熊 陽(yáng) 王 帥 丹 成 張義兵 梅 潔

(1. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院, 武漢 430070; 2. 中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所, 武漢 430072)

黃顙魚(Pelteobagrus fulvidraco)是我國(guó)一種重要的淡水經(jīng)濟(jì)魚類, 肉質(zhì)鮮美, 無肌間刺, 營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高, 深受廣大消費(fèi)者的喜愛。在相同的養(yǎng)殖條件下,雄性黃顙魚在養(yǎng)殖第二年的生長(zhǎng)速度是雌性的1.5—2倍, 培育全雄黃顙魚能夠顯著提高養(yǎng)殖產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)效益[1]。中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所桂建芳課題組和華中農(nóng)業(yè)大學(xué)梅潔課題組開發(fā)出了性染色體特異的性別標(biāo)記, 并建立了一條X和Y染色體連鎖標(biāo)記輔助的全雄魚培育技術(shù)路線[2—6], 推動(dòng)黃顙魚產(chǎn)業(yè)的迅速發(fā)展。近年來, 由于YY超雄魚多代自交退化及在親本培育過程中遇到一些問題, 制約了全雄黃顙魚產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[7], 需要進(jìn)行品種改良或培育新品種。雜交黃顙魚(黃顙魚Pelteobagrus fulvidraco♀×瓦氏黃顙魚Pelteobagrus vachelli♂)形態(tài)特征與黃顙魚相近, 且其生長(zhǎng)速度明顯優(yōu)于黃顙魚。華中農(nóng)業(yè)大學(xué)等多家單位和企業(yè)進(jìn)行聯(lián)合育種研究, 采用傳統(tǒng)選育和雜交育種的方法, 培育出了水產(chǎn)新品種雜交黃顙魚“黃優(yōu)1號(hào)”(GS-02-001-2018)[8]。育種技術(shù)的創(chuàng)新和新品種的培育推動(dòng)了黃顙魚產(chǎn)業(yè)的持續(xù)發(fā)展, 2019年我國(guó)黃顙魚養(yǎng)殖產(chǎn)量高達(dá)5.37×108kg, 成為發(fā)展速度最快的特色淡水魚之一[9]。

近年來, 由多子小瓜蟲(Ichthyophthirius multifiliis)引起的小瓜蟲病(又稱白點(diǎn)病)成為黃顙魚養(yǎng)殖常見的疾病之一, 給我國(guó)黃顙魚養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。多子小瓜蟲沒有嚴(yán)格的宿主專一性,能感染絕大部分淡水魚類, 如斑點(diǎn)叉尾鮰(Ictalurus punctatus)、虹鱒(Oncorhynchus mykiss)、泥鰍(Misgurnus anguillicaudatus)、鯉(Cyprinus carpio)、尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)、赤眼鱒(Squaliobarbus curriculus)和鳙(Hypophthalmichthys nobilis)等經(jīng)濟(jì)魚類均易受到感染[10—16]。刺激隱核蟲(Cryptocaryon irritans; 又稱為海水小瓜蟲)引起的白點(diǎn)病已成為大范圍、經(jīng)常暴發(fā)的傳染性疾病, 給海水魚養(yǎng)殖也造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失, 大部分海水養(yǎng)殖魚類如斜帶石斑魚(Epinephelus coioides)、卵圓鯧鲹(Trachinotus blochii)和大黃魚(Pseudosciaena crocea)等均容易感染刺激隱核蟲[17—19]。小瓜蟲病的防治目前仍是國(guó)際性的難題。

魚類的皮膚黏液作為抵御寄生蟲感染的第一道重要屏障, 含有諸多抑殺病原的活性物質(zhì)如免疫球蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、補(bǔ)體、凝集素和抗菌肽等[20]。黃斑藍(lán)子魚(Siganus oramin)等極少數(shù)魚類具有天然抗刺激隱核蟲(Cryptocaryon irritans)的能力[21],其皮膚黏液蛋白對(duì)多子小瓜蟲和刺激隱核蟲均有殺傷效果[22]。魚類的鰓和皮膚作為分泌皮膚黏液的主要器官, 有學(xué)者在其中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)抗菌肽(位于血紅蛋白β鏈HBβ C端的肽段)具有抗多子小瓜蟲的效果[23]。最近, 通過蛋白質(zhì)組技術(shù)發(fā)現(xiàn)HBβ存在于黃顙魚皮膚黏液中, 其表達(dá)量在鲇愛德華氏菌感染后明顯上升[24], 說明HBβ可能具有抗菌功能。據(jù)多數(shù)養(yǎng)殖戶反映, 全雄黃顙魚和雜交黃顙魚對(duì)多子小瓜蟲的敏感程度存在明顯差異。為解析全雄黃顙魚與雜交黃顙魚對(duì)多子小瓜蟲抗性差異的分子機(jī)制, 本研究系統(tǒng)地比較了全雄黃顙魚、雜交黃顙魚和瓦式黃顙魚對(duì)多子小瓜蟲的抗性差異, 檢測(cè)了HBβ基因在全雄黃顙魚和雜交黃顙魚免疫相關(guān)組織中的表達(dá)差異, 研究了人工合成黃顙魚抗菌肽(HBβ C端的肽段, HBβ-C)體外的殺蟲效果, 旨在為黃顙魚多子小瓜蟲病的防控提供技術(shù)保障。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)魚

全雄黃顙魚(4.43±0.45) g、雜交黃顙魚(6.07±0.64) g和瓦式黃顙魚(8.65±1.18) g在武漢百瑞生物技術(shù)有限公司循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)暫養(yǎng)2周。在暫養(yǎng)期間, 隨機(jī)選取全雄黃顙魚、雜交黃顙魚和瓦式黃顙魚各10尾在光學(xué)顯微鏡下對(duì)鰓、鰭條和皮膚黏液進(jìn)行仔細(xì)檢查, 均未見小瓜蟲等寄生蟲。

1.2 小瓜蟲的培養(yǎng)及其滋養(yǎng)體、包囊體和掠食體的分離

采用張其中等[25]報(bào)道的方法分離小瓜蟲的滋養(yǎng)體、包囊體和掠食體, 用于體外攻毒試驗(yàn)。將已感染小瓜蟲的赤眼鱒與雜交黃顙魚飼養(yǎng)于同一循環(huán)水箱中進(jìn)行平行感染維持實(shí)驗(yàn)所需的小瓜蟲。首先用200 mg/L MS-222 (甲基磺酸三胺)將嚴(yán)重感染的雜交黃顙魚麻醉, 然后用干凈的細(xì)胞刮刀從魚皮膚和鰭條上取出包裹著囊泡的滋養(yǎng)體, 反復(fù)清洗多次后, 直至去除大部分黏液, 將干凈滋養(yǎng)體放置裝有養(yǎng)殖系統(tǒng)水的培育皿中用于體外抗蟲試驗(yàn)和形成包囊體。滋養(yǎng)體在20℃下約10min停止游動(dòng)吸附在培育皿底部, 形成一層透明的薄膜形成包囊體,蟲體在內(nèi)旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)并以二分裂的形式分裂形成子體, 約20h后成熟并釋放出400—600個(gè)具有感染性的掠食體, 收集后用于抗蟲試驗(yàn)。

1.3 小瓜蟲人工感染試驗(yàn)及樣品收集

在暫養(yǎng)2周后, 將健康的全雄黃顙魚、瓦式黃顙魚和雜交黃顙魚分別隨機(jī)分為對(duì)照組和感染組置于90 L水箱中, 水溫保持在(20±1.0)℃, 溶解氧≥6 mg/L以上。每組3個(gè)平行, 每個(gè)平行隨機(jī)放入65尾魚。此外, 添加一組混合感染組即全雄黃顙魚和雜交黃顙魚各32尾, 通過分別剪左右腹鰭進(jìn)行物理辨別。參照Clark等[26]方法進(jìn)行小瓜蟲人工感染實(shí)驗(yàn), 3尾已被平行感染的雜交黃顙魚與每個(gè)感染組共棲息在同一個(gè)養(yǎng)殖缸中, 而對(duì)照組則不放入受感染的魚, 其他養(yǎng)殖環(huán)境相同。在試驗(yàn)期間, 及時(shí)清理死魚以免污染水質(zhì), 記錄其感染情況并統(tǒng)計(jì)每個(gè)組合死亡率。在感染的第5天, 每個(gè)組合分別從3個(gè)平行魚箱中各取5尾魚, 用200 mg/L MS-222 (甲基磺酸三胺)麻醉后, 分別取部分皮膚和鰓組織固定在4%多聚甲醛24h, 用于免疫組化和病理學(xué)分析;而另取部分組織用液氮處理后轉(zhuǎn)移置-80℃冰箱保存, 用于血紅蛋白β鏈基因的組織表達(dá)分析。

1.4 黃顙魚血紅蛋白源抗菌肽HBβ-C生物信息學(xué)分析及化學(xué)合成

前期我們通過蛋白質(zhì)組技術(shù)比較鲇愛德華氏菌感染前后黃顙魚皮膚黏液蛋白質(zhì)的表達(dá)變化[24]。本實(shí)驗(yàn)通過本地blastall程序?qū)ⅫS顙魚黏液蛋白質(zhì)組所有肽段序列與抗菌肽數(shù)據(jù)庫(kù)(http://aps.unmc.edu/AP/APD3_update2020_release.fasta)進(jìn)行比較分析確定抗菌肽位置。使用以下軟件和工具對(duì)血紅蛋白源抗菌肽HBβ-C進(jìn)行分析: Clone Manager軟件對(duì)黃顙魚血紅蛋白β鏈基因序列進(jìn)行分析, 確定其開放閱讀框(ORF); DNAMAN 7.0軟件進(jìn)行氨基酸序列分析; BLAST工具(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進(jìn)行核苷酸和氨基酸序列相似性分析。利用HeliQuest工具(https://heliquest.ipmc.cnrs.fr)進(jìn)行抗菌肽HBβ-C進(jìn)行氨基酸電荷和疏水性分析。以硬骨魚Leiostomus xanthurus的血紅蛋白β鏈(蛋白數(shù)據(jù)檢索號(hào)1spg.1.B)為模板使用SWISS-MODEL server (http://swissmodel. expasy.org/)進(jìn)行建模預(yù)測(cè)抗菌肽結(jié)構(gòu)。

抗菌肽HBβ-C由南京市金斯瑞生物科技股份有限公司采用固相化學(xué)合成法合成, 反向液相色譜確定純度在90%以上, 然后利用質(zhì)譜確定分子量準(zhǔn)確無誤。

1.5 血紅蛋白β鏈在黃顙魚皮膚和鰓組織中表達(dá)量分析

用TRIzol試劑(中國(guó)大連, TaKaRa)提取每個(gè)樣品的總RNA; 通過NanoDrop 2000測(cè)定RNA濃度和瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)提取的RNA完整后, 等量混合;使用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa)試劑盒按說明書要求進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。RT-PCR反應(yīng)體系: SYBR Green Mixture 10 μL,10 μmol/L的正向引物(F: 5′-TTCACGCTTCTTGC TAACT-3′)和反向引物(R: 5′-CAGCCACGACGAC ATTCA-3′)各0.5 μL, 去離子水8.0 μL, cDNA 1.0 μL。反應(yīng)條件: 95℃預(yù)變性30s, 40個(gè)循環(huán)(95℃ 5s, 60℃30s), 溶解曲線: 65—95℃、0.5℃/次, 5s讀板。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)。反應(yīng)結(jié)束后分析擴(kuò)增產(chǎn)物的溶解曲線, 以黃顙魚β-actin作為內(nèi)參基因, 分析每個(gè)樣品中基因表達(dá)情況。

Western blot印跡分析: 將黃顙魚HBβ-C肽段部分序列(PEVHETWQKFLN)進(jìn)行化學(xué)合成后注射到新西蘭大白兔獲得兔源的HBβ多克隆抗體; 提取鰓組織的總蛋白后再進(jìn)行15% SDS-PAGE電泳, 用濕轉(zhuǎn)法進(jìn)行轉(zhuǎn)膜; 在封閉液(5%脫脂奶粉)中封閉1h, 封閉液加入HBβ多克隆抗體(1﹕1000)中在搖床上4℃封閉過夜; 洗膜, 加入HRP-conjugated Goat Anti-Rabbit lgG(H+L) (1﹕1000), 室溫?fù)u床孵育1h;洗膜, 用ECL顯色系統(tǒng)進(jìn)行顯色, 置紅外激光成像系統(tǒng)檢測(cè)并拍照。Western blot結(jié)果中的條帶強(qiáng)度使用Image J軟件分析。

1.6 HBβ-C體外抗小瓜蟲試驗(yàn)

將化學(xué)合成的HBβ-C粉劑溶于滅菌雙蒸水中使其終濃度為1000 μg/mL, 用雙蒸水稀釋為500、250、125、50、25、15、5、2和1 μg/mL。體外試驗(yàn)在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中進(jìn)行, 每孔加入70 μL不同濃度抗菌肽和10個(gè)滋養(yǎng)體, 每種濃度3個(gè)平行孔。試驗(yàn)設(shè)置未加抗菌肽的作為陰性對(duì)照組。每0.5h鏡檢1次, 4h后統(tǒng)計(jì)各孔死亡情況。包囊體和掠食體的藥物處理同上。不同生活史小瓜蟲死亡判斷標(biāo)準(zhǔn)為蟲體纖毛不再運(yùn)動(dòng), 膜破裂, 胞內(nèi)物質(zhì)外流。

1.7 組織病理學(xué)分析

組織樣品做石蠟包埋后進(jìn)行連續(xù)切片, 分別進(jìn)行蘇木精-伊紅(HE)染色和免疫組化分析。

免疫組化分析: 組織石蠟切片置于65℃烘箱中烘片2h進(jìn)行脫蠟, PBS洗滌(洗滌3次, 每次5min, 下同)后置于EDTA緩沖液中微波修復(fù), 自然冷卻后PBS洗滌; 切片置于3%過氧化氫溶液中室溫下避光孵育10min, 阻斷內(nèi)原酶反應(yīng); PBS洗滌, 甩干后用5% BSA封閉20min, 封閉非特異性反應(yīng); 去除BSA液, 每張切片加入HBβ多克隆抗體(1﹕200)覆蓋組織,4℃過夜; PBS洗滌, 每張切片加入Cy3-conjugated Goat Anti-Rabbit lgG(H+L) (1﹕1000), 37℃孵育50min; PBS洗滌, 每張切片加50—100 μL DAPI染液, 室溫避光孵育5min; 染色后將切片放入PBS洗滌, 滴加適量的抗熒光淬滅劑于組織上, 蓋玻片封片, 熒光顯微鏡下觀察。

1.8 數(shù)據(jù)分析

使用Excel 2010和SPSS 11.0軟件統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù), 采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)檢驗(yàn)小瓜蟲感染組與對(duì)照組樣品間血紅蛋β鏈基因表達(dá)量差異。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)的方式表示,P＜0.05表示差異性顯著(*),P＜0.01表示差異性極顯著(**)。利用GraphPad Prism 6.0軟件做基因表達(dá)和Kaplan-Meier生存曲線圖, 用Mantel-Cox檢驗(yàn)分析曲線之間的差異。

2 結(jié)果

2.1 全雄黃顙魚、雜交黃顙魚和瓦氏黃顙魚對(duì)多子小瓜蟲的抗性差異分析

為了評(píng)估全雄黃顙魚、雜交黃顙魚和瓦式黃顙魚對(duì)多子小瓜蟲的敏感性, 我們進(jìn)行了感染試驗(yàn)。在3種魚進(jìn)行感染實(shí)驗(yàn)后, 每日死亡狀況如表 1所示。雜交黃顙魚和瓦式黃顙魚極易感染多子小瓜蟲, 在感染5—6d即可觀察到清晰的小白點(diǎn)寄生在皮膚和鰭條上, 光學(xué)顯微鏡下也可觀察鰓部被感染, 感染率高達(dá)100%。在試驗(yàn)期間, 全雄黃顙魚未發(fā)現(xiàn)臨床癥狀, 通過光學(xué)顯微鏡觀察未檢測(cè)到多子小瓜蟲存在于全雄黃顙魚鰓、皮膚和鰭條組織。在相同感染條件下, 瓦式黃顙魚和雜交黃顙魚的死亡率高達(dá)100%顯著高于全雄黃顙魚(P＜0.0001), 而所有對(duì)照組魚均存活且未被感染(圖 1)。在混合感染組中, 雜交黃顙魚因感染多子小瓜蟲大批量死亡,而全雄黃顙魚依舊鏡檢未檢測(cè)到多子小瓜蟲存在(圖 2), 少量幾條全雄黃顙魚可能由于鰭條破損細(xì)菌感染而死亡。

圖1 全雄黃顙魚、雜交黃顙魚和瓦式黃顙魚感染多子小瓜蟲的存活曲線圖Fig. 1 The survival curves of all-male yellow catfish, hybrid yellow catfish and darkbarbel catfish after infected with Ichthyophthirius multifiliis

圖2 全雄黃顙魚和雜交黃顙魚混合感染多子小瓜蟲的存活曲線圖Fig. 2 The survival curves of all-male yellow catfish and hybrid yellow catfish after infected with Ichthyophthirius multifiliis. Allmale yellow catfish and hybrid yellow catfish were mixed together

表1 黃顙魚感染多子小瓜蟲每日死亡狀況(尾)Tab. 1 The daily dead status of yellow catfish after infected with Ichthyophthirius multifiliis

2.2 黃顙魚血紅蛋白β鏈基因(HBβ)及其C端抗菌肽HBβ-C生物信息學(xué)分析

基于生物信息學(xué)分析, 黃顙魚HBβ的cDNA全長(zhǎng)為447 bp, 共編碼148個(gè)氨基酸(aa; 圖 3)。通過與抗菌肽數(shù)據(jù)庫(kù)(http://aps.unmc.edu/AP/APD3_update2020_release.fasta)進(jìn)行比較分析發(fā)現(xiàn)黃顙魚抗菌肽HBβ-C與斑點(diǎn)叉尾鮰抗菌肽AP01619匹配度高達(dá)84.84%, 位于黃顙魚血紅蛋白β鏈基因的C端33 aa (圖 3下劃線)?？咕腍Bβ-C的螺旋輪分布如圖 4A所示, 其總電荷為+1.5, 總疏水率為51.8%?？咕腍Bβ-C的模型結(jié)構(gòu)圖如圖 4B所示, 由序列10PEVHETWQKFLNVVVAAL28形成α螺旋結(jié)構(gòu)。

圖3 黃顙魚HBβ基因cDNA全長(zhǎng)及其預(yù)測(cè)的氨基酸序列Fig. 3 The cDNA sequence and deduced amino acid sequences of HBβ in yellow catfish

圖4 抗菌肽HBβ-C的螺旋輪分布和結(jié)構(gòu)模型圖Fig. 4 The helical wheel distribution and structure model of the antimicrobial peptide HBβ-C

2.3 黃顙魚HBβ在鰓和皮膚等免疫組織中mRNA和蛋白表達(dá)量分析

我們分別以全雄黃顙魚和雜交黃顙魚作為抗感染和易感個(gè)體, 選取多子小瓜蟲的主要感染部位即皮膚和鰓組織檢測(cè)HBβ的mRNA表達(dá)水平。定量結(jié)果如圖 5A和5B所示, 在對(duì)照組中, 雜交黃顙魚的鰓和皮膚組織中HBβ的mRNA表達(dá)量均高于全雄黃顙魚; 在攻毒試驗(yàn)第5天,HBβ的mRNA表達(dá)量在雜交黃顙魚鰓和皮膚組織中分別上升了3.7倍和1.5倍,而在全雄黃顙魚鰓和皮膚組織分別上升了23.8倍和26.3倍, 此時(shí)全雄黃顙魚的鰓和皮膚組織中HBβ的mRNA表達(dá)量顯著高于雜交黃顙魚。在未感染多子小瓜蟲的鰓組織中, 全雄黃顙魚HBβ蛋白表達(dá)量比雜交黃顙魚高2.2倍(圖 5C和5D), 表明全雄黃顙魚HBβmRNA在鰓和皮膚等免疫組織中蛋白翻譯水平明顯高于雜交黃顙魚; 在應(yīng)對(duì)小瓜蟲感染的過程中, 全雄黃顙魚的mRNA轉(zhuǎn)錄水平快速提升, 遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于雜交黃顙魚, 可能與全雄黃顙魚抗多子小瓜蟲的特性相關(guān)。

圖5 HBβ在鰓和皮膚組織中的表達(dá)分析Fig. 5 The relative expression of HBβ in gill and skin

2.4 抗菌肽HBβ-C對(duì)多子小瓜蟲的體外殺傷影響

多子小瓜蟲的生活史分為滋養(yǎng)體、包囊體和掠食體三個(gè)階段。當(dāng)使用50 μg/mL的HBβ-C處理后, 滋養(yǎng)體從黏液囊中逃出后在水中劇烈運(yùn)動(dòng), 然后25s左右裂解, 胞質(zhì)外流而死(圖6A和6B); 僅需要15 μg/mL的HBβ-C能在3min內(nèi)殺死所有滋養(yǎng)體(表 2)。由于包囊體具有較厚的包囊膜(圖 6C), 抗菌肽HBβ-C較難滲透; 當(dāng)使用500 μg/mL的HBβ-C處理后, 前40min包囊體的包囊膜迅速皺縮, 里面的子體急劇運(yùn)動(dòng)(圖 6D), 之后包囊體中的子體逐漸逃脫游離在水中, 約1h后胞質(zhì)外流最后死亡(圖 6E和6F)。對(duì)于剛釋放的掠食體來說, HBβ-C需要使用較高濃度(125 μg/mL)及花費(fèi)更長(zhǎng)時(shí)間(約3h)才能將其完全殺死(圖 6G和6H)。所有對(duì)照組的3個(gè)階段的多子小瓜蟲完好無損, 各個(gè)階段正常分裂發(fā)育。

表2 抗菌肽HBβ-C對(duì)不同生活史的多子小瓜蟲體外影響Tab. 2 The effect of antimicrobial peptide HBβ-C on the different life cycles of Ichthyophthirius multifiliis in vitro

圖6 抗菌肽HBβ-C對(duì)不同生活史的多子小瓜蟲的影響Fig. 6 The effect of antimicrobial peptide HBβ-C on Ichthyophthirius multifiliis different life cycles

2.5 HBβ在雜交黃顙魚感染小瓜蟲過程中的表達(dá)定位分析

為了研究HBβ在多子小瓜蟲感染過程中的組織分布, 我們使用連續(xù)切片分別進(jìn)行HBβ抗體熒光免疫組化和蘇木精—伊紅(HE)染色分析。熒光免疫組化結(jié)果顯示, HBβ抗體在雜交黃顙魚鰓組織中的紅細(xì)胞中有較強(qiáng)的表達(dá)信號(hào)(圖 7A和7B, 箭頭所示)。此外, HBβ抗體能特異性結(jié)合到多子小瓜蟲表面, 表現(xiàn)出很強(qiáng)的熒光信號(hào)(圖 7C和7D, 箭頭所示)。在皮膚組織中, 多子小瓜蟲寄生位置較深緊靠著基底膜, HBβ抗體也特異性附著多子小瓜蟲上(圖7E和7F, 箭頭所示)。

圖7 HBβ免疫熒光定位及組織切片分析Fig. 7 Detection of HBβ localization by immunohistochemistry and analysis of histological section

3 討論

多子小瓜蟲病是水產(chǎn)養(yǎng)殖的主要病害之一, 國(guó)內(nèi)外科研工作者早期對(duì)小瓜蟲的防治藥物進(jìn)行了大量的篩選, 已篩選的有效治療藥物如孔雀石綠、硝酸亞汞和醋酸亞汞等, 均由于毒性強(qiáng)、致癌和嚴(yán)重污染環(huán)境而被禁用。近年來中草藥上篩選的辣椒、生姜、五倍子等和化合物高錳酸鉀、福爾馬林、硫酸銅等有一定療效, 但大多數(shù)藥物僅對(duì)掠食體階段有一定效果, 對(duì)滋養(yǎng)體階段效果并不顯著。小瓜蟲病防治的最大難題就是一般藥物不能有效滲透到小瓜蟲的寄生部位殺死滋養(yǎng)體[27]。

血紅蛋白廣泛存在于脊椎動(dòng)物和無脊椎動(dòng)物的紅細(xì)胞中, 是由2個(gè)α亞基和2個(gè)β亞基形成一個(gè)四聚體結(jié)構(gòu)具有攜氧功能的重要呼吸蛋白[28]。近年來, 研究者們發(fā)現(xiàn)血紅蛋白除了具有攜氧功能外,其亞基片段可形成各種活性肽, 具有止痛、促生長(zhǎng)激素釋放、阿片樣活性、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放和血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制活性等功能[29—33]。血紅蛋白源的肽段可形成多種抗菌肽, 其抗菌特性在哺乳類、爬行類、魚類和貝類中均有發(fā)現(xiàn)[34,35]。諸多研究發(fā)現(xiàn)血紅蛋白α鏈35—56位氨基酸和位于血紅蛋白β鏈的111—146位氨基酸片段存在抗微生物活性[23,36—41]。Ullal等[23]在斑點(diǎn)叉尾鮰的鰓和皮膚組織中發(fā)現(xiàn)位于血紅蛋白β鏈的116—148位氨基酸的短肽, 其僅對(duì)小瓜蟲滋養(yǎng)體階段有較好的殺傷效果, 對(duì)掠食體和包囊體卻沒有明顯效果。

我們前期在黃顙魚的皮膚黏液蛋白質(zhì)組中也曾發(fā)現(xiàn)血紅蛋白β鏈的碳端序列HBβ-C, 其表達(dá)量在鲇愛德華氏菌感染后明顯上升[24]。本研究合成的黃顙魚HBβ-C抗菌肽對(duì)滋養(yǎng)體階段效果最佳, 僅需要15 μg/mL的HBβ-C抗菌肽能在3min內(nèi)殺死所有滋養(yǎng)體; 黃顙魚HBβ-C處理滋養(yǎng)體后短時(shí)間內(nèi)會(huì)被誘導(dǎo)分泌出黏液囊并急劇運(yùn)動(dòng), 而這種黏液囊與正常滋養(yǎng)體脫離宿主后往包囊體分化時(shí)形成的黏液囊腫非常相似, 而同樣對(duì)多子小瓜蟲具有殺傷作用的抗菌肽Piscidin 1處理后卻并未發(fā)現(xiàn)滋養(yǎng)體分泌黏液囊[42,43]。從誘導(dǎo)滋養(yǎng)體運(yùn)動(dòng)加劇和分泌黏液囊的作用效果來看, 抗菌肽HBβ-C可能誘導(dǎo)滋養(yǎng)體離開宿主并加速分化, 具體還需通過活體試驗(yàn)來進(jìn)一步證實(shí)。此外, 黃顙魚抗菌肽HBβ-C對(duì)掠食體也有殺傷效果, 且高濃度處理包囊體后能導(dǎo)致包囊膜皺縮, 導(dǎo)致體內(nèi)子體旋轉(zhuǎn)加劇甚至從包囊中逃逸出來最終死亡。以上表明黃顙魚的HBβ-C抗小瓜蟲能力高于斑點(diǎn)叉尾鮰的HBβ-C, 抗小瓜蟲能力的差異可能是由于HBβ-C在2個(gè)物種中的序列差異造成的[23]。一般抗菌肽發(fā)揮功能涉及3個(gè)重要特征:α螺旋結(jié)構(gòu)、抗菌肽整體帶正電荷和較高含量的疏水性氨基酸。大量研究表明, α螺旋結(jié)構(gòu)抗菌肽的陽(yáng)離子電荷和疏水性氨基酸對(duì)抗菌作用至關(guān)重要[44—46]。黃顙魚抗菌肽Hbβ-C大部分氨基酸呈α螺旋結(jié)構(gòu), 整體帶+1.5電荷, 疏水率高達(dá)51.8%, 而在斑點(diǎn)叉尾鮰發(fā)現(xiàn)的抗小瓜蟲肽的整體0電荷, 疏水率為45%。

斑點(diǎn)叉尾鮰易患鮰愛德華氏菌引起的鯰魚腸道敗血癥(Enteric septicemia of catfish, ESC), 而藍(lán)鯰(Ictalurus furcatus)對(duì)鮰愛德華氏菌具有較強(qiáng)的抗性, 其雜交種表現(xiàn)出中等抗性水平[47]。本研究發(fā)現(xiàn)全雄黃顙魚對(duì)由多子小瓜蟲引起的白點(diǎn)病具有抗性, 瓦式黃顙魚易感染多子小瓜蟲而快速死亡;但在養(yǎng)殖過程中也偶有報(bào)道全雄和普通黃顙魚感染小瓜蟲的案例, 這可能與養(yǎng)殖條件和魚體本身的健康狀態(tài)有關(guān)系。我們分析雜交黃顙魚和全雄黃顙魚在感染多子小瓜蟲前后HBβ的表達(dá)發(fā)現(xiàn), 雖然雜交黃顙魚的鰓和皮膚組織中HBβ的mRNA表達(dá)量均高于全雄黃顙魚, 然而HBβ蛋白在全雄黃顙魚鰓組織中要明顯高于雜交黃顙魚, 這可能與翻譯效率有關(guān)[48]。在感染小瓜蟲后, 全雄黃顙魚和雜交黃顙魚的鰓和皮膚組織中HBβ的mRNA均顯著上升, 且全雄黃顙魚上升倍率更高。研究者發(fā)現(xiàn)感染多子小瓜蟲產(chǎn)生免疫抗性的鯉中, 掠食體就可以侵入皮膚, 但在感染后2h 80%的多子小瓜蟲消失了, 表明魚體本身可針對(duì)寄生蟲迅速產(chǎn)生反應(yīng)抵抗入侵[49]。在多子小瓜蟲感染后, 全雄黃顙魚能快速合成大量HBβmRNA并高效率翻譯成蛋白質(zhì), 產(chǎn)生的高水平HBβ-C抗菌肽可能有效抵御多子小瓜蟲。此外, 黃顙魚在感染多子小瓜蟲后, 抗菌肽HBβ-C會(huì)富集在多子小瓜蟲表面。多子小瓜蟲的抑動(dòng)抗原(Immobilization antigens)可誘導(dǎo)宿主在血清和黏液中產(chǎn)生抗體, 在體外會(huì)附著在不同生活史階段的多子小瓜蟲上[50]。Xu等[51]發(fā)現(xiàn)免疫球蛋白T和免疫球蛋白M廣泛存在于虹鱒(Oncorhynchus mykiss)皮膚中,當(dāng)多子小瓜蟲感染時(shí)立即附著在其表面?？咕膶?dǎo)致膜破裂主要通過與寄生蟲表面相互作用[52]。殺蟲類抗菌肽發(fā)揮作用主要通過作用于細(xì)胞膜, 擾亂電化學(xué)梯度, 從而引起寄生蟲滲透性休克, 這一過程主要涉及膜電位的迅速崩潰和細(xì)胞內(nèi)ATP下降; 膜通透性增加; 形態(tài)改變?nèi)鐨馀莼蚱屏裑53]。

綜上所述, 目前絕大多數(shù)藥物僅對(duì)多子小瓜蟲的掠食體階段有效, 而對(duì)寄生在魚體表的滋養(yǎng)體階段很難發(fā)揮作用; 黃顙魚抗菌肽HBβ-C對(duì)寄生在魚體的滋養(yǎng)體階段有較好的殺傷效果, 未來可探索利用生物工程技術(shù)對(duì)抗菌肽HBβ-C進(jìn)行規(guī)?；a(chǎn),應(yīng)用到水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中。結(jié)果證明, 全雄黃顙魚對(duì)小瓜蟲病具有抗性, 而雜交黃顙魚易感。全雄黃顙魚和雜交黃顙魚的抗病性能存在差異, 在養(yǎng)殖過程中,可以根據(jù)養(yǎng)殖條件和養(yǎng)殖環(huán)境合理選擇黃顙魚的養(yǎng)殖品種。