郭冰玉，左洋洋，王先科，李 莉

（1.河南師范大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453007；2.河南省水產(chǎn)科學(xué)研究院，鄭州 450044）

細(xì)菌性疾病是水產(chǎn)養(yǎng)殖中最常見、危害最大的一類疾病，隨著高密度集約化養(yǎng)殖技術(shù)的推廣，在養(yǎng)殖產(chǎn)量提高的同時(shí)，也導(dǎo)致了魚病頻發(fā)的現(xiàn)象。細(xì)菌性爛鰓病、細(xì)菌性腸炎、細(xì)菌性敗血癥、豎鱗病和赤皮病的暴發(fā)給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)者帶來慘重的經(jīng)濟(jì)損失?？股厥侵委熂?xì)菌性疾病的常用藥物，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中常常由于長(zhǎng)期不規(guī)范的使用，導(dǎo)致耐藥菌的產(chǎn)生，水產(chǎn)品藥物的殘留以及水體環(huán)境污染和微生態(tài)平衡的破壞等問題[1]。近年來有關(guān)中草藥在水產(chǎn)養(yǎng)殖中應(yīng)用的相關(guān)研究表明，中草藥含有的生物堿、有機(jī)酸、多糖等免疫活性成分，可以參與調(diào)節(jié)魚類營養(yǎng)代謝，提高魚類免疫力。且對(duì)水體不會(huì)產(chǎn)生污染，是具有開發(fā)應(yīng)用潛力的替抗產(chǎn)品[2]。

厚樸(Magnolia officinal is Rehd.et.Wils.)為木蘭科(Magnoliaceae)木蘭屬(Magnolia)植物厚樸或凹葉厚樸的干燥干皮、根皮、枝皮[2]。厚樸總酚是提取中藥厚樸的酚類化合物，主要包括厚樸酚與和厚樸酚兩種有效活性成分，在傳統(tǒng)中醫(yī)藥學(xué)中主治人的食積氣滯、腹脹便秘、濕阻中焦、痰壅氣逆和脘痞吐瀉等[3]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)厚樸具有廣譜抗菌作用，對(duì)葡萄球菌(Staphyl ococcussp.)、溶血性鏈球菌(Streptococcus hemolytic)、肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)、百日咳桿菌(Bordetella pertussis)等革蘭氏陽性菌以及炭疽桿菌(Baci llus anthraci)、痢疾桿菌(Shigell a Cast ellani)、傷寒桿菌 (Salmonella typhi)、副傷寒桿菌(Salmonella enterica)、霍亂弧菌(Vibrio cholerae)、大腸桿菌(Escherichia coli)、變形桿菌(proteus species)、枯草桿菌(Bacillus subtilis)等革蘭氏陰性菌均有抗菌作用，抗菌性能比較穩(wěn)定[4]。

在厚樸提取物中酚類的抑菌效果較好，吳維萍(2008)在厚樸提取物對(duì)不同病原菌抑菌效果的研究中表明，厚樸提取物與厚樸酚對(duì)鏈球菌(St reptococcussp.)MIC分別為12.58μg/片、6.29μg/片[5]，林桂蕓(2003)的研究表明和厚樸酚對(duì)金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大腸桿菌(Escherichia coli)、Streptococcus的最小抑菌濃度 (minimal inhibitory concentration，MIC)均在l0 mg·L-1以內(nèi)[6]。在已有的研究中，多以陸生動(dòng)物致病菌為研究對(duì)象，而有關(guān)厚樸提取物對(duì)水生病原菌的研究鮮有報(bào)道。本試驗(yàn)選擇水生病原嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophi la)、遲緩愛德華氏菌(Edwardsiella tarda)、副溶血弧菌(Vibrio parahemolyticus)、海豚鏈球菌(Streptococcus iniae)、鰻弧菌(Vibrio anguillarum)和陸生動(dòng)物病原金黃色葡萄球菌為研究對(duì)象，使用倍比稀釋法和平板點(diǎn)菌法測(cè)定了厚樸總酚對(duì)6種常見致病菌的MIC和最小殺菌濃度(minimum bactericidal concentration，MBC)。旨在為厚樸總酚用于水產(chǎn)動(dòng)物細(xì)菌性疾病的科學(xué)防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

供試S.aureus、V.anguillarum、V.parahemolyticus、E.tarda、A.hydrophila和S.iniae均保存于河南師范大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院水產(chǎn)動(dòng)物醫(yī)學(xué)團(tuán)隊(duì)。

1.1.2 供試藥物及試劑

供試厚樸總酚純度為98%，二甲亞砜（DMSO）、氯化鈉和氫氧化鈉等均為分析純。

胰蛋白胨、酵母提取物、瓊脂粉購自上海生工生物工程有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基的制備

LB液體培養(yǎng)基：1%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物、1%氯化鈉，使用2M NaOH溶液調(diào)pH至7.0～7.2，121℃高壓滅菌后備用。

LB固體培養(yǎng)基：在LB液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加1.5%的瓊脂粉，121℃高壓滅菌，倒入培養(yǎng)皿待凝固后備用。

1.2.2 藥物預(yù)溶及藥物梯度的配制

根據(jù)厚樸總酚的溶解性，選擇DMSO為溶劑。稱取51.2 mg的粉狀厚樸總酚提取物，溶于1 mL DMSO得到51.2 mg·mL-1的母液。使用LB液體培養(yǎng)基為稀釋液，在試管中做二倍系列稀釋，最終得到濃度分別為512、256、128、64、32、16、8、4、2、1μg·mL-1的厚樸總酚的10個(gè)藥物濃度梯度。

1.2.3 菌株活化

從-80℃取出6種待測(cè)菌株，用接種環(huán)分別蘸取少許在LB固體培養(yǎng)基上采用四區(qū)劃線法進(jìn)行劃線，分別將S.aureus、V.anguillarum、V.parahemol yticus置于37℃，A.hydrophila、E.tarda置 于28℃，S.iniae于30℃恒溫培養(yǎng)12～16 h，至培養(yǎng)皿中長(zhǎng)出單菌落后備用。

1.2.4 菌懸液的制備

分別從固體培養(yǎng)基上挑取單菌落于1 mL LB液體培養(yǎng)基中，S.aureus、V.anguillarum、V.parahemolyticus37℃，E.tarda、A.hydrophila28℃，S.iniae30℃，200 rpm振蕩培養(yǎng)6～8 h，之后以1∶100的比例按照以上培養(yǎng)條件進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng)至OD600nm為0.6左右備用。

1.2.5 最小抑菌濃度的測(cè)定

試驗(yàn)共分為10個(gè)濃度組，1個(gè)陰性對(duì)照和1個(gè)陽性對(duì)照，所有藥物梯度和陽性對(duì)照重復(fù)三個(gè)平行。實(shí)驗(yàn)前將1.2.4的菌懸液做適當(dāng)稀釋，調(diào)整菌液濃度為106cfu·mL-1，試驗(yàn)組的每個(gè)EP管中加300μL稀釋后的菌液之后，分別依次加入300μL 1.2.2中配置的10個(gè)濃度梯度的藥物，每個(gè)菌種的每個(gè)藥物梯度重復(fù)三個(gè)平行；陽性對(duì)照為300μL菌懸液和300μL LB液體培養(yǎng)基；陰性對(duì)照為600μL的LB液體培養(yǎng)基。6種細(xì)菌的培養(yǎng)條件同1.2.3，恒溫培養(yǎng)18～24 h后進(jìn)行觀察，在所有無肉眼可見白色絮狀物生長(zhǎng)的澄清藥物濃度中，濃度最小的藥物梯度為該藥物的MIC。

1.2.6 最小殺菌濃度的測(cè)定

取出1.2.5菌藥混合物中MIC的前3～5個(gè)藥物梯度，在先前準(zhǔn)備的的LB固體培養(yǎng)基中分別點(diǎn)菌，每個(gè)藥物梯度設(shè)置三個(gè)平行。將點(diǎn)過菌的LB固體培養(yǎng)基放入培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)。細(xì)菌培養(yǎng)條件同1.2.3培養(yǎng)18～24 h后進(jìn)行觀察，所有不長(zhǎng)菌的藥物梯度中最小濃度即為該藥物的MBC。

2 結(jié)果

2.1 厚樸總酚對(duì)常見病原菌的抑菌活性

使用倍比稀釋法檢測(cè)厚樸總酚對(duì)A.hydrophila、E.tarda、V.parahemolyticus、V.anguillarum、S.aureus、S.iniae的敏感性，經(jīng)過培養(yǎng)24 h后，6種病原菌在不同藥物梯度中的生長(zhǎng)情況詳見表1。根據(jù)肉眼觀察無白色絮狀生長(zhǎng)的澄清培養(yǎng)基中，濃度最小的藥物梯度為厚樸總酚對(duì)某種細(xì)菌的MIC，厚樸總酚對(duì)S.iniae、S.aureus、V.anguillarum和V.parahemolyticus的MIC分別為16μg·mL-1、16μg·mL-1、32μg·mL-1和64μg·mL-1。而A.hydrophila和E.tarda的所有濃度梯度的EP管中均有白色絮狀物質(zhì)，說明厚樸總酚對(duì)這兩種致病菌的MIC均 大 于512μg·mL-1。結(jié) 果 顯 示S.aureus、V.anguillarum、V.parahemolyticus和S.iniae這四種菌株對(duì)厚樸總酚較為敏感，而A.hydrophi la和E.tarda對(duì)厚樸總酚不敏感。

表1 厚樸總酚對(duì)常見病原菌的抑菌作用

2.2 厚樸總酚對(duì)常見病原菌的殺菌活性

根據(jù)厚樸總酚對(duì)6種病原菌的MIC實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取S.aureus、V.anguillarum、V.parahemolyticus和S.iniae菌藥混合物中MIC的前3～5個(gè)藥物梯度，在LB固體培養(yǎng)基中分別點(diǎn)菌，培養(yǎng)24 h后，觀察平板上菌落的生長(zhǎng)情況，結(jié)果顯示厚樸總酚對(duì)S.iniae、V.anguillarum、V.parahemolyticus和S.aureus均有不同程度的殺菌作用，MBC分別為32μg·mL－1、64μg·mL－1、128μg·mL－1和256μg·mL－1（表2）。由于A.hydrophila和E.tarda的最小抑菌濃度超過本實(shí)驗(yàn)設(shè)置的最高藥物濃度，則MBC高于512μg·mL－1。

表2 厚樸總酚對(duì)6種病原菌的最小抑菌濃度和最小殺菌濃度

3 討論

張?jiān)?2012)研究了厚樸酚對(duì)幾種微生物的抑菌作用，結(jié)果顯示厚樸酚對(duì)人類常見致病菌S.aureus和E.coli的MIC分別為10μg·mL－1和5μg·mL－1，對(duì)人畜－禽共患致病菌沙門氏桿菌(Salmonella.sp)的MIC為5 μg·mL－1，而對(duì)植物致病菌枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、黑曲霉菌(Aspergillus niger)的MIC分別為5 μg·mL－1和10μg·mL－1，對(duì)啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的MIC為10μg·mL－1[7]，說明厚樸酚具有廣譜抗菌作用且抑菌效果明顯。劉桂蘭等(2018)對(duì)厚樸總酚對(duì)乳房炎致病菌S.aureus的抑菌作用及抗溶血作用的研究表明，厚樸總酚對(duì)S.aureus的MIC范圍為8～16μg·mL－1[8]。而在本試驗(yàn)中，厚樸總酚對(duì)S.aureus的MIC為16μg·mL－1，結(jié)果與劉桂蘭和張?jiān)?2012)的研究結(jié)果不完全相同，但差別微小，可能與菌株來源不同、試驗(yàn)方法不同有關(guān)。

梁利國(2010)研究了常用中草藥對(duì)4種病原弧菌的體外抗菌效果，結(jié)果顯示，五倍子(Rhus chinensis Mill.)、石榴皮(Granti pericarpium)、蘇木(Caesalpiniasappan Li nn)和地錦草(Euphorbia humifusa Willd.)等對(duì)V.anguillarum、V.parahemolyticus、 河 口 弧 菌(V.aestuarianus)以及霍亂弧菌(V.cholerae)等均具有較好 的 抑 菌 和 殺 菌 效 果，MIC為0.78～6.25 mg·mL－1，MBC為3.12～12.5 mg·mL－1[9]，而本研究中厚樸總酚對(duì)V.anguill arum和V.parahemol yticus的MIC分別為32μg·mL－1和64μg·mL－1，MBC分別為64μg·mL－1和128μg·mL－1，結(jié)果顯示厚樸總酚的對(duì)這兩種弧菌的抑菌和殺菌效果比以上四種中草藥更為顯著。

本研究中厚樸總酚對(duì)A.hydrophila的MIC和MBC均大于512μg·mL－1，抑菌效果不明顯。與吳家玉(2021)提出的厚樸酚對(duì)嗜水氣單胞菌不具有抑菌或殺菌作用的觀點(diǎn)一致。但是在飼料中添加厚樸總酚投喂異育銀鯽(Carassius auratus gi belio)，卻能夠減少A.hydrophila感染引起的異育銀鯽的死亡，與對(duì)照組相比，厚樸酚處理后的異育銀鯽ALT、AST和LDH顯著下調(diào)，TP和ALB含量顯著上升(P＜0.05)，CAT、SOD活性顯著提高，GSH含量顯著提高(P＜0.05)，MDA顯著下降(P＜0.05)，在一定程度上緩解肝臟和脾臟的充血，改善腎臟和腸道的細(xì)胞壞死，說明該藥物可降低異育銀鯽的組織氧化損傷。此外，厚樸酚還可顯著下調(diào)MyD88、NF－κB和TNF－α基因的表達(dá)量，提高TLR－5基因表達(dá)量(P＜0.05)，表明該藥物可通過下調(diào)機(jī)體炎癥反應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)來發(fā)揮抗炎功能[10]，因此厚樸酚對(duì)預(yù)防魚類細(xì)菌感染以及在抗菌免疫中發(fā)揮重要作用，可作為一種免疫增強(qiáng)劑開發(fā)應(yīng)用。

本研究結(jié)果顯示，厚樸總酚對(duì)S.iniae的MIC(16 μg·mL－1)和MBC(32μg·mL－1)在供試菌株中均為最低，而厚樸總酚對(duì)S.aureus的MIC(16μg·mL－1)雖然也較低，但MBC(256μg·mL－1)卻較高，推測(cè)厚樸總酚對(duì)不同種類細(xì)菌的作用機(jī)制不同，厚樸總酚對(duì)S.iniae主要發(fā)揮殺菌作用，而對(duì)S.aureus可能發(fā)揮抑菌作用。此外，厚樸總酚對(duì)淡水魚致病菌A.hydrophila無明顯抑菌作用，但相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)厚樸總酚對(duì)A.hydrophila引起的疾病有一定的緩解作用，因此在面對(duì)由A.hydrophila感染引起的疾病時(shí)，厚樸總酚可以輔助或替代傳統(tǒng)化學(xué)合成藥物參與治療。

綜上，厚樸總酚作為一種天然中草藥提取物，在抑菌、殺菌以及抗炎方面發(fā)揮作用，可一定程度上替代抗生素和化學(xué)合成類藥物在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的使用，提高水產(chǎn)品的質(zhì)量安全和改善養(yǎng)殖環(huán)境。本研究為后續(xù)厚樸總酚對(duì)水生致病菌感染水生動(dòng)物后治療效果的相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ)，為厚樸總酚用于水產(chǎn)動(dòng)物細(xì)菌性疾病的科學(xué)防控提供理論依據(jù)。