門志雯，崔佰吉，蘇琳婷，李松巖，孫海寧，肖 雯，歐陽靜，沈 楠*，劉慶波 (.吉林醫(yī)藥學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，吉林 吉林 3203；2.吉林省吉林中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，吉林 吉林 3202)

山楂是藥食兩用水果，富含黃酮類、多糖、有機(jī)酸等成分，可促進(jìn)消化、開胃健脾，具有降血壓、降血脂、抗菌、抗癌等作用[1]，被廣泛應(yīng)用于食品及醫(yī)藥保健品領(lǐng)域[2]。猴頭菇也被稱為猴頭菌，營養(yǎng)豐富[3]，既可入藥也可食用[4],具有促進(jìn)消化、抗氧化、調(diào)養(yǎng)身體作用[5],還可潤腸通便、滋陰養(yǎng)腎、健脾養(yǎng)胃[6]。本研究預(yù)采用山楂和猴頭菇作為原料，以總多糖為基礎(chǔ)原料，經(jīng)過發(fā)酵工藝制備一種復(fù)合性功能飲料。由于發(fā)酵工藝對(duì)多糖的含量變化具有一定的影響，為保證后續(xù)工作能夠順利進(jìn)行，本研究采用單因素結(jié)合響應(yīng)面設(shè)計(jì)的方法優(yōu)化山楂、猴頭菇總多糖的提取工藝，為山楂、猴頭菇功能飲料的開發(fā)提供參考。

1 儀器與試劑

UV-1800紫外分光光度計(jì)(日本島津)；FA224電子天平(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司)；WHY-2恒溫培養(yǎng)振蕩器(常州金壇中旺儀器制造有限公司)；TD4實(shí)驗(yàn)資料C臺(tái)式低速離心機(jī)(鹽城市凱特實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；Scientz-12SN冷凍干燥機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)。

猴頭菇子實(shí)體購自杭州眾芝康菇生物技術(shù)有限公司；山楂購自隆盛果業(yè)種植基地；葡萄糖(20200312)購自天津渤化化學(xué)試劑有限公司；其他試劑均為分析純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 總糖含量的測定方法

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定

總糖的含量測定以葡萄糖為基準(zhǔn)物質(zhì)，硫酸-苯酚顯色法進(jìn)行測定。取葡萄糖適量，加水溶解，配置成葡萄糖濃度為0.016 g/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。分別精密吸取儲(chǔ)備液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL置5 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，混勻。精密吸取各標(biāo)準(zhǔn)品溶液2 mL置試管中，分別加入6%苯酚溶液1.2 mL，硫酸6.5 mL，混勻后充分反應(yīng)60 min，在490 nm波長下測定吸光度，以葡萄糖濃度和吸光度做標(biāo)準(zhǔn)曲線。回歸方程為：y=49.4x-0.043，R2=0.999 0，線性關(guān)系良好，可用于測定待測物質(zhì)中總糖的含量。

2.1.2 樣品總多糖的含量測定

取制備好的樣品溶液2 mL置試管中，加入6%苯酚溶液1.2 mL，混勻，加入硫酸6.5 mL，混勻后充分反應(yīng)60 min，在490 nm波長下測定吸光度，吸光度帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算總多糖的含量。

2.2 多糖的提取

山楂和猴頭菇分別切成小塊，置于恒溫鼓風(fēng)干燥箱中干燥3 h，粉碎，過40目篩。稱取山楂粗粉和猴頭菇粗粉各10 g，置三角瓶中，加入一定比例的蒸餾水，在恒溫水浴鍋中加熱提取，提取液過濾，重復(fù)三次提取，合并提取液，減壓濃縮提取液，冷凍干燥即得總多糖。

2.3 多糖的提取工藝優(yōu)化

2.3.1 提取料液比例考察

固定提取溫度60 ℃、時(shí)間45 min，測定不同料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30，按照“2.2”項(xiàng)下方法提取，按照“2.1.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行多糖的含量測定。結(jié)果表明，總多糖的提取量隨著提取溶劑的增加而增加，且多糖含量在1∶20條件下達(dá)到峰值，增加料液比例后，多糖含量增加的效果不明顯，所以選擇最佳的料液比例為1∶20進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。

2.3.2 提取時(shí)間考察

按照“2.3.2”項(xiàng)下各自的最佳料液比、溫度60 ℃，分別采用45、60、90、120、150 min，考察提取時(shí)間對(duì)多糖含量的影響。按照“2.2”項(xiàng)下方法提取，按照“2.1.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行多糖的含量測定。結(jié)果表明，隨著提取時(shí)間的增加，多糖的含量也隨之增加，但是增加的幅度不是很大，最后選擇最佳提取時(shí)間為90 min。

2.3.3 提取溫度的考察

按照“2.3.2”和“2.3.3”項(xiàng)下最佳的提取條件，分別采用50、60、70、80、90 ℃，按照“2.2”項(xiàng)下方法提取，按照“2.1.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行多糖的含量測定。結(jié)果表明，最佳提取溫度為80 ℃。

2.3.4 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

通過單因素實(shí)驗(yàn)，初步確定最佳的料液比、提取溫度、提取時(shí)間三個(gè)因素，根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的最佳實(shí)驗(yàn)條件的基礎(chǔ)上，分別選取不同的水平數(shù)，采用響應(yīng)面設(shè)計(jì)，選取三個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，因素水平表見表1，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3，置信區(qū)間及二項(xiàng)式擬合系數(shù)見表4，因素交互作用對(duì)多糖提取影響見圖1、2。

表3可見,模型F值為7.23，表明模型顯著。只有2.11%的可能性，P值小于0.05表示模型項(xiàng)顯著,大于0.1表示模型項(xiàng)不顯著。在這種情況下A、AB、BC、B是重要的模型項(xiàng)。整體模型設(shè)計(jì)合理，各因素顯著性明顯，可以用于本研究的數(shù)據(jù)分析及預(yù)測。同時(shí)各因素之間的相互作用對(duì)于提取的結(jié)果具有一定的影響性。

由表4，可以看出系數(shù)估計(jì)值表示在所有剩余因子保持不變時(shí)，每單位因子變化的響應(yīng)的預(yù)期變化。在正交設(shè)計(jì)中，截距是所有運(yùn)行的總體平均響應(yīng)。這些系數(shù)是根據(jù)因素設(shè)置對(duì)平均值進(jìn)行的調(diào)整。當(dāng)因子正交時(shí)，VIF應(yīng)為1。VIF大于1時(shí)表示為多共線，VIF越高，相關(guān)因素越嚴(yán)重。一般來說，低于10的VIFs是可信的，綜合分析本模型的預(yù)測結(jié)果是可信的，模型設(shè)計(jì)是合理的。

表 1 因素水平表

表 2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)結(jié)果表

表 3 方差分析結(jié)果表

一般情況下植物中有效成分的提取受多個(gè)因素共同制約，本實(shí)驗(yàn)中多糖的提取不僅與所選的因素有直接關(guān)系，因素之間也存在著相互作用的關(guān)系。由圖1的結(jié)果可以看出：B-C因素的交互作用對(duì)多糖的含量提取的影響作用最為明顯，A-C因素見的交互作用影響最小。圖2的坡度曲線也印證了2D結(jié)果圖給出的信息，A-B,B-C的曲面圖坡度均較大，A-C曲面度接近平面。說明因素間交互作用的影響和因素A，B單獨(dú)作用是有著同等重要的作用。

圖 1 因素交互作用對(duì)多糖提取影響2D圖

圖 2 因素交互作用對(duì)多糖提取影響3D圖

預(yù)設(shè)最佳實(shí)驗(yàn)多糖含量為最高值的10倍，由軟件分析后，得出最佳實(shí)驗(yàn)方案的32種預(yù)測方案，根據(jù)給出的最佳方案的設(shè)計(jì)可以看出，最佳實(shí)驗(yàn)方案為A=1,B=-0.8,C=-1。

2.3.5 工藝驗(yàn)證

分別按照山楂多糖、猴頭菇多糖的最佳提取工藝，即：料液比1∶25，提取時(shí)間66 min，提取溫度70 ℃。按照“2.2”項(xiàng)下方法提取，按照“2.1.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行多糖的含量測定，平行提取3份，進(jìn)行工藝驗(yàn)證。驗(yàn)證結(jié)果SD為1.16，可以看出實(shí)際結(jié)果與預(yù)測結(jié)果吻合，方法重復(fù)性良好，工藝穩(wěn)定。

3 討 論

本研究用響應(yīng)面設(shè)計(jì)進(jìn)行了山楂、猴頭菇功能飲料中總多糖的提取最佳工藝的研究。研究表明二者多糖的提取過程中料液比是影響其提取率的主要因素。雖然料液比例的加大有利于多糖的提取，但是隨著多糖被提取完全，為保證后續(xù)工作順利進(jìn)行，選擇最佳的比例比較重要。同時(shí)各因素之間的交互作用也比較明顯，且影響程度比較大。實(shí)驗(yàn)過程中還發(fā)現(xiàn)由于山楂本身含有多酸性物質(zhì)，體系的pH值的變化也有可能引起多糖提取量的變化，但不顯著。但其變化是否引起多糖種類的變化還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。