毛湘冰 胡海燕 陳代文 余 冰 何 軍 鄭 萍 虞 潔 羅鈞秋 羅玉衡 閻 輝

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營養(yǎng)研究所，動(dòng)物抗病營養(yǎng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動(dòng)物抗病營養(yǎng)與飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，動(dòng)物抗病營養(yǎng)四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 611130)

香菇(shiitake mushroom)是食用最廣泛的蘑菇之一，其口感好且營養(yǎng)價(jià)值高，多產(chǎn)于亞洲(如中國、日本)。香菇多糖(lentinan,LNT)是從香菇子實(shí)體中浸提得到的一種含支鏈分子的多糖，它的主要成分是β-(1→3)-D-葡聚糖，是具有生物活性的大分子物質(zhì)。近些年，相關(guān)的臨床和亞臨床研究表明，LNT能調(diào)節(jié)免疫功能和抗氧化能力，進(jìn)而發(fā)揮抗腫瘤和抗病毒的作用[1-5]。本團(tuán)隊(duì)前期的研究表明，飼糧添加LNT能改善斷奶大鼠生長(zhǎng)性能、抗氧化能力、盲腸微生物組成和空腸黏膜結(jié)構(gòu)[6]，并能改善斷奶仔豬的生長(zhǎng)性能和免疫力[7]。

作為一種雙鏈RNA病毒，輪狀病毒(rotavirus,RV)是導(dǎo)致幼齡動(dòng)物和嬰幼兒嚴(yán)重胃腸炎和腹瀉的主要病原之一；流行病學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，仔豬對(duì)RV極為易感，初生仔豬感染其的死亡率可達(dá)100%，盡管斷奶后死亡率會(huì)下降，但仍顯著影響仔豬生長(zhǎng)性能；此外，RV易感部位為消化道前段(如十二指腸、空腸)[8-10]；也有研究報(bào)道，RV也會(huì)侵襲回腸，并損傷回腸健康[11]。本團(tuán)隊(duì)前期的研究已表明，飼糧添加LNT可以改善RV攻毒對(duì)仔豬空腸屏障功能的負(fù)面影響[12]。但目前對(duì)于飼糧添加LNT是否也能夠緩解RV攻毒對(duì)仔豬回腸健康產(chǎn)生的負(fù)面影響尚未見報(bào)道。因此，本試驗(yàn)旨在探索飼糧中添加LNT是否能緩解RV攻毒仔豬回腸屏障功能的負(fù)面影響，以期進(jìn)一步完善LNT預(yù)防RV感染的可能機(jī)制，為L(zhǎng)NT在動(dòng)物生產(chǎn)上的應(yīng)用和推廣提供理論和試驗(yàn)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

LNT購于四川某生物科技有限公司，其有效成分(多糖)含量>30%；RV為OSU(G5P9)毒株(ATCC#VR-893)，購自國家獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物與設(shè)計(jì)

試驗(yàn)選取28頭體重為(7.51±1.37)kg、健康的21日齡斷奶的雜交(“杜×長(zhǎng)×大”)閹公豬，采用2×2因子試驗(yàn)設(shè)計(jì)，即飼糧處理(飼糧添加0或84 mg/kg LNT)和RV攻毒(灌服RV或無菌培養(yǎng)液)。全部仔豬采用代謝籠(1.5 m×0.7 m×1.0 m)飼養(yǎng)。試驗(yàn)第1天，將所有仔豬進(jìn)行空腹稱重，按遺傳背景和體重相近原則，將仔豬隨機(jī)分為2個(gè)處理(n=14)，分別飼喂添加不同劑量LNT的飼糧。試驗(yàn)第15天，所有仔豬在灌服5 mL的100 mmol/L碳酸氫鈉(NaHCO3)溶液20 min后，從以上2個(gè)飼糧處理中隨機(jī)選取7頭仔豬進(jìn)行RV攻毒，即經(jīng)口一次性灌服RV液(106TCID50/mL)4 mL，剩余仔豬經(jīng)口一次性灌服無菌培養(yǎng)液4 mL。試驗(yàn)期為19 d。

1.3 試驗(yàn)飼糧及營養(yǎng)水平

試驗(yàn)使用的基礎(chǔ)飼糧為玉米-豆粕型，依據(jù)NRC(2012)7～11 kg仔豬營養(yǎng)需要進(jìn)行設(shè)計(jì)和配制，其組成及營養(yǎng)水平見表1。而試驗(yàn)飼糧是在基礎(chǔ)飼糧中添加0或84 mg/kg LNT進(jìn)行配制，且LNT是以等量替代基礎(chǔ)飼糧中的玉米淀粉進(jìn)行加入。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1.4 飼養(yǎng)管理

所有的動(dòng)物試驗(yàn)于四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營養(yǎng)研究所教學(xué)科研基地代謝室進(jìn)行。試驗(yàn)的預(yù)試期為2 d，使所有仔豬適應(yīng)粉狀飼糧和飼養(yǎng)環(huán)境。試驗(yàn)期內(nèi)，豬舍的溫度為27～30 ℃，相對(duì)濕度低于80%；每日飼喂仔豬4次(08:00、12:00、16:00和20:00)，以每次采食后料槽略有余料為度，自由飲水。試驗(yàn)期間消毒、清掃按常規(guī)程序進(jìn)行，保持豬舍通風(fēng)、清潔。

1.5 RV培養(yǎng)

本試驗(yàn)采用恒河猴腎細(xì)胞系(MA104)進(jìn)行RV培養(yǎng)、強(qiáng)化和病毒滴度測(cè)定，具體方法按Mao等[13]進(jìn)行。

1.6 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.6.1 腹瀉指數(shù)

RV攻毒后，對(duì)每頭仔豬進(jìn)行糞便評(píng)分(0，正常；1，黏性糞便；2，半液體狀糞便；3，液體狀糞便)，每天2次。用于計(jì)算仔豬的腹瀉指數(shù)，具體方法參考Mao等[13]。

腹瀉指數(shù)=(∑糞便評(píng)分)/n。

式中:n為重復(fù)數(shù)。

1.6.2 樣品采集

試驗(yàn)第20天，對(duì)所有仔豬進(jìn)行空腹采血10 mL，室溫靜置30 min，3 000 r/min離心15 min，分離血清，保存于-20 ℃。采血后，以心臟注射戊巴比妥鈉(50 mg/kg BW)和頸靜脈放血的方法屠宰所有仔豬，迅速分離回腸，冰生理鹽水沖洗，用載玻片刮取回腸黏膜，液氮速凍，保存于-80 ℃；同時(shí)，收集回腸食糜，液氮速凍，保存于-80 ℃。

1.6.3 回腸黏膜中RV特異性抗體(rotavirus antibody,RV-Ab)、分泌型免疫球蛋白A(secreting immunoglobulin A,sIgA)和細(xì)胞因子含量的檢測(cè)

稱取約1 g回腸黏膜組織，按1∶9(質(zhì)量體積比)加入預(yù)冷的生理鹽水，在冰上勻漿，勻漿液于4 ℃條件下5 000×g離心10 min，取上清液用于RV-Ab(免疫球蛋白M)、sIgA、白細(xì)胞介素-2(interleukin 2,IL-2)、白細(xì)胞介素-4(interleukin 4,IL-4)和干擾素-γ(interferon γ,IFN-γ)含量的測(cè)定，具體測(cè)定采用上海諾淵有限公司生產(chǎn)的酶聯(lián)免疫吸附試劑盒完成，操作按照試劑盒說明書進(jìn)行；上清液中蛋白含量的測(cè)定采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒，具體的測(cè)定方法參照試劑盒說明書。

1.6.4 血清和回腸黏膜抗氧化能力的測(cè)定

稱取約1 g回腸黏膜組織，按1∶9(質(zhì)量體積比)加入預(yù)冷的生理鹽水，在冰上勻漿，勻漿液于4 ℃條件下5 000×g離心10 min，取上清液用于檢測(cè)。

血清和回腸黏膜組織上清液樣品中丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量和總抗氧化能力(total antioxidant capacity,T-AOC)的測(cè)定采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒，具體的測(cè)定方法參照試劑盒說明書。

1.6.5 回腸黏膜中細(xì)胞凋亡、黏液蛋白、緊密連接蛋白和抗菌肽基因mRNA相對(duì)表達(dá)量的測(cè)定

回腸黏膜中B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2相關(guān)X蛋白(B-cell lymphoma/leukaemia 2-associated X protein,Bax)、B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma/leukaemia 2,Bcl-2)、閉合蛋白(occludin)、閉鎖小帶蛋白-1(zonula occludens 1,ZO-1)、黏液蛋白1(mucin 1)、黏液蛋白2(mucin 2)、豬β防御素1(porcine β-defensin 1,pBD1)、豬β防御素2(porcine β-defensin 2,pBD2)、豬β防御素3(porcine β-defensin 3,pBD3)和Protegrins 1-5(PG1-5)的mRNA相對(duì)表達(dá)量，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)測(cè)定，具體方法參考Mao等[13]。

1.6.6 回腸食糜中菌群數(shù)量的測(cè)定

回腸食糜中菌群(總菌、乳酸桿菌、雙歧桿菌和大腸桿菌)的數(shù)量采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)測(cè)定，具體方法參考Mao等[12]。

1.7 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗(yàn)測(cè)得的所有數(shù)據(jù)采用Excel 2016進(jìn)行初步整理。除了腹瀉指數(shù)的數(shù)據(jù)外，其他數(shù)據(jù)采用SAS 8.1軟件中雙因素方差分析，模型主效應(yīng)包括RV攻毒和飼糧添加LNT以及二者之間的互作效應(yīng)，差異顯著時(shí)進(jìn)行Duncan氏法多重比較，各指標(biāo)以每個(gè)重復(fù)為單位統(tǒng)計(jì)，數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。以P<0.05為差異顯著判定標(biāo)準(zhǔn)，以0.05≤P<0.10為有差異趨勢(shì)的判定標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1 飼糧添加LNT對(duì)RV攻毒斷奶仔豬腹瀉指數(shù)和回腸黏膜中RV-Ab含量的影響

由圖1可知，未攻毒仔豬腹瀉指數(shù)均為0，RV攻毒提高了斷奶仔豬的腹瀉指數(shù)，飼糧添加LNT降低了RV攻毒誘導(dǎo)的腹瀉指數(shù)。由表2可知，RV攻毒顯著提高了斷奶仔豬回腸黏膜中RV-Ab的含量(P<0.05)。

圖1 飼糧添加LNT對(duì)RV攻毒斷奶仔豬腹瀉情況的影響

2.2 飼糧添加LNT對(duì)RV攻毒斷奶仔豬回腸黏膜中sIgA和細(xì)胞因子含量的影響

由表2可知，RV攻毒顯著降低了斷奶仔豬回腸黏膜中sIgA、IL-4和IFN-γ的含量(P<0.05)，顯著提高了回腸黏膜中IL-2的含量(P<0.05)；飼糧添加LNT顯著提高了斷奶仔豬回腸黏膜中sIgA和IFN-γ的含量(P<0.05)，顯著降低了回腸黏膜中IL-2的含量(P<0.05)；且在RV攻毒仔豬中，飼糧添加LNT顯著緩解了RV攻毒對(duì)回腸黏膜中sIgA、IFN-γ和IL-2含量的影響(P<0.05)。

表2 飼糧添加LNT對(duì)RV攻毒斷奶仔豬回腸黏膜中sIgA、RV-Ab和細(xì)胞因子含量的影響

2.3 飼糧添加LNT對(duì)RV攻毒斷奶仔豬血清和回腸黏膜抗氧化能力的影響

由表3可知，RV攻毒顯著降低了斷奶仔豬血清和回腸黏膜的T-AOC(P<0.05)，顯著提高了血清和回腸黏膜中MDA的含量(P<0.05)；飼糧添加LNT顯著提高了斷奶仔豬血清和回腸黏膜的T-AOC(P<0.05)，顯著降低了回腸黏膜中MDA的含量(P<0.05)，有降低血清中MDA含量的趨勢(shì)(P=0.06)；且在RV攻毒仔豬中，飼糧添加LNT顯著緩解了RV攻毒對(duì)血清和回腸黏膜T-AOC及回腸黏膜中MDA含量的影響(P<0.05)。

表3 飼糧添加LNT對(duì)RV攻毒斷奶仔豬血清和回腸黏膜抗氧化能力的影響

2.4 飼糧添加LNT對(duì)RV攻毒斷奶仔豬回腸黏膜中細(xì)胞凋亡、黏液蛋白、緊密連接蛋白和抗菌肽基因mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響

由表4可知，RV攻毒顯著提高了斷奶仔豬回腸黏膜中Bax的mRNA相對(duì)表達(dá)量(P<0.05)，顯著降低了回腸黏膜中Bcl-2、occludin、ZO-1、mucin 1、mucin 2、pBD1、pBD2、pBD3和PG1-5的mRNA相對(duì)表達(dá)量(P<0.05)；飼糧添加LNT顯著提高了斷奶仔豬回腸黏膜中Bcl-2、occludin、ZO-1、mucin 1、mucin 2、pBD1、pBD2、pBD3和PG1-5的mRNA相對(duì)表達(dá)量(P<0.05)；且在RV攻毒仔豬中，飼糧添加LNT顯著緩解了RV攻毒對(duì)回腸黏膜中occludin、ZO-1、mucin 1、mucin 2、pBD2、pBD3和PG1-5的mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響(P<0.05)。

表4 飼糧添加LNT對(duì)RV攻毒斷奶仔豬回腸黏膜中細(xì)胞凋亡、緊密連接蛋白、黏液蛋白和抗菌肽基因表達(dá)的影響

2.5 飼糧添加LNT對(duì)RV攻毒斷奶仔豬回腸食糜中菌群數(shù)量的影響

由表5可知，RV攻毒顯著降低了斷奶仔豬回腸食糜中雙歧桿菌、乳酸菌和總菌的數(shù)量(P<0.05)；但飼糧添加LNT對(duì)斷奶仔豬回腸食糜中菌群數(shù)量無顯著影響(P>0.05)。

表5 飼糧添加LNT對(duì)RV攻毒斷奶仔豬回腸食糜中菌群數(shù)量的影響

3 討 論

在誘導(dǎo)幼齡動(dòng)物和嬰幼兒胃腸炎和腹瀉的病原中，RV是主要的病毒性病原之一[8-10]。在目前的仔豬試驗(yàn)中，RV攻毒提高了斷奶仔豬的腹瀉指數(shù)，影響了回腸的炎性細(xì)胞因子水平和食糜中有益菌群數(shù)量，損傷了回腸的抗氧化能力和黏膜屏障功能，這與本課題組前期的研究結(jié)果[14-16]一致。除此之外，本試驗(yàn)結(jié)果表明，RV攻毒顯著提高了斷奶仔豬回腸黏膜中RV-Ab的含量；且對(duì)于生長(zhǎng)性能的觀察發(fā)現(xiàn)，RV攻毒還顯著降低了斷奶仔豬的生長(zhǎng)性能[17]。由此可知，本研究成功構(gòu)建了斷奶仔豬RV感染模型；而飼糧添加LNT可降低斷奶仔豬腹瀉指數(shù)，并在一定程度縮短腹瀉病程，以及改善了RV攻毒斷奶仔豬的生長(zhǎng)性能[17]，這說明其可改善仔豬機(jī)體(尤其是腸道黏膜)的健康。

腸道的免疫功能是機(jī)體抵御病原入侵的重要屏障之一。免疫球蛋白(尤其是sIgA)在保護(hù)腸道黏膜免受病原侵襲和抑制病毒增殖等方面發(fā)揮著十分重要的作用[18]。除此之外，細(xì)胞因子也是腸道免疫功能的重要組成成分。Th1/Th2細(xì)胞因子的平衡可以有效地維持免疫功能[19]；且IFN-γ是一種廣譜的抗病毒成分，能通過誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生抗病毒蛋白抑制病毒增殖[20]。內(nèi)源性抗菌肽的產(chǎn)生是先天性免疫的組成成分，而防御素是一類由白細(xì)胞和上皮細(xì)胞產(chǎn)生的內(nèi)源性抗菌肽，其在抗病毒入侵中也發(fā)揮了重要的作用[21]。本試驗(yàn)的結(jié)果表明，在RV攻毒仔豬中，飼糧添加LNT提高了斷奶仔豬回腸黏膜中sIgA和IFN-γ含量，上調(diào)了回腸黏膜中pBD2、pBD3和PG1-5的mRNA表達(dá)，緩解了RV攻毒對(duì)回腸黏膜中IL-2和IL-4含量的影響。這些表明，飼糧添加LNT改善了仔豬回腸黏膜免疫功能，進(jìn)而緩解了RV感染。

物理屏障和化學(xué)屏障也是腸道屏障功能的重要組成成分，物理屏障主要體現(xiàn)在腸道黏膜上皮細(xì)胞間的緊密連接，而腸道黏膜膠質(zhì)層是化學(xué)屏障的主要來源[22]。一般來說，腸道上皮細(xì)胞間緊密連接的狀態(tài)可由相關(guān)緊密連接蛋白表達(dá)量說明[23]；腸道黏膜膠質(zhì)層的主要成分是由黏膜上皮細(xì)胞(尤其是杯狀細(xì)胞)產(chǎn)生的黏液蛋白[24]。本試驗(yàn)的結(jié)果表明，飼糧添加LNT可緩解RV攻毒對(duì)仔豬回腸黏膜中上皮緊密連接蛋白(ZO-1和occludin)和黏液蛋白(mucin 1和mucin 2)基因表達(dá)的影響，那么，LNT防止RV侵襲回腸可能與其增強(qiáng)腸道黏膜物理屏障和化學(xué)屏障有關(guān)。

機(jī)體的氧化還原平衡與細(xì)胞(乃至生物體本身)的健康息息相關(guān)，細(xì)胞、組織和器官內(nèi)的氧化應(yīng)激將誘導(dǎo)凋亡的發(fā)生，進(jìn)而破壞組織和器官的相關(guān)功能[25]。起始于細(xì)胞線粒體內(nèi)的凋亡受到Bcl-2家族蛋白的調(diào)節(jié)，其中，就包含抗凋亡蛋白(如Bcl-2)和促凋亡蛋白(如Bax)[26-27]。而本實(shí)驗(yàn)室前期的試驗(yàn)表明，RV感染引起的腸道屏障功能(尤其是物理屏障和化學(xué)屏障)損傷主要源于其通過破壞腸道上皮細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)導(dǎo)致了細(xì)胞凋亡的增加[28]。本試驗(yàn)的結(jié)果表明，在RV感染仔豬中，飼糧添加LNT提高了仔豬血清T-AOC，從而提高了仔豬回腸黏膜的抗氧化能力，改善了RV誘導(dǎo)的氧化還原狀態(tài)失衡；并提高了仔豬回腸黏膜中Bcl-2的mRNA相對(duì)表達(dá)量。因此，LNT改善RV攻毒仔豬回腸屏障功能(尤其是物理屏障和化學(xué)屏障)與其緩解氧化還原狀態(tài)失衡誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)室前期以大鼠和斷奶仔豬為對(duì)象的研究表明，飼糧添加LNT可調(diào)節(jié)盲腸內(nèi)容物菌群組成(即提高有益菌的數(shù)量，降低有害菌的數(shù)量)[6,12]。但本試驗(yàn)的結(jié)果表明，飼糧添加LNT對(duì)回腸食糜中總菌、大腸桿菌、乳酸菌和雙歧桿菌的數(shù)量均未產(chǎn)生顯著影響。這可能說明，LNT對(duì)這些測(cè)定的腸道菌群調(diào)節(jié)作用主要集中于后腸段(即大腸)，而LNT對(duì)整個(gè)腸段中微生物菌群的影響還有待于通過高通量測(cè)序的方式進(jìn)行深入研究。

基于本試驗(yàn)中LNT可改善回腸屏障功能，緩解RV侵入回腸，與本實(shí)驗(yàn)室前期進(jìn)行的LNT處理調(diào)節(jié)RV感染仔豬空腸屏障功能的研究結(jié)果[7,12]對(duì)比，可以發(fā)現(xiàn)LNT在回腸中的改善效果并未達(dá)到其在空腸中的效果。分析其原因，可能在于RV感染對(duì)回腸屏障功能的負(fù)面影響弱于其對(duì)空腸的影響(即RV侵襲部位主要在腸道的前段)。

4 結(jié) 論

飼糧添加LNT可以緩解RV感染誘導(dǎo)的斷奶仔豬腹瀉，這一作用可能源于其改善了回腸黏膜上皮細(xì)胞抗氧化能力，減弱了RV誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，進(jìn)而強(qiáng)化了回腸屏障功能(包括免疫功能、物理屏障和化學(xué)屏障)。