劉 丹，梁 平，陳嘉欣，劉月圓，劉冰熔

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科 鄭州 450052

肝癌是我國常見的惡性腫瘤，發(fā)病率僅低于胃癌和食管癌，病死率居高不下，成為腫瘤臨床研究的熱點[1]。肝內(nèi)轉(zhuǎn)移以及肺轉(zhuǎn)移是影響肝癌預(yù)后的重要因素，也是臨床研究中亟待解決的難題[2]。Ro60/SSA抗原是干燥綜合征和系統(tǒng)性紅斑狼瘡的免疫反應(yīng)靶標[3-4]。以往的研究[5]表明，大約30%的癌癥患者可檢測到循環(huán)抗核抗體以及多種抗可提取性核抗原抗體，如Ro60/SSA。前期工作中，我們發(fā)現(xiàn)Ro60/SSA參與了胰腺癌腫瘤微環(huán)境的形成及其發(fā)生發(fā)展[6]。本研究中，我們利用siRNA技術(shù)敲低人肝癌細胞HAK-1A和HepG2中Ro60/SSA的表達，觀察細胞轉(zhuǎn)移和侵襲能力的變化，并通過移植瘤動物模型驗證敲低Ro60/SSA對肝癌細胞成瘤能力的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞、實驗動物與主要試劑HAK-1A和HepG2細胞由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院劉繼來博士贈予。siRNA-Ro60/SSA(5’-GGGCUGGAAAGAAGUUCAU TT-3’)和陰性對照siRNA-NC(5’-UUCUC CGAACGUGUCACGUTT-3’) 由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。Ro60/SSA和GAPDH抗體分別購自美國Abcam公司和Cell Signaling 公司。轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000購自美國Invitrogen公司。6周齡雌性BALB/c裸鼠購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司,實驗動物機構(gòu)認可證書注冊號為CNAS LA0004。

1.2 敲低Ro60/SSA表達對肝癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力的影響

1.2.1實驗分組 取對數(shù)生長期的HAK-1A和HepG2細胞分別接種于10 cm培養(yǎng)皿中，5×105個/皿。分3組處理：空白對照組常規(guī)培養(yǎng)(DMEM培養(yǎng)基+體積分數(shù)10%胎牛血清)；另兩組分別轉(zhuǎn)染siRNA-NC和siRNA-Ro60/SSA，轉(zhuǎn)染過程參照Lipofectamine2000試劑盒說明操作。每組設(shè)置3個復(fù)孔，轉(zhuǎn)染48 h后進行指標檢測。

1.2.2細胞中Ro60/SSA表達的Western blot法檢測 分別收集3組HAK-1A和HepG2細胞，應(yīng)用裂解液RIPA裂解細胞并提取總蛋白，BCA法測蛋白濃度，然后行SDS-PAGE，每孔上樣蛋白30 μg。蛋白分離后轉(zhuǎn)至PVDF膜，脫脂奶粉封閉后洗膜，加Ro60/SSA抗體(1∶200)和GAPDH抗體(1∶5 000)4 ℃孵育過夜，洗膜后加入辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶5 000)室溫孵育1 h，ECL顯影，凝膠成像系統(tǒng)曝光。應(yīng)用Photoshop軟件測算蛋白條帶的灰度，用目的蛋白與GAPDH條帶灰度值的比值表示目的蛋白表達水平。實驗重復(fù)3次。

1.2.3克隆形成能力的測定 將3組HAK-1A和HepG2細胞制備成單細胞懸液，接種于6孔板中，1 000個/孔，37 ℃孵育10～14 d，待形成肉眼可見克隆時，甲醛固定，吉姆薩染色。計數(shù)每孔肉眼可見克隆，2孔/次，重復(fù)3次。

1.2.4球形形成實驗 應(yīng)用Matrigel膠與2×DMEM培養(yǎng)液分別將3組HAK-1A和HepG2細胞制備成單細胞懸液，200個/孔接種于低黏附24孔培養(yǎng)板中；將培養(yǎng)板1 000 r/min離心 5 min后置37 ℃孵箱培養(yǎng)，7 d后觀察成球情況。顯微鏡200倍視野下隨機選擇5個視野拍照，應(yīng)用Image J 軟件，根據(jù)灰度值圈定細胞克隆，直徑>75 μm判定為成球。以未處理的細胞作參照，計算成球率。每次觀察2個復(fù)孔，重復(fù)3次。

1.2.5細胞轉(zhuǎn)移、侵襲能力的Transwell小室法檢測 24孔Transwell小室(8 μm膜孔)購自美國Corning Life Science公司。侵襲實驗:實驗前在上室內(nèi)加入500 μL無血清培養(yǎng)基，37 ℃孵育2 h以水化基底膜。于冰上將Matrigel膠(BD Biocoat)與無血清培養(yǎng)基混合，鋪于Transwell上室，培養(yǎng)箱內(nèi)放置1 h。分別收集3組HAK-1A細胞，以無血清培養(yǎng)基重懸細胞制備單細胞懸液(5×105個/mL)，取100 μL緩慢加入上室中，下室加入500 μL含體積分數(shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。48 h后用棉簽除去上室內(nèi)表面細胞，結(jié)晶紫染色，顯微鏡下(200倍)隨機選取5個視野，計數(shù)基底膜上的細胞并取均數(shù)。實驗重復(fù)3次。轉(zhuǎn)移實驗:Transwell上室不加Matrigel膠，孵育時間為24 h，其余步驟同侵襲實驗。

1.3 敲低Ro60/SSA對HAK-1A細胞裸鼠體內(nèi)成瘤能力的影響將雌性BALB/c裸鼠(n=10)隨機分為siRNA-NC組和siRNA-Ro60/SSA組,每組5只。將轉(zhuǎn)染siRNA-NC或siRNA-Ro60/SSA的HAK-1A細胞消化后重懸于PBS中，以1×104個/μL尾靜脈注射入裸鼠體內(nèi)(200 μL/只)。4周后，麻醉脫頸處死裸鼠，切開胸腔取出肺，體積分數(shù)75%乙醇和福爾馬林固定，計數(shù)肺表面腫瘤灶數(shù)量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 20.0進行統(tǒng)計學(xué)分析。3組轉(zhuǎn)移細胞數(shù)、侵襲細胞數(shù)、克隆形成率和成球率的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗；應(yīng)用Mann-WhitneyU檢驗比較兩組肺轉(zhuǎn)移瘤數(shù)量；檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 3組HAK-1A和HepG2細胞中Ro60/SSA蛋白的表達siRNA-Ro60/SSA組細胞中Ro60/SSA表達水平較空白對照組和siRNA-NC組降低(圖1、表1)。

1、4：空白對照組；2、5：siRNA-NC組；3、6：siRNA-Ro60/SSA組

表1 3組細胞中Ro60/SSA蛋白表達水平的比較

2.2 3組HAK-1A和HepG2細胞克隆形成能力的比較見圖2和表2。siRNA-Ro60/SSA組細胞克隆形成數(shù)較空白對照組和siRNA-NC組降低。

圖2 3組HAK-1A和HepG2細胞的克隆形成實驗

2.3 3組HAK-1A和HepG2細胞成球率的比較見圖3和表2。與空白對照組和siRNA-NC組相比，siRNA-Ro60/SSA組細胞成球率降低，提示細胞的肝細胞特性降低，在轉(zhuǎn)移灶定植和更新的能力減弱。

圖3 3組HAK-1A和HepG2細胞成球能力的檢測(×200)

表2 3組HAK-1A和HepG2細胞克隆形成數(shù)的比較

2.4 3組HAK-1A細胞轉(zhuǎn)移、侵襲能力的比較見圖4和表3。siRNA-Ro60/SSA組遷移細胞數(shù)和侵襲細胞數(shù)均低于siRNA-NC組和空白對照組。

A～C：轉(zhuǎn)移實驗；D～F：侵襲實驗

表3 3組HAK-1A細胞的轉(zhuǎn)移和侵襲細胞數(shù)的比較 個/高倍視野

2.5 敲低Ro60/SSA對HAK-1A細胞裸鼠體內(nèi)成瘤能力的影響見圖5。siRNA-Ro60/SSA組HAK-1A細胞在裸鼠肺部移植瘤形成數(shù)量的中位數(shù)(下，上四分位數(shù))為13(11，16)，較siRNA-NC組的4(3，5)減少(Z=1.964，P=0.049)。

圖5 2組裸鼠肺移植瘤大體觀(箭頭所指為移植瘤)

3 討論

Ro60/SSA是一種RNA結(jié)合蛋白，是核糖核蛋白體復(fù)合物成員之一[3,7]，廣泛分布于正常人體的肝、腎、淋巴等組織細胞的胞漿和胞核中[3-4]；在自身免疫性疾病中發(fā)揮免疫反應(yīng)調(diào)控“發(fā)動者”的作用，調(diào)控多種炎癥、細胞因子的生成[8]。 Ro60/SSA與逆轉(zhuǎn)錄因子 Alu結(jié)合后可激活細胞內(nèi)的RNA感受器Toll樣受體7 (Toll-like receptor 7，TLR7)，促進系統(tǒng)性紅斑狼瘡和干燥綜合征的發(fā)生；外周血中的Ro60/SSA和Alu共同作用，可促進IFN-γ、IL-6和TNF-α等眾多細胞因子的分泌，參與自身免疫性疾病的炎癥反應(yīng)進程[4,8]。

已有研究[6]表明，Ro60/SSA在胰腺癌細胞中異常高表達，扮演了類似“癌基因”的作用；應(yīng)用RNA干擾技術(shù)靶向下調(diào)Ro60/SSA表達可顯著抑制胰腺癌細胞的增殖、運動和侵襲；Ro60/SSA表達被抑制的胰腺癌細胞裸鼠體內(nèi)成瘤能力明顯下降。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染siRNA-Ro60/SSA的肝癌細胞HAK-1A和HepG2轉(zhuǎn)移、侵襲能力、干細胞特性和定植能力均降低，裸鼠體內(nèi)成瘤能力也顯著降低；提示敲低Ro60/SSA在一定程度上抑制了肝癌細胞向遠處遷移以及在遠處組織中定植、增殖的過程。

我們推測異常高表達的Ro60/SSA 通過誘發(fā)腫瘤微環(huán)境中CAF細胞因子的產(chǎn)生，促進腫瘤細胞的運動、侵襲能力，參與轉(zhuǎn)移灶定植過程。一方面，腫瘤組織內(nèi)細胞損傷和死亡釋放出的內(nèi)源性“警報素”誘導(dǎo)機體非特異性免疫反應(yīng)[9]。免疫反應(yīng)通過多種途徑影響腫瘤細胞的增殖和轉(zhuǎn)移，包括釋放細胞因子、NF-κB、活性氧自由基等[3]。另一方面，腫瘤細胞分泌的細胞因子在腫瘤和炎癥反應(yīng)的相互作用中發(fā)揮重要作用，腫瘤細胞高表達TNF-α、IL-6、IL-8、IL-18和IL-1β等多種細胞因子，進而上調(diào)表皮生長因子受體及轉(zhuǎn)移生長因子，促進腫瘤的進展[4]。

綜上所述，Ro60/SSA參與了肝癌的轉(zhuǎn)移過程，抑制其表達可降低肝癌細胞的轉(zhuǎn)移和侵襲能力，以及克隆性增殖能力。該研究結(jié)果為以免疫調(diào)控為基礎(chǔ)的、以Ro60/SSA為靶點的肝癌治療奠定了一定的理論基礎(chǔ)。