 主要試劑及儀器

TaqDNA聚合酶，10×PCR Buffer 緩沖液（含Mg2+），10 mmol/L dNTPs均由Thermo公司生產(chǎn)提供;SARP引物參考相關(guān)學者[16-19]已有文獻報道，進一步優(yōu)化開發(fā)，上游引物長度為17個堿基，下游引物為18個堿基，上游引物和下游引物通過正交組合成56對引物。引物具體序列見表2。

1.3 試驗方法

1.3.1 DNA提取及檢測。

每個品種取50～80 mg塊莖加適量液氮研磨成粉末，使用試劑盒提取DNA，試劑盒由天根（北京）有限責任公司提供。各取5 μL DNA溶液用1.0%瓊脂糖凝膠進行純度檢測，將符合要求的DNA樣品稀釋至50 ng/μL，并置于-80 ℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 SRAP-PCR反應(yīng)體系及擴增程序。

SRAP-PCR參考王穎等[20]的方法，并對擴增體系進行優(yōu)化。PCR擴增程序：預變性，94 ℃，1 min，前5個循環(huán);退火，35 ℃，1 min，中35個循環(huán);延伸，72 ℃，1 min，變性，94 ℃，1 min，退火，50 ℃，1 min，后1個循;再延伸，72 ℃，5 min。PCR擴增反應(yīng)體系：上下游引物，各1.2 μL 5 U/μL TaqDNA 聚合酶，0.15 μL 10×PCR Buffer（mg2+），2.75 μL dNTPs，2.0 μL DNA模板，2.0 μL ddH2O，10.7 μL。

1.3.3 電泳檢測預試驗。

選用1.8%瓊脂糖凝膠擴增產(chǎn)物在110 V/mA電壓下進行電泳分離，電泳后用Tanon 1600對凝膠進行拍照，正式試驗：擴增產(chǎn)物用10%非變性聚丙烯酰胺凝膠板上分離，所有膠板存檔。

1.3.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析方法。

從電泳圖上挑選出具有差異

性的多態(tài)性條帶，相同位置上，有條帶顯示的標記為數(shù)字1，無條帶顯示的標記為數(shù)字0，在此基礎(chǔ)上組成0和1的原始矩陣，并選用NTSYS-pc 2.1e軟件進行聚類分析生成樹狀聚類圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 馬鈴薯品種基因組DNA 的質(zhì)量檢測

對表1中的10個樣品進行電泳檢測。配制1%瓊脂糖膠，取DNA原液5 μL，110 V電泳25 min，電泳檢測DNA完整性。從圖1可以看出，10個馬鈴薯品種的DNA電泳條帶明晰、亮度好、均勻，表明所提取的DNA質(zhì)量可以滿足SRAP分子標記試驗的要求，可用于進行PCR擴增。

2.2 SRAP引物篩選及擴增

每個品種各取1 μL DNA樣品作為混合DNA，利用表2中正交組合成的56對引物進行初步篩選，得出如圖2所示的結(jié)果，初步篩選出10對引物組合。在初篩的基礎(chǔ)上，篩選出條帶清晰、亮度高、背景干凈、條帶豐富的10對SRAP引物組合，并用篩選出來的10對SRAP引物組合對10個馬鈴薯品種進行多態(tài)性檢測（表3），選取的10對SRAP引物組合共擴增出96個位點條帶，其中me6/em2、me7/em2和me3/em5的條帶數(shù)最多，均為12條;條帶最少的引物組合為me3/em3，僅有7條;平均每對引物擴增出的條帶數(shù)為9.6個。10對引物組合共擴增出亮度高、清晰度好、重復性好的多態(tài)性條帶36個，其中多態(tài)性條帶最多的是me1/em8和me5/em5，為5條，最少的是me6/em2，僅為2條，平均為3.6條，多態(tài)性占比為37.50%（圖2、表3）。

2.3 聚類分析

利用NTSYS-pc2.1數(shù)據(jù)分析軟件計算得到10份供試馬鈴薯品種兩兩之間的遺傳相似系數(shù)（Geneticsimilarity，GS）在 0.740～0.990，平均值為0.865。基于遺傳相似系數(shù)用類平均法（UPGMA）對選取的馬鈴薯品種進行聚類分析，結(jié)果表明（圖 3），當閾值為 0.74時，10份供試材料可分為兩大類：第一大類7個品種，分別為0402、0403、0407、0408、0409、0410、0401;其中在閾值為0.77時，又可以進一步分為3個亞類，第一亞類為0402，第二亞類為0403、0407、0408、0490，第三亞類為0401、0410;其中第三亞類的0401和0410的相似系數(shù)最高，達0.990，2個馬鈴薯品種均來自貴州威寧，在外觀（薯形、薯皮、芽眼、顏色）極為相似，表明這2個馬鈴薯品種在親緣關(guān)系上較為接近，遺傳差異性較小，第一亞類和第二亞類的0402、0403、0407、0408、0409間親緣關(guān)系比較遠。第二大類3個品種為0404、0405、0406;在閾值為0758時，可分為2個亞類，0404獨自成一個亞類，0405、0406為第二亞類，其中0405與0406之間的相似性系數(shù)為0.950，黑金剛與黑美人在外觀與表現(xiàn)上也較為相似，親緣關(guān)系較為接近，二者與第一亞類的0404品種間親緣關(guān)系較遠。

3 結(jié)論與討論

SRAP分子標記技術(shù)具有操作簡單、效率高、可批量顯示標記物、易分離等優(yōu)點，在植物、動物、微生物遺傳多樣性分分析、遺傳圖譜構(gòu)建、QTL定位和基因定位克隆等方面都有廣泛的應(yīng)用，如甜瓜[21]、冰草[22]、國蘭[23]、藍莓[24]、小麥[25]等。

通過聚類分析結(jié)果可以較為直觀、簡潔、清晰地反映出不同馬鈴薯品種之間親緣關(guān)系的遺傳距離，在親本鑒定、品種選育、品種推廣方面都有重要的指導意義，可縮短進程[26]。遺傳多樣性是研究植物種質(zhì)資源的重要工作內(nèi)容之一，全面地掌握現(xiàn)有種質(zhì)資源的遺傳多樣性，可以減少育種工作中親本選配的盲目性，從而提高育種效率[18]。遺傳多樣性研究最可靠的是基因水平研究，而進行基因測序是最直接、最具說服力的方法，但是對于一個物種或一個種屬中每個樣品都進行基因組測序的可行性較低。

近年來，RAPD[27]、AFLP[28]、SSR[29]、SRAP[30]等各類分子標記已經(jīng)在馬鈴薯種質(zhì)資源遺傳多樣性分析中得到了廣泛應(yīng)用。該研究通過選用SRAP分子標記技術(shù)對10個不同馬鈴薯品種進行遺傳多樣性分析，利用篩選出來的10對SRAP引物組合對10個馬鈴薯品種進行多態(tài)性檢測，共擴增出96個條帶，所選取的10對擴增引物平均每對引物擴增出的條帶數(shù)為9.6個。10對擴增引物共擴增出36條多態(tài)性條帶，平均每對3.6條，多態(tài)性占比為37.50%。以閾值0.758為基準，10個馬鈴薯供試樣品可以分為四大類：①0402、0403、0407、0408 和0409;②0401 和0410;③0404;④0405和0406。國內(nèi)外對馬鈴薯SRAP分子標記都有相關(guān)的研究報道，李麗等[31]對11份貴州馬鈴薯栽培品種遺傳多樣性進行SRAP分析，多態(tài)性引物比達24%，可將11份品種分為兩大類群，聚類分析表明，參試馬鈴薯品種間的遺傳多樣性相對豐富，遺傳差異較大;程永芳等[17]對寧夏地區(qū)54份馬鈴薯種質(zhì)資源遺傳多樣性分析及雜交子代SRAP鑒定，初步判定所有雜種F1均為真實的雜交種，為馬鈴薯親本的篩選及雜交子代早期鑒定提供理論數(shù)據(jù)和技術(shù)參考;甘曉燕等[32]利用SRAP分子標記技術(shù)對47份馬鈴薯種質(zhì)材料進行遺傳多樣性分析，能夠較為全面地描述寧夏地區(qū)主要馬鈴薯品種遺傳相似性，SRAP標記更適用于遺傳關(guān)系較近材料的遺傳多樣性分析;何鳳發(fā)等[33]利用SRAP分子標記研究了44份馬鈴薯種質(zhì)資源的遺傳多樣性、親緣關(guān)系和遺傳基礎(chǔ)，結(jié)果表明，表型性狀與SRAP標記聚類結(jié)果的關(guān)聯(lián)度在塊莖品質(zhì)性狀上最大，并系統(tǒng)評價了馬鈴薯表現(xiàn)型;趙光磊等[34]對黑龍江省主栽34份馬鈴薯品種遺傳多樣性進行SRAP分析，多態(tài)性比率為49.4%，供試材料可分為3大類7亞類，結(jié)果表明黑龍江省主栽馬鈴薯品種的遺傳相似性較高，遺傳多樣性程度較低;王穎等[20]運用SRAP技術(shù)分析10個馬鈴薯新品系的遺傳差異，得到多態(tài)性位點條帶165個，多態(tài)性位點百分率占79.33%，材料間遺傳差異相對較大，能準確地將10份馬鈴薯材料分為4類。

綜合分析，該研究的結(jié)果與國內(nèi)外相關(guān)學者的研究報道結(jié)果一致，采用SRAP分子標記技術(shù)能較為準確地區(qū)分10個供試馬鈴薯品種的親緣關(guān)系和遺傳差異性，同時輔助采用農(nóng)藝性狀調(diào)查和生物形態(tài)學統(tǒng)計分析法全面地分析馬鈴薯品種的遺傳多樣性和利用好雜交優(yōu)勢，有助于進一步挖掘和利用馬鈴薯優(yōu)質(zhì)的遺傳資源，加速育種進程，這對下一步馬鈴薯改良雜交材料的組配利用和新品種選育有著指導意義。

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