孫興雅，劉 馨

錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，遼寧錦州 121000

口腔癌是全球最常見的惡性腫瘤之一[1]，其中90%的病理類型是鱗狀細(xì)胞癌[2]，目前舌癌的治療手段以手術(shù)根除并結(jié)合術(shù)后放、化療為主[3]，盡管醫(yī)療水平飛速發(fā)展，但術(shù)后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移以及手術(shù)影響的其他頭頸部功能的喪失極大地危害著患者的生活質(zhì)量。有生物活性次級代謝物的天然產(chǎn)物是開發(fā)新藥的重要候選成分[4]，蛇床子素(osthole，OST)是從中藥蛇床子中提取的一類香豆素類衍生物，除具有廣泛的藥理活性，包括抗氧化、抗炎、抗感染、抗過敏、治療骨質(zhì)疏松、鎮(zhèn)痛、殺蟲等作用外，還具有良好的抗腫瘤效果[5]，但對口腔癌細(xì)胞的研究報道較少，本研究主要探討OST對人舌鱗癌Tca8113細(xì)胞凋亡、自噬的影響及分子機(jī)制。

材料和方法

材料CO2培養(yǎng)箱[賽默飛世爾科技(中國)有限公司]，熒光顯微鏡(奧林巴斯中國有限公司)，流式細(xì)胞儀(美國碧迪公司)，電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀(安瑪西亞中國有限公司)；人舌鱗癌Tca8113細(xì)胞由錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院外科重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室贈予；OST購于南京景竹生物科技有限公司(分子質(zhì)量：244.29，純度>98%，CAS NO：484- 12- 8，分子式：C15H16O3)，溶于二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)，且DMSO濃度<0.1%；RPMI 1640培養(yǎng)基、青鏈霉素雙抗(?？寺∩锘瘜W(xué)制品北京有限公司)；胎牛血清；MTT(西格瑪奧德里奇上海貿(mào)易有限公司)；結(jié)晶紫(北京索萊寶科技有限公司)；流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞凋亡試劑盒(上海貝博生物科技有限公司)；Hoechst 33242染液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、聚丙烯酰胺凝膠配置試劑盒、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔二抗IgG(H+L)(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，Bax 、Bcl- 2、活化的半胱氨酸蛋白酶3(美國細(xì)胞信號通路)LC3、P62、GAPDH(英國劍橋大學(xué)抗體)。

細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞生長于RPMI 1640培養(yǎng)基(內(nèi)含10%胎牛血清、1%青鏈霉素雙抗)在5%CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，每個培養(yǎng)皿5～7 ml培養(yǎng)液，每2～3天換1次液體，細(xì)胞長到培養(yǎng)皿底的80%～90%根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求進(jìn)行傳代或者凍存，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

細(xì)胞分組及給藥方法取對數(shù)生長期Tca8113細(xì)胞分為對照組和4個劑量的實(shí)驗(yàn)組。對照組不加藥，實(shí)驗(yàn)組分別加入40、80、120、160 μmol/L的OST。

MTT檢測細(xì)胞存活率取對數(shù)期的細(xì)胞，消化、計數(shù)，調(diào)整密度為每孔5×103個細(xì)胞接種于96孔板中，24 h后，按分組要求加入培養(yǎng)液及實(shí)驗(yàn)藥物，使蛇床子素的目的濃度分別為0、20、40、80、120、160、200 μmol/L OST，對照組無藥物處理，空白組加入培養(yǎng)基，使各孔體積均為100 μl，終止培養(yǎng)前4 h每孔加入MTT(5 mg/ml)溶液20 μl，4 h后吸凈培養(yǎng)基，加入150 μl的DMSO，水平搖床混勻后用酶標(biāo)儀490 nm處測定各孔吸光度值，計算細(xì)胞生長抑制率。

集落形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞克隆形成能力以每孔700個細(xì)胞接種在6孔板，按細(xì)胞分組方法處理細(xì)胞，設(shè)置對照組，每2～3天換液，培養(yǎng)基內(nèi)仍含原濃度藥物，作用周期為1～2周，當(dāng)鏡下30～50個細(xì)胞數(shù)的細(xì)胞團(tuán)時終止培養(yǎng)。甲醇固定20 min，PBS漂洗幾次，0.1%結(jié)晶紫染色20 min，PBS漂洗干凈，晾干拍照并計算克隆形成率。

Hoechst33342染色觀察細(xì)胞核凋亡形態(tài)取對數(shù)生長期細(xì)胞，以每孔1×104個細(xì)胞接種于6孔板，待貼壁后，按細(xì)胞分組方法處理細(xì)胞，并設(shè)置對照組，24 h后加入2 ml配好的Hoechst33342工作液，37 ℃避光染色30 min，熒光顯微鏡觀察細(xì)胞核著色情況并保留圖像。

流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡取對數(shù)生長期細(xì)胞加入含有蛇床子素藥物的培養(yǎng)基，濃度分別為40、80、120和160 μmol/L OST，設(shè)置不含藥空白對照，作用24 h，用胰酶常規(guī)消化，冷PBS洗2遍，1200 r/min(r=10 cm)離心 4 min，用400 μl緩沖液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×106細(xì)胞/ml，加入5 μl抗凝血蛋白膜黏連蛋白- 5-異硫氰酸熒光素染色液，混勻，于避光條件下孵育15 min，再加入5～10 μl 碘化丙啶混勻，于避光條件下孵育5 min，于1 h內(nèi)通過流式細(xì)胞儀檢測。Q1區(qū)表示壞死細(xì)胞，Q2區(qū)表示晚期凋亡細(xì)胞，Q3區(qū)表示活細(xì)胞，Q4區(qū)表示早期凋亡細(xì)胞，總凋亡率為Q2和Q4區(qū)的總和。

Western blot檢測凋亡和自噬相關(guān)蛋白表達(dá)細(xì)胞分組及給藥情況同上，收集給藥24 h細(xì)胞樣，在冰上用細(xì)胞裂解液(細(xì)胞裂解液：蛋白酶抑制劑=100∶1)提取各組細(xì)胞總蛋白，通過BCA測定蛋白濃度，蛋白變性10 min。行聚丙烯酰胺凝膠電泳1.5 h，恒流280 mA、1 h轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜，5%牛血清白蛋白室溫封閉1.5 h，一抗(Bax 、Bcl- 2、活化的半胱氨酸蛋白酶3、GAPDH、LC3、P62)4 ℃過夜，洗滌緩沖液洗膜3次，二抗室溫孵育1 h，洗膜，超敏發(fā)光顯色試劑盒顯色，用Image J分析條帶灰度值。

統(tǒng)計學(xué)處理統(tǒng)計分析由 SPSS 22.0軟件完成，兩獨(dú)立樣本采用t檢驗(yàn)，多組間比較用單因素方差分析，結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

OST抑制Tca8113細(xì)胞增殖MTT結(jié)果顯示，與對照組(99.60±0.89)%比較，20、40、80、120、160、200 μmol/L OST對Tca8113細(xì)胞的增殖抑制率分別為(93.46±1.72)%(t=2.931，P=0.032)、(78.94±6.73)%(t=9.861，P=0.000)、(66.77±1.44)%(t=15.670，P=0.000)、(59.97±3.89)%(t=18.910，P=0.000)、(43.77±2.45)%(t=26.640，P=0.000)、(39.15±2.33)%(t=28.850，P=0.000)。對細(xì)胞的增殖抑制作用隨著OST濃度的增大而增大，在24 h時OST對Tca8113細(xì)胞的增殖抑制率為154.1 μmol/L。

OST對Tca8113細(xì)胞克隆形成能力的影響作用1周后，與對照組(99.00±1.00)%相比較，40、80、120、160 μmol/L OST對Tca8113細(xì)胞的克隆增殖能力為(91.10±2.82)%(t=3.178，P=0.031)、(84.17±3.75)%(t=5.967，P=0.000)、(32.00±4.59)%(t=26.950，P=0.000)、(8.67±1.53)%(t=36.340，P=0.000)(圖1)。

OST對Tca8113細(xì)胞凋亡的影響Hoechst33342染色結(jié)果顯示，對照組Tca8113細(xì)胞核形態(tài)完整，在熒光顯微鏡下發(fā)出微弱的藍(lán)光，熒光分布均勻；經(jīng)OST處理后，細(xì)胞核固縮明顯，染色質(zhì)皺縮，胞核碎裂，隨OST濃度的增大亮而致密的藍(lán)色熒光越明顯(圖2)。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，24 h后，對照組凋亡率(3.00±0.61)%，在40、80、120、160 μmol/L OST作用于細(xì)胞后，凋亡率分別為(11.23±5.01)%(t=3.146，P=0.033)、(15.13±1.90)%(t=4.631，P=0.003)、(28.70±2.76)%(t=9.795，P=0.000)、(46.30±3.87)%(t=16.490，P=0.000)(圖3)。

OST：蛇床子素

圖2 Hoechst33342染色檢測不同濃度OST對Tca8113凋亡能力的影響

PI：碘化丙啶；FITC：5-異硫氰酸熒光素

OST對Tca8113細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)Western blot 結(jié)果顯示，在40、80、120、160 μmol/L OST作用下，Tca8113細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax表達(dá)水平(39.21±1.11)%(t=3.428，P=0.021)、(44.50±1.46)%(t=5.443，P=0.001)、(48.34±1.00)%(t=6.902，P=0.000)、(58.80±6.46)%(t=10.880，P=0.000)均明顯高于對照組(30.20±2.40)%(圖4)。在40、80、120和160 μmol/L OST作用后，凋亡相關(guān)蛋白活化的半胱氨酸蛋白酶3的表達(dá)水平分別為(70.80±10.32)%、(83.23±4.53)%、(106.40±8.95)%、(110.40±0.92)%，其中80(t=4.933，P=0.002)、120(t=9.186，P=0.000)、160 μmol/L OST(t=9.928，P=0.000)均高于對照組(56.37±3.80)%，而40 μmol/L OST與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.651，P=0.074)(圖4)。在40、80、120、160 μmol/L OST作用后，抗凋亡蛋白Bcl- 2表達(dá)量分別為(51.21±1.51)%、(47.09±1.67)%、(35.60±8.76)%、(19.48±1.84)%，其中80(t=3.711，P=0.013)、120(t=7.009，P=0.000)、160 μmol/L OST(t=11.630，P=0.000)均高于對照組[(60.03±2.42)%]，40 μmol/L OST與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.529，P=0.090)(圖4)。

OST對Tca8113細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)與空白對照組(53.81±3.09)%相比，40、80、120、160 μmol/L OST處理Tca8113細(xì)胞后，LC3Ⅱ蛋白表達(dá)水平分別為(74.74±2.98)%(t=3.519，P=0.018)、(81.25±7.73)%(t=4.614，P=0.003)、(101.00±9.96)%(t=7.938，P=0.000)、(103.13±9.37)%(t=13.030，P=0.000)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(圖5)。40、80、120、160 μmol/L OST處理Tca8113細(xì)胞后，P62蛋白表達(dá)水平分別為(56.22±3.64)%(t=3.327，P=0.026)、(58.99±0.67)%(t=4.046，P=0.008)、(77.80±1.45)%(t=8.931，P=0.000)、(88.49±9.68)%(t=11.700，P=0.000)，與對照組(43.41±1.25)%相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，且具有一定程度的濃度依賴性(圖5)。

討 論

OST(7-甲氧基- 8-異戊烯氧香豆素，C15H16O3)是一種天然香豆素化合物，香豆素由于原結(jié)構(gòu)中官能團(tuán)的存在，具有明顯的抗癌作用且不良反應(yīng)小[6]，已被證實(shí)OST對子宮頸癌、鼻咽癌、乳腺癌、胃癌、慢性髓系白血病、肺腺癌、膠質(zhì)瘤、肝癌等多種腫瘤均有抑制生長和治療作用[7-11]。但對口腔癌細(xì)胞的研究目前還不清楚。

Mr：相對分子質(zhì)量；1：對照組；2：40 μmol/L；3：80 μmol/L；4：120 μmol/L；5：160 μmol/L

1：對照組；2：40 μmol/L；3：80 μmol/L；4：120 μmol/L；5：160 μmol/L

細(xì)胞凋亡是由基因控制的細(xì)胞自主有序的死亡[12]。誘導(dǎo)凋亡能力已被認(rèn)為是抗腫瘤藥物的一種作用機(jī)制，也是目前抗腫瘤最重要的途徑之一，哺乳動物凋亡主要由線粒體依賴的凋亡途徑完成。Bcl- 2蛋白是Bcl家族最關(guān)鍵的抗凋亡蛋白，通過Bcl- 2過量表達(dá)并與促凋亡因子Bax形成異二聚體來防止細(xì)胞凋亡。Bax是一種促凋亡蛋白，能轉(zhuǎn)運(yùn)到線粒體外膜，促進(jìn)多種凋亡因子的通透性和釋放[13-15]。當(dāng)線粒體凋亡發(fā)生，Bax被激活，細(xì)胞色素C釋放，線粒體外膜通透性增加半胱氨酸蛋白酶3活化，活化的半胱氨酸蛋白酶3可以轉(zhuǎn)導(dǎo)和放大細(xì)胞內(nèi)凋亡信號，催化聚合酶裂解，引發(fā)DNA損傷和凋亡[16-17]。本研究Western blot結(jié)果顯示，經(jīng)過蛇床子素處理的Tca8113細(xì)胞促凋亡蛋白Bax和活化的半胱氨酸蛋白酶3明顯上調(diào)，Bcl- 2表達(dá)下降，提示OST可以通過線粒體途徑促進(jìn)舌鱗癌Tca8113細(xì)胞的凋亡。

自噬是一個高度調(diào)控的過程，適度的自噬通過降解被破壞的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器釋放新的大分子前體氨基酸代謝物和供能，促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)被細(xì)胞重新利用，維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，自噬受阻滯會導(dǎo)致細(xì)胞器缺乏能量供應(yīng)，細(xì)胞器無法更新，細(xì)胞死亡速度增加[18-20]。越來越多的證據(jù)表明，自噬在抑制人類腫瘤中起著重要的作用。LC3是自噬小體的標(biāo)志蛋白，其含量與自噬體形成的程度密切相關(guān)，當(dāng)自噬激活過程中，LC3Ⅰ以胞漿形式與磷脂酰乙醇胺結(jié)合，進(jìn)一步裂解為LC3Ⅱ，使LC3Ⅱ鉚釘在自噬泡雙層膜上，P62位于細(xì)胞核內(nèi)并在細(xì)胞質(zhì)中合成，是一種泛素結(jié)合支架蛋白，當(dāng)自噬發(fā)生，P62與泛素結(jié)合并招募泛素化蛋白，再與自噬體膜上的LC3Ⅱ結(jié)合形成復(fù)合物，進(jìn)入到自噬體后最終與溶酶體融合形成自噬溶酶體從而被清除，是評價自噬體降解的重要指標(biāo)。P62蛋白與自噬溶酶體結(jié)合，代表自噬溶酶體降解水平，P62表達(dá)水平增加意味自噬溶酶體降解減少，自噬流被阻斷，自噬過程受損[21]。本研究Western blot結(jié)果顯示，經(jīng)過OST處理的Tca8113細(xì)胞。LC3Ⅱ、P62蛋白表達(dá)量隨OST濃度的升高而增加，LC3Ⅰ表達(dá)量降低，表示OST作用于Tca8113細(xì)胞時，能誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，但是自噬流受阻自噬過程無法繼續(xù)進(jìn)行從而抑制細(xì)胞的自噬過程導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

綜上，本研究顯示OST抑制Tca8113細(xì)胞增殖，機(jī)制可能是促進(jìn)細(xì)胞凋亡、阻斷自噬流抑制細(xì)胞自噬過程。