魏曉玲,柯玉琴,李文卿,鐘月仙,何華勤

(1.福建農(nóng)林大學 生命科學學院,福建 福州 350002;2.福建省煙草專賣局 煙草科學研究所,福建 福州 350013)

在作物生長發(fā)育與品質(zhì)形成的過程中,光照與溫度發(fā)揮著重要的作用[1-7]。當植物吸收的光能過多,不能及時有效利用或耗散時就會遭受強光脅迫,引起光合效率降低而發(fā)生光抑制[8]。煙草是喜光作物,光強充足的條件能夠促進煙草的生長發(fā)育和煙葉品質(zhì)的形成[9],但是過強的光照不利于煙株的生長[10]。特別是在煙草生長后期,高溫常常伴隨著強光,使得光抑制的程度進一步加深。當煙株處于高溫和強光環(huán)境條件下時,首先發(fā)生變化的是其內(nèi)在的生理過程。在植物生存的環(huán)境中,高溫高強光等都能促使各類活性氧物質(zhì)(ROS)產(chǎn)生,相應(yīng)的抗氧化物酶,如超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)的活性便會發(fā)生相應(yīng)的變化，幫助機體渡過逆境．因此,抗過氧化物酶的活性可作為植物耐受高溫、強光脅迫能力或恢復能力的標準[11]。目前,多數(shù)研究主要集中在溫度或光強的單一脅迫對烤煙生育前期生長發(fā)育、光合生理特性等方面的影響上,而關(guān)于高溫、強光交互脅迫對成熟期烤煙活性氧代謝和次生物代謝影響的研究鮮見報道。福建地處東南,是我國重要的煙葉產(chǎn)地,主要種植春煙,煙葉一般在5～7月成熟采收,中上部煙葉成熟采收時常常遇高溫強光天氣,導致烤煙出現(xiàn)“高溫逼熟”現(xiàn)象,嚴重影響煙葉品質(zhì)。本研究通過設(shè)置不同光溫處理,探討了高溫、強光對成熟期煙葉活性氧代謝的影響,旨在為制定合理的煙草種植技術(shù)措施提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試煙草品種為翠碧一號,由福建省煙草專賣局煙草農(nóng)業(yè)科學研究所提供。試驗于2018年在福建省煙草專賣局煙草農(nóng)業(yè)科學研究所宦溪科研基地進行。

1.2 試驗處理

試驗共設(shè)4個處理:T1處理，25 ℃+遮光；T2處理，25 ℃+強光;T3處理，35 ℃+遮光;T4處理，35 ℃+強光。強光處理下的光照強度均為1600.0 μmol/(m2·s)。用硫酸紙遮住煙草植株倒2、倒3葉的半片葉片(硫酸紙的遮光率為30%),作為T1與T3處理的遮光處理；不用硫酸紙遮光作為T2和T4處理的強光處理。試驗采用盆栽方式,花盆上口內(nèi)徑28 cm,下底內(nèi)徑22 cm,內(nèi)高25 cm,每盆裝15.0 kg土。試驗用土壤pH值為5.11,堿解氮含量為102.4 mg/kg,速效磷含量為16.8 mg/kg,速效鉀含量為94.8 mg/kg,有機質(zhì)含量為16.2 g/kg。每盆施煙草專用肥20 g(N∶P2O5∶K2O=12∶7∶22)。每處理種植4盆烤煙。選擇七葉一心煙苗移栽到花盆,然后將花盆放置在室外自然溫光條件下。于煙株打頂后第7天，將花盆移入植物生長箱(由武漢瑞華儀器設(shè)備有限責任公司生產(chǎn))進行高溫和強光處理,處理時間為48 h。

1.3 測定指標及方法

將同一處理的倒2和倒3葉的半片葉剪下、混勻,冷凍保存于-80 ℃冰箱，用于各項生理指標的測定。其中葉片膜透性的測定采用新鮮葉片電導儀法。

酶液的提取:取0.5 g煙草葉片,置于預冷的研缽中,加入2.0 mL冰冷的0.05 mol/L磷酸緩沖液(pH 7.8)及少量石英砂,再加入3.0 mL緩沖液,研磨均勻后,將勻漿液置于4 ℃下,以10000 r/min離心10 min,所得上清液即為酶液,可供超氧化物歧化酶SOD活性、過氧化物酶POD活性、過氧化氫酶CAT活性及丙二醛MDA含量的測定。

SOD、POD活性的測定參照張志良[12]的方法，其中SOD的活性以光照下超氧化物歧化酶抑制氮藍四唑的還原作用強度來表示，以每分鐘A470變化0.01作為POD的1個酶活性單位。

CAT活性的測定采用硫代硫酸鈉滴定法,將酶提取液與0.1 mol/L過氧化氫混合,然后加入3.6 mol/L硫酸終止反應(yīng);加入2%碘化鉀和鉬酸銨以及1%淀粉作為顯色劑,用0.02 mol/L硫代硫酸鈉滴定,直到溶液褪色;用煮沸的酶液作為對照組,減少的硫代硫酸鈉滴定量表示酶活性大小。

MDA含量的測定采用硫代巴比妥酸比色法,分別在450、532、600 nm波長下測定吸光度。

內(nèi)源激素IAA、ABA、SA、JA含量的測定采用ELISA(酶聯(lián)免疫)法(試劑盒由上海通蔚實業(yè)有限公司提供),將煙葉樣品置于預冷研缽中,用80%甲醇研磨成勻漿，然后離心,取上清液過C18膠柱，去除親酯色素后用于不同激素含量的測定。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用Microsoft Office Excel 2007和DPS 7.05軟件進行試驗數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對煙株葉片膜透性的影響

植物細胞質(zhì)膜是細胞與外界環(huán)境間的一道屏障,對維持細胞的微環(huán)境和正常代謝起著重要作用。從圖1可見,T1、T2、T3和T4處理煙葉的細胞膜透性分別為12.88%、15.21%、14.89%和20.51%。在相同溫度條件下,遮光處理葉片的細胞膜透性顯著低于強光處理的;在相同光強處理條件下,35 ℃高溫處理葉片的細胞膜透性顯著高于25 ℃處理的。說明高溫和強光均會對煙株葉片的細胞膜造成顯著傷害,導致細胞膜透性增加,細胞內(nèi)部分電解質(zhì)外滲,影響其正常的生理代謝。

圖中數(shù)據(jù)為均值±標準差;不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05),下同。

2.2 不同處理對煙株活性氧代謝的影響

2.2.1 不同處理對煙株葉片H2O2與MDA含量的影響 從圖2A可見,在25 ℃條件下,無論遮光與否,葉片的H2O2含量均較低,均顯著低于35 ℃溫度條件下的，即T1、T2處理煙葉的H2O2含量均顯著低于T3、T4處理的;當溫度為35 ℃時,遮光處理可以顯著降低葉片的H2O2含量,即T3處理的H2O2含量顯著低于T4處理的。在25 ℃條件下,煙株生長受強光照的影響較小,T1處理下的H2O2含量為6.699 mmol/mg,T2處理下的H2O2含量為6.825 mmol/mg;當溫度上升到35 ℃時,葉片中H2O2含量即顯著增加,當光照強度進一步增強時,H2O2含量再進一步顯著增加,在T4處理下的H2O2含量達到最大值23.139 mmol/mg,表明在T4處理下煙株葉片受傷害最大。

從圖2B可見,在T4的高溫強光處理條件下葉片中MDA含量最高,達到4.774 μmol/g,顯著高于T1和T3處理的。無論在高溫還是在低溫下,強光處理煙株葉片的MDA含量均高于遮光處理的,且在兩個強光處理下煙株葉片的MDA含量差異未達5%顯著水平。在25 ℃遮光處理下煙株葉片的MDA含量顯著高于35 ℃遮光處理的,表明強光比高溫更能誘導煙株葉片MDA含量的增加。

圖2 不同處理對煙株葉片H2O2與MDA含量的影響

2.2.2 不同處理對煙株葉片保護酶活性的影響 過氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)是植物活性氧代謝中的3個關(guān)鍵酶,其中SOD催化超氧化物通過歧化反應(yīng)轉(zhuǎn)為O2和H2O2,CAT能將細胞內(nèi)有害的H2O2轉(zhuǎn)化為H2O和O2。由圖3A可見,T3處理煙葉的SOD活性最高,達1.263 U/(mg·min),分別比T1、T2和T4處理高6.42%、6.84%和5.68%,但處理差異不顯著。由圖3B可見,CAT活性以T2處理最高,達1.289 mg/(mg·min),顯著高于其它3個處理的,且在其它3個處理間CAT活性差異不顯著。在相同溫度下,強光處理的煙株的CAT活性都高于遮光處理的,其中T2處理顯著高于T1處理的；T4高于T3處理的,但差異未達到顯著水平,說明在強光下煙株會通過提高CAT的活性來清除體內(nèi)產(chǎn)生的過量H202。

從圖3C可見,T3處理煙葉的POD活性最高,達1.674 U/(mg·min),顯著高于其它3個處理的,分別比T1、T2和T4處理高17.99%、31.09%和17.06%；在后面3個處理間POD活性差異不顯著。說明在高溫條件下,遮光處理對促進POD活性的提高具有顯著作用,而在25 ℃條件下,遮光處理雖然對POD活性的增加也有促進作用,但效果不顯著。

圖3 不同處理對煙株葉片SOD、CAT和POD活性的影響

2.3 不同處理對葉片內(nèi)源激素含量的影響

由表1可見：在相同溫度下,強光處理下的煙株體內(nèi)的生長素IAA含量高于遮光處理的；在遮光、不同溫度處理下的煙株IAA含量未出現(xiàn)顯著差異；T2處理下的IAA含量最高,達1.314 ng/g，顯著高于T4處理的,表明在相同溫度下強光誘導煙株葉片產(chǎn)生更多的IAA，而在遮光條件下低溫處理反而誘導更多的IAA。在T2處理下煙葉的ABA含量最高,達7.183 ng/g；在相同溫度下強光處理的煙葉ABA含量顯著高于遮光處理的,其中T2處理下的ABA含量比T1處理提高了20.6%,T4處理下的ABA含量比T3處理提高了32.8%;在相同光強下,35 ℃下的煙葉ABA含量顯著低于25 ℃下,其中T3處理的ABA含量比T1處理降低了35.4%,T4處理比T2處理降低了28.9%。這與IAA含量的表現(xiàn)一致。

從表1還可以看出,溫度處理對煙株葉片SA含量的影響比光照處理顯著,在35 ℃高溫處理下煙葉SA含量均顯著高于在25 ℃溫度處理下的,但光強對煙葉SA含量的影響不顯著。此外，25 ℃遮光、25 ℃強光和35 ℃遮光處理下煙葉JA含量均顯著高于35 ℃強光處理下的,且在前三者間差異不顯著，表明35 ℃強光顯著降低了煙葉的JA含量。

表1 不同處理下煙葉的內(nèi)源激素含量 ng/g

3 討論

植物細胞質(zhì)膜對維持細胞的微環(huán)境和正常的代謝起著重要作用。當植物處于逆境時,植物細胞膜透性增加,使得細胞內(nèi)部分電解質(zhì)外滲,影響其正常的生理代謝[13]。在本研究的相同溫度條件下,強光處理煙株葉片的細胞膜透性顯著高于遮光處理的；在高溫處理下煙株葉片的細胞膜透性也顯著高于低溫處理的,說明高溫和強光均使煙葉細胞膜透性增加。

逆境造成植物生理功能紊亂與植物細胞內(nèi)活性氧的代謝不平衡息息相關(guān)[14]。本研究結(jié)果表明,在高溫強光脅迫下煙株葉片的H2O2含量顯著上升,而H2O2是細胞清除O2-時的中間產(chǎn)物,說明在脅迫下活性氧增加、葉片碳同化過程受阻,破壞了活性氧的產(chǎn)生和消除之間的動態(tài)平衡,引發(fā)了膜脂過氧化反應(yīng)[15],這也可從本文研究發(fā)現(xiàn)強光誘導超量MDA產(chǎn)生的結(jié)果得到驗證?；钚匝醯脑黾臃催^來促使煙株葉片啟動抗氧化反應(yīng),強光處理的煙株的CAT、POD活性都高于遮光處理。而高溫遮光處理下煙株的SOD活性反而高于高溫強光處理,這可能是因為在強光處理下,細胞結(jié)構(gòu)遭到了嚴重破壞,對O2·-的清除能力降低，導致煙葉膜脂過氧化加劇[16,17]，同時也導致高溫強光處理下煙株葉片的MDA含量最高,這與張建光等[17]在蘋果上的研究結(jié)果一致。

植物往往通過調(diào)節(jié)內(nèi)源激素的含量建立新的激素平衡來適應(yīng)逆境脅迫。在逆境脅迫下,脫落酸含量大量增加,以加快離層的形成，促進植物組織的脫落，加強植物的抗逆性等[18]。本研究發(fā)現(xiàn)在強光下煙株葉片內(nèi)的ABA含量顯著增加,有可能是因為逆境脅迫促使植物體內(nèi)ABA的積累,大量的ABA積累可減少植物體內(nèi)水分運輸途徑,增加共質(zhì)體途徑的水流,促進水分吸收和氣孔開放,抑制氣孔關(guān)閉,以抵抗逆境脅迫。但在高溫條件下,ABA的含量反而下降。高夕全等[19]研究發(fā)現(xiàn),水稻幼胚經(jīng)高溫處理后ABA含量出現(xiàn)先降后升的趨勢;楊長琴等[20]的研究結(jié)果顯示在高溫脅迫下棉花葉片中ABA含量隨著處理時間的延長呈先升后降的趨勢[21]。說明植物不一定總是通過提高ABA水平來抵抗高溫脅迫,植物的ABA水平對逆境的響應(yīng)還與不同作物、逆境處理時間等有關(guān)。在高溫條件下煙株的水楊酸(SA)含量明顯上升,說明煙株可能通過提高SA的含量來提高抗氧化酶SOD等的活性，調(diào)節(jié)抗逆基因的表達水平，從而提高煙株對高溫脅迫的抵御能力,這也可從本研究高溫提高SOD活性的結(jié)果得到驗證。生長素是一類含有一個不飽和芳香族環(huán)和一個乙酸側(cè)鏈的內(nèi)源激素,主要指吲哚乙酸,具有調(diào)節(jié)莖的生長速率、抑制側(cè)芽、促進生根等作用[22]。在本試驗的相同溫度、強光處理下，煙株體內(nèi)的生長素IAA含量顯著高于遮光處理,說明在強光下煙株通過提高IAA含量來延緩葉片衰老、延長葉片同化作用的時間[23],這與Teale W D等[24]在紫花苜蓿上的研究結(jié)果一致。茉莉酸(JA)作為介導植物應(yīng)答環(huán)境信號和內(nèi)源信號物質(zhì)的關(guān)鍵激素,參與了植物各個階段的生長發(fā)育及脅迫防御反應(yīng)[26]；當植物處于干旱、鹽堿等逆境條件下時,茉莉酸含量上升,誘導植物氣孔關(guān)閉。JA調(diào)控氣孔運動的作用機制可能與對K+通道的調(diào)控有關(guān)。JA的前體物亞麻酸(LA)通過調(diào)控保衛(wèi)細胞質(zhì)膜K+通道,激活質(zhì)膜H+-ATPase,進而影響氣孔運動[27]。本試驗研究發(fā)現(xiàn),在高溫強光處理下煙株葉片內(nèi)的JA含量顯著下降,可能是因為在高溫強光下,植物通過降低JA含量來調(diào)控K+通道,抑制氣孔關(guān)閉，從而提高呼吸與光合速率，以延緩煙株早衰。

4 結(jié)論

在高溫、強光脅迫下,煙株細胞膜內(nèi)電解質(zhì)外滲,細胞膜透性增加,同時H202大量累積,MDA含量維持在較高水平,煙株膜脂過氧化程度加劇。高溫脅迫使得煙株SOD活性提高,清除O2·-的能力增強,是其應(yīng)對高溫脅迫的積極保護機制；而在強光處理下,細胞結(jié)構(gòu)破壞嚴重,SOD活性下降,對O2·-的清除能力降低;在強光處理下煙株通過提高CAT、POD的活性來降低H2O2的積累,減少類囊體膜的過氧化。但在高光強下溫度的提高會造成CAT活性的降低。在高溫、強光脅迫下煙葉內(nèi)源激素的含量也發(fā)生了明顯變化,以減緩葉片衰老。在強光下煙株葉片內(nèi)的ABA和IAA含量顯著增加,但在高溫處理下ABA和JA含量降低,SA的含量升高,幾種激素協(xié)同作用,促使抗氧化酶SOD等的活性提高，以抵御高溫脅迫。