陳亞豐, 王 甦, 邸 寧,*, 金道超

(1. 貴州大學(xué)昆蟲研究所, 貴州山地農(nóng)業(yè)病蟲害重點實驗室, 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部貴陽作物有害生物科學(xué)觀測實驗站, 貴陽 550025;2. 北京市農(nóng)林科學(xué)院植物保護環(huán)境保護研究所, 北京 100097)

利用天敵昆蟲對害蟲進行生物防治可有效避免化學(xué)投入品帶來的害蟲抗藥性和環(huán)境污染等問題(陳學(xué)新, 2010)。不同天敵的混合釋放可以在增加群落穩(wěn)定性的同時減少天敵種群的自然衰退，因此天敵的聯(lián)合應(yīng)用對于降低蟲害造成的產(chǎn)量損失具有潛在增效作用(Heimple and Mills, 2008; 李姝等, 2014)。目前，不同天敵的聯(lián)合應(yīng)用包括多種天敵昆蟲混合釋放和利用天敵昆蟲攜帶生防菌進行防控增效，而天敵之間的兼容性是影響防治效果的重要因素(Chowetal., 2008; 吳圣勇等, 2019)。

白僵菌Beauveriaspp.是廣譜性的昆蟲病原微生物，可以寄生鱗翅目、鞘翅目、半翅目和膜翅目等15目149 科700多種昆蟲和蜱螨類(季香云和楊長舉, 2003)。白僵菌因具有寄主范圍廣、致病性較強等優(yōu)點，已成為害蟲生物防治中應(yīng)用最為廣泛的蟲生真菌之一(高紅等, 2011; 郭涵等, 2020)。然而白僵菌也有一定局限性，因為殺蟲譜較廣的病原微生物在殺死害蟲的同時，也可能會對天敵昆蟲產(chǎn)生負面影響(Ong and Vandermeer, 2015; 楊清碰和李莉, 2017; 吳圣勇等, 2019)。有研究表明，用白僵菌孢懸液(1×107孢子/mL)處理松墨天牛Monochamusalternatus寄生性天敵管氏腫腿蜂Sclerodermaguani7 d后，天敵死亡率高達100%(楊清碰和李莉, 2017)。然而Wu等(2016)研究表明施用白僵菌對捕食性天敵巴氏新小綏螨Neoseiulusbarkeri的種群密度沒有影響；楊芷等(2020)發(fā)現(xiàn)白僵菌孢子對松毛蟲赤眼蜂Trichogrammadendrolimi的羽化時間和羽化率等無不良影響。因此系統(tǒng)性地評價白僵菌對天敵的影響是白僵菌與天敵昆蟲聯(lián)合應(yīng)用的前提。

二斑葉螨Tetranychusurticae是一種重要的世界性害螨，世代周期短，寄主范圍廣。由于化學(xué)藥劑長期大量的不合理使用導(dǎo)致該螨對多種殺螨劑產(chǎn)生不同程度的抗性，因此通過生物防治來降低二斑葉螨的危害變得更加重要(宮亞軍等, 2014)。 東亞小花蝽Oriussauteri作為一種重要的生防天敵(Wangetal., 2019)，在我國分布范圍廣、適應(yīng)性強，其對葉螨、薊馬和粉虱等害蟲的防治效果已在溫室和田間得到廣泛證實(蔣月麗等, 2011; 尹健等, 2013; Wangetal., 2014)。

目前針對白僵菌與小花蝽屬天敵聯(lián)合應(yīng)用防治害蟲的研究較少。Gao等(2012)研究表明，無論用白僵菌孢懸液直接施用于東亞小花蝽，還是用白僵菌處理過的西花薊馬Frankliniellaoccidentalis飼喂東亞小花蝽均不會對其生長發(fā)育造成影響，但該研究未評價白僵菌對東亞小花蝽捕食能力的影響。Shipp等(2003)研究表明美洲小花蝽O.insidiosus成蟲不應(yīng)與球孢白僵菌在溫室中聯(lián)合釋放應(yīng)用，然而該研究僅使用了單一濃度的孢子懸浮液。本研究通過比較經(jīng)球孢白僵菌B.bassiana孢子粉與不同濃度的孢子懸浮液處理后的東亞小花蝽羽化率以及捕食二斑葉螨的功能反應(yīng)模型評價白僵菌對東亞小花蝽的安全性，以期為東亞小花蝽與白僵菌溫室聯(lián)合釋放應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲

東亞小花蝽采自北京市農(nóng)林科學(xué)院玉米試驗田，在人工氣候箱(三洋，MH351)(溫度26±1℃，相對濕度60%±5%，光周期16L∶8D，光照強度800 lx)中飼養(yǎng)20代以上，所用飼養(yǎng)獵物為經(jīng)紫外光照射30 min殺胚處理過的新鮮米蛾Corcyracephalonica卵。選取同日孵化的東亞小花蝽，待若蟲生長至5齡第1天，隨機選擇作為試驗材料，試驗前饑餓處理12 h。

二斑葉螨雌成螨于2019年8月自北京市農(nóng)林科學(xué)院玉米試驗田采集，將分離鑒定后的200頭雌成螨在溫室(溫度27±1℃, 相對濕度40%±5%)內(nèi)用盆栽蕓豆Phaseolusvulgaris飼養(yǎng)擴繁。擴繁過程中每隔10 d將帶螨的葉片從蕓豆苗剪下，轉(zhuǎn)移到新的蕓豆上，以保證葉螨食物充足。

供試球孢白僵菌菌種(菌株號: D1-5)由吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供，濃度為500億個孢子/g。

1.2 不同球孢白僵菌處理的東亞小花蝽羽化率測定

試驗包括以下處理：(1)空白對照，即未經(jīng)處理過的東亞小花蝽5齡若蟲；(2)陰性對照，東亞小花蝽5齡若蟲用5 mL含0.05%吐溫80(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)的無菌水浸泡5 s；(3)孢子粉處理，參照楊清碰和李莉(2017)的方法并加以改進，具體為將0.5 g球孢白僵菌孢子粉均勻撒在直徑9 cm的培養(yǎng)皿中，讓1頭東亞小花蝽5齡若蟲在培養(yǎng)皿上爬行5 min，平均每頭小花蝽附著孢子數(shù)約為1×107個；(4)常規(guī)濃度孢懸液處理，即用5 mL推薦濃度1×107孢子/mL的孢懸液(吳圣勇, 2014)將東亞小花蝽5齡若蟲浸泡5 s；(5)采用低濃度(5×103孢子/mL)孢懸液浸泡東亞小花蝽5齡若蟲，方法同上。其中常規(guī)濃度和低濃度的球孢白僵菌孢懸液均由含0.05%吐溫80的無菌水配制。孢子粉處理的東亞小花蝽帶菌量為常規(guī)濃度孢懸液處理帶菌量的2 000倍，常規(guī)濃度孢懸液處理的東亞小花蝽帶菌量為低濃度孢懸液處理帶菌量的2 000倍。東亞小花蝽經(jīng)不同處理的帶菌量計算方法如下：帶菌量=(小花蝽處理后重量-小花蝽處理前重量)×濃度；各處理下選取15頭東亞小花蝽5齡若蟲的數(shù)值取平均值。

將上述5種處理的東亞小花蝽5齡若蟲置于透明的塑料養(yǎng)蟲盒中，每盒20頭。養(yǎng)蟲盒為直徑10 cm、高8 cm的圓柱形。為保證養(yǎng)蟲盒通風(fēng)，盒蓋用直徑為9 cm的100目紗網(wǎng)封住。每個養(yǎng)蟲盒中放入足量米蛾卵(處理同1.1節(jié))作為東亞小花蝽的食物。 5 d后統(tǒng)計東亞小花蝽成蟲羽化率(羽化率=羽化數(shù)/20×100%)。各處理重復(fù)5次。

1.3 不同球孢白僵菌處理的東亞小花蝽5齡若蟲對二斑葉螨的捕食能力測定

東亞小花蝽處理同1.2節(jié)。獵物密度設(shè)置為10, 20, 30, 40, 50, 60和70頭/皿共7個梯度水平。用毛筆將相應(yīng)數(shù)量的二斑葉螨雌成螨轉(zhuǎn)移至直徑9 cm的培養(yǎng)皿中，然后將1頭饑餓處理12 h的東亞小花蝽5齡若蟲放入培養(yǎng)皿，蓋上皿蓋后用封口膜(BEMIS, 美國)封住，以防止東亞小花蝽和二斑葉螨逃逸。隨后將培養(yǎng)皿置于人工氣候箱(條件同1.1節(jié))，24 h后觀察統(tǒng)計各獵物密度及不同處理下存活的葉螨數(shù)量，并計算東亞小花蝽的捕食量(捕食量=初始葉螨數(shù)量-存活葉螨數(shù)量)。以只放入葉螨而不放入東亞小花蝽的培養(yǎng)皿為空白對照來校正實際的捕食量(實際捕食量=觀測捕食量-空白對照死亡量)。各處理重復(fù)10次。

1.4 不同球孢白僵菌處理的東亞小花蝽對二斑葉螨的捕食功能反應(yīng)模型分析

1.5 不同球孢白僵菌處理的東亞小花蝽對二斑葉螨的搜尋效應(yīng)分析

利用1.4節(jié)中擬合Holling II型功能反應(yīng)模型所得參數(shù)，對東亞小花蝽5齡若蟲對二斑葉螨雌成螨的搜尋效應(yīng)依公式進行估算:S=a′/(1+a′ThN)。式中S為搜尋效應(yīng)值，N為獵物密度，a′及Th同Holling II型功能反應(yīng)模型方程。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用R(v.4.0.0)對東亞小花蝽的校正捕食量與獵物密度和處理之間的關(guān)系進行雙因素方差分析(two-way ANOVA；其中東亞小花蝽的校正捕食量為因變量，獵物密度和處理為自變量，考慮自變量之間的交互作用)，評估處理和獵物密度以及它們的交互效應(yīng)對東亞小花蝽5齡若蟲捕食量影響的顯著性。利用SPSS 26.0(IBM)進行卡方檢驗來驗證不同處理的東亞小花蝽對二斑葉螨的取食是否擬合Holling II功能反應(yīng)模型。采用單因素方差分析(one-way ANOVA)檢驗白僵菌處理對東亞小花蝽羽化率影響的顯著性，分析之前先對羽化率百分比數(shù)據(jù)進行反正弦平方根轉(zhuǎn)換。采用Tukey HSD法比較東亞小花蝽羽化率在不同處理之間、同一獵物密度下捕食量的差異顯著性。所有分析中差異顯著性水平設(shè)置為P<0.05。

2 結(jié)果

2.1 球孢白僵菌孢懸液和孢子粉處理對東亞小花蝽羽化率的影響

球孢白僵菌孢懸液(常規(guī)濃度: 1×107孢子/mL; 低濃度: 5×103孢子/mL)和孢子粉(1×107孢子/頭)處理對東亞小花蝽羽化率具顯著影響(F=11.121,df=4, 24,P<0.001)。未羽化的東亞小花蝽在羽化前死亡。其中用孢子粉處理的東亞小花蝽5齡若蟲，其成蟲羽化率最低，其余4組間無顯著性差異(P>0.05)(圖1)。

圖1 球孢白僵菌孢懸液和孢子粉處理對東亞小花蝽成蟲羽化率的影響Fig. 1 Effect of spore suspension and spore powder ofBeauveria bassiana on the emergence rate ofOrius sauteri adultsBC: 空白對照Blank control; NC: 陰性對照(含0.05%吐溫80的無菌水)Negative control (sterile water containing 0.05% Tween-80); SSL: 球孢白僵菌孢懸液(5×103孢子/mL)B. bassiana spore suspension (5×103 conidia/mL); SSR: 球孢白僵菌孢懸液(1×107孢子/mL) B. bassiana spore suspension (1×107 conidia/mL); SP: 球孢白僵菌孢子粉(1×107孢子/頭) B. bassiana spore powder (1×107 conidia/individual). 下同The same below. 東亞小花蝽5齡若蟲經(jīng)2種不同濃度的球孢白僵菌孢懸液(常規(guī)濃度: 1×107孢子/mL; 低濃度: 5×103孢子/mL)和孢子粉(1×107孢子/頭)處理，5 d后統(tǒng)計成蟲羽化率。圖中數(shù)據(jù)為平均值±標準誤；柱上不同字母表示羽化率在不同處理間差異顯著(P<0.05, Tukey HSD法)。The 5th instar nymphs of O. sauteri were treated with two different concentrations of B. bassiana spore suspensions (routine concentration: 1×107 conidia/mL; low concentration: 5×103 conidia/mL) and spore powder (1×107 conidia/individual). The adult emergence rate was counted at 5 d after treatment. Data in the figure are means±SE. Different letters above bars indicate significant difference (P<0.05, Tukey HSD test).

2.2 球孢白僵菌孢懸液和孢子粉處理的東亞小花蝽5齡若蟲對二斑葉螨雌成螨的捕食能力

東亞小花蝽5齡若蟲對二斑葉螨雌成蟲的捕食量受獵物密度、處理以及獵物密度與處理的交互作用影響顯著(獵物密度:F=489.061,df=6, 315,P<0.001; 處理:F=44.041,df=4, 315,P<0.001; 獵物密度×處理:F=2.724,df=24, 315,P<0.001)。除獵物密度為10頭外，球孢白僵菌孢子粉處理的東亞小花蝽5齡若蟲對二斑葉螨雌成蟲的捕食量均顯著低于陰性對照和空白對照(P<0.05)。在獵物密度為50頭/皿時，2個濃度孢懸液處理中東亞小花蝽5齡若蟲對二斑葉螨雌成蟲的捕食量均顯著低于空白對照(P<0.05)，但與陰性對照無顯著差異(P>0.05)；但在其他6個獵物密度下，2個濃度孢懸液處理中東亞小花蝽5齡若蟲對二斑葉螨雌成蟲的捕食量與空白和陰性對照均無顯著差異(P>0.05)(圖2)。

圖2 球孢白僵菌孢懸液和孢子粉處理的東亞小花蝽5齡若蟲在二斑葉螨雌成螨不同密度下的捕食量Fig. 2 Predation amounts of female adults of Tetranychus urticae by the 5th instar nymphs of Orius sauteri treatedwith spore suspension and spore powder of Beauveria bassiana under different prey densities圖中數(shù)據(jù)為平均值±標準誤；柱上不同字母表示在同一獵物密度下不同處理間捕食量差異顯著(P<0.05, Tukey HSD法)。Data in the figure are means±SE. Different letters above bars indicate that the predation amounts were significantly different among treatments under the same prey density (P<0.05, Tukey HSD test).

2.3 白僵菌孢懸液和孢子粉處理的東亞小花蝽對二斑葉螨雌成螨的捕食功能反應(yīng)模型

球孢白僵菌孢懸液(常規(guī)濃度:1×107孢子/mL; 低濃度: 5×103孢子/mL)和孢子粉(1×107孢子/頭)處理的東亞小花蝽5齡若蟲對二班葉螨雌成螨的捕食能力均符合Holling Ⅱ型功能反應(yīng)(R2>0.9,P>0.05)。表1中不同處理下東亞小花蝽的實際捕食量與理論值差異均不顯著(P>0.05)。其中低濃度孢懸浮液處理的東亞小花蝽5齡若蟲對二斑葉螨雌成蟲的理論日最大捕食量最高(略高于空白對照組)，獵物處理時間最短；而常規(guī)濃度孢懸浮液處理的東亞小花蝽5齡若蟲對二斑葉螨雌成蟲的理論日最大捕食量低于前者，獵物處理時間長于前者。此外，孢子粉處理的東亞小花蝽5齡若蟲對二斑葉螨雌成蟲的日最大捕食量最低，獵物處理時間最長。

2.4 球孢白僵菌孢懸液和孢子粉處理的東亞小花蝽5齡若蟲對二斑葉螨雌成螨的搜尋效應(yīng)

根據(jù)功能反應(yīng)參數(shù)計算出不同處理、不同獵物密度下東亞小花蝽5齡若蟲的搜尋效應(yīng)指數(shù)(圖3)。 在不同處理下，東亞小花蝽5齡若蟲的搜尋效應(yīng)隨獵物密度的增加而呈線性趨勢下降(空白對照:y=-0.0020x+0.7812；陰性對照:y=-0.0020x+0.7566；低濃度孢懸液:y=-0.0014x+0.6984；常規(guī)濃度孢懸液:y=-0.0037x+0.7870；孢子粉:y=-0.0029x+0.6500)。用低濃度孢子懸浮液處理的東亞小花蝽5齡若蟲捕食二斑葉螨雌成螨時搜尋效應(yīng)隨獵物密度增加下降趨勢最緩。

圖3 球孢白僵菌孢懸液和孢子粉處理的東亞小花蝽5齡若蟲在不同獵物密度下對二斑葉螨雌成螨的搜尋效應(yīng)Fig. 3 The searching efficiency of the 5th instar nymphs of Orius sauteri treated with spore suspension and spore powderof Beauveria bassiana to the female adults of Tetranychus urticae under different prey densities

3 討論

廣譜性病原微生物通常會對天敵昆蟲造成不良影響，從而限制其與天敵昆蟲聯(lián)合應(yīng)用的防治效果(Ong and Vandermeer, 2015)。本研究結(jié)果中，用球孢白僵菌孢子粉處理后的東亞小花蝽成蟲羽化率最低，理論日最大捕食量最低，單頭獵物處理時間最長(表1)；與空白對照相比，孢子粉處理對東亞小花蝽5齡若蟲對二斑葉螨的捕食量影響顯著(圖2)，這表明孢子粉對該天敵的捕食行為有不利影響。雖然經(jīng)低濃度孢懸液處理后的東亞小花蝽5齡若蟲對二

表1 球孢白僵菌孢懸液和孢子粉處理的東亞小花蝽5齡若蟲對二班葉螨雌成螨的捕食功能反應(yīng)模型Table 1 Functional response models of the 5th instar nymphs of Orius sauteri treated with spore suspension andspore powder of Beauveria bassiana preying on female adults of Tetranychus urticae

斑葉螨雌成螨的實際捕食量略低于空白對照，但該處理下的理論日最大捕食量高于空白對照，單頭獵物處理時間最短，且搜尋效應(yīng)指數(shù)隨獵物密度升高下降趨勢最緩(表1; 圖3)。除球孢白僵菌孢子粉處理外，其余各處理下東亞小花蝽的羽化率無顯著差異(圖1)。因此，白僵菌對天敵的施用方式和濃度選擇是影響聯(lián)合應(yīng)用防效的重要因素。

通過擬合功能反應(yīng)模型，比較功能反應(yīng)參數(shù)可以直觀地了解高營養(yǎng)級的天敵昆蟲對靶標害蟲的控制潛能(王甦等, 2014)。本研究結(jié)果表明，經(jīng)不同劑型和濃度球孢白僵菌處理后的東亞小花蝽5齡若蟲對二斑葉螨雌成螨的捕食功能反應(yīng)均符合Holling Ⅱ型圓盤方程(表1)，即捕食量隨獵物密度的上升而上升，當(dāng)獵物密度達到一定程度時捕食量不再增加。這與東亞小花蝽對草地貪夜蛾Spodopterafrugiperda(代曉彥等, 2020; 孫貝貝等,2020)、桃蚜Myzuspericae(邢秀霞等, 2010)、西花薊馬F.occidentalis(張安盛等, 2008)和大豆蚜Aphisglycines(韓嵐嵐等, 2015)的捕食功能反應(yīng)結(jié)果趨勢一致。

白僵菌在實際應(yīng)用過程中常需人工拋灑或機器施藥，藥液或菌粉噴灑于植物葉面，而害蟲產(chǎn)卵一般主要在葉背，導(dǎo)致施用效率低等問題(楊芷等,2020)。而天敵昆蟲具有極強的活動和搜尋能力，作為生物防治的一項重要組成部分，在農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展中具有顯著的專業(yè)優(yōu)勢(張帆等, 2015)。Zhang等(2016, 2018)等用蟲生真菌環(huán)鏈棒束孢Isariacateniannulata與尼氏真綏螨Euseiusnicholsi聯(lián)合釋放防治二斑葉螨，發(fā)現(xiàn)環(huán)鏈棒束孢的孢子能大量附著在二斑葉螨身體各部，侵入體內(nèi)致其死亡，雖有少量孢子可附于尼氏真綏螨足上，有的孢子也能產(chǎn)生芽管，但不能侵入尼氏真綏螨體內(nèi)(Zhangetal., 2018)；環(huán)鏈棒束孢與尼氏真綏螨聯(lián)合較單一使用更能有效控制二斑葉螨田間種群(Zhangetal., 2016)。東亞小花蝽體型小、活動能力強，常出現(xiàn)在葉片背面和結(jié)構(gòu)復(fù)雜的花里。通過天敵攜帶白僵菌，利用其主動搜索和擴散能力，能夠在天敵捕食害蟲的同時，將白僵菌攜帶至藥液不易噴灑的地方，從而實現(xiàn)對害蟲的持續(xù)防控，提高二者的應(yīng)用效率(孫光芝等, 2004; Wuetal., 2016; 吳圣勇等, 2019)。本研究結(jié)果中低濃度球孢白僵菌孢懸液對東亞小花蝽的羽化率無顯著影響(圖1)，且與對照相比，其捕食能力未受影響(圖2)，因此通過東亞小花蝽攜帶球孢白僵菌來防治二斑葉螨具有可行性。

本研究初步證明了低濃度球孢白僵菌孢懸液處理東亞小花蝽后，其羽化率以及對二斑葉螨雌成蟲的捕食能力未受顯著影響。與田間推薦濃度的球孢白僵菌孢懸液相比，該低濃度孢懸液對東亞小花蝽較為安全，表明二者聯(lián)合應(yīng)用防治二斑葉螨具有潛在的實用價值。本研究是在可控條件下開展的，而在田間白僵菌的毒力會受到多種因素的影響(季香云和楊長舉, 2003; 仝亞娟等, 2010)，天敵的定殖是否受到影響仍有待進一步研究，所以需要進一步開展田間安全性和有效性評價試驗來挖掘利用東亞小花蝽攜帶白僵菌的控害效果。

致謝感謝吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院徐文靜老師提供球孢白僵菌菌種。