李大命，唐晟凱，劉燕山，谷先坤，殷稼雯，蔣琦辰，張彤晴，潘建林

（江蘇省內(nèi)陸水域漁業(yè)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室江蘇省淡水水產(chǎn)研究所，南京 210017）

0 引言

湖鱭(Coilia nasustaihuensis)是一種常見的小型魚類，一般認(rèn)為其是刀鱭(Coilia nasus)的淡水定居生態(tài)類型，隸屬于鯡形目、鳀亞科、鱭屬，終生生活在江河和湖泊內(nèi)，與洄游型刀鱭在生態(tài)習(xí)性和形態(tài)上有一定差別[1-2]。湖鱭喜集群，游泳迅速，拓殖能力強(qiáng)，且具有性成熟早、繁殖率高、食性廣等特點(diǎn)[2-3]。近幾十年來湖鱭資源量迅速增長(zhǎng)，逐漸成為淡水湖泊魚類群落中的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)種群，同時(shí)也是湖泊漁業(yè)重要的捕撈對(duì)象[4-6]。目前湖鱭的研究主要集中在生長(zhǎng)規(guī)律[7-8]、種群年齡結(jié)構(gòu)[7-8]、食物組成[6,9]等基礎(chǔ)生物學(xué)及種群數(shù)量變動(dòng)等方面[3,10]，而有關(guān)湖鱭的遺傳學(xué)資料相對(duì)缺乏。掌握物種的遺傳多樣性是物種管理保護(hù)和開發(fā)利用需要了解的重要內(nèi)容，也是評(píng)價(jià)生物遺傳資源的重要依據(jù)。線粒體DNA(Mitochondrial DNA, mtDNA)具有相對(duì)較高的進(jìn)化速率、嚴(yán)格的母性遺傳以及幾乎不存在重組等特點(diǎn)[11]。細(xì)胞色素b(Cytochrome b,Cyt b)基因是一段編碼蛋白質(zhì)的DNA 序列，其進(jìn)化速度適中，被廣泛運(yùn)用于魚類遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)研究[12-14]。

迄今大部分針對(duì)魚類的群體遺傳學(xué)研究主要集中在經(jīng)濟(jì)魚類或者瀕危魚類，而對(duì)經(jīng)濟(jì)相對(duì)偏低的小型魚類的研究常被忽視[15]。一方面，湖鱭作為一種小型經(jīng)濟(jì)魚類其天然資源面臨過度開發(fā)利用、種群組成低齡化等問題[3,6]；另一方面，湖鱭占據(jù)優(yōu)勢(shì)會(huì)導(dǎo)致魚類群落結(jié)構(gòu)向小型化發(fā)展，進(jìn)而會(huì)導(dǎo)致漁產(chǎn)力下降及影響湖泊生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定[16-17]。因此，如何科學(xué)管理和合理利用湖鱭資源，對(duì)于湖泊漁業(yè)資源可持續(xù)發(fā)展及生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定具有重要意義。本研究采集江蘇省長(zhǎng)江水系的太湖、滆湖及淮河水系的高郵湖、洪澤湖、白馬湖、駱馬湖共6 個(gè)湖鱭群體，以Cyt b 基因?yàn)榉肿訕?biāo)記，研究江蘇省湖鱭群體的遺傳多樣性、遺傳結(jié)構(gòu)及進(jìn)化歷史，以期了解湖鱭的遺傳資源現(xiàn)狀，進(jìn)而為湖鱭種質(zhì)資源的管理及利用提供重要參考。

1 材料和方法

1.1 樣品采集

于2016—2018年，用刺網(wǎng)采集江蘇省長(zhǎng)江流域的太湖、滆湖及淮河流域的高郵湖、洪澤湖、白馬湖、駱馬湖6個(gè)湖泊的湖鱭群體共計(jì)224尾個(gè)體。采樣時(shí)間、地點(diǎn)及樣本量見表1。將樣本用無水乙醇中固定，帶回實(shí)驗(yàn)室置于-20℃低溫冰箱保存。

表1 湖鱭樣品信息

1.2 基因組DNA提取、PCR擴(kuò)增和序列測(cè)定

購(gòu)置基因組DNA提取試劑盒，按照說明書步驟和要求提取樣品的基因組DNA，所提取的總DNA 溶于TE 溶液，-20℃保存?zhèn)溆?。使用分光光度?jì)測(cè)定DNA濃度，采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)檢測(cè)DNA 的完整性。

使用通用引物L(fēng)14724和H15915擴(kuò)增Cyt b序列，引 物 序 列 為 L14724：5’- GACTTGAAAAACCACCGTTG- 3’，H15915：5’- CTCCGATCTCCGG ATTACAAGAC-3’[18]。PCR反應(yīng)總體系為50μL，包括2×TaqMaster Mix(TaKaRa)25μL、上下游引物各1.0 μL(0.01 mmol/L)、DNA模板1.0μL，超純水補(bǔ)足體積。將反應(yīng)液充分混勻，10000 r/min冷凍離心30 s，將反應(yīng)管放入PCR 儀。PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃變性4 min；94℃變性40 s，53℃退火50 s，72℃延伸60 s，共35 個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。

PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄。用膠回收純化試劑盒將目標(biāo)擴(kuò)增回收純化，送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用DNAstar 軟件和Clustal X 2.0 軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行序列編輯、校對(duì)和排序。使用Mega7.0 軟件統(tǒng)計(jì)堿基組成，計(jì)算群體間的遺傳距離。以大銀魚（Protosalanx hyalocranius，GenBank 登 錄 號(hào)：NC_024109.1）和鳳鱭（Coilia mystus，GenBank 登錄號(hào)：MH465026.1）為外類群，采用鄰接法(Neighborjoining,NJ)構(gòu)建單倍型分子系統(tǒng)進(jìn)化樹，系統(tǒng)樹中節(jié)點(diǎn)的自舉置信水平應(yīng)用自引導(dǎo)估計(jì)，重復(fù)次數(shù)為1000次。使用DNA SP 5.0 軟件計(jì)算群體的單倍型多樣性(h)和核苷酸多樣性(π)。利用Arlequin 3.5軟件進(jìn)行分子方差分析，估算遺傳變異在種群間和種群內(nèi)的分布，計(jì)算種群間的遺傳分化指數(shù)及其P值，并采用中性檢驗(yàn)以及核苷酸不配對(duì)分布來檢測(cè)種群歷史動(dòng)態(tài)。使用Network 軟件構(gòu)建單倍型網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖，檢測(cè)各個(gè)單倍型間的進(jìn)化關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 Cyt b序列變異及種群遺傳多樣性

本研究獲得224尾樣本的Cyt b基因全序列，長(zhǎng)度為1141 bp。224條序列共檢出62個(gè)變異位點(diǎn)，其中單一位點(diǎn)35個(gè)，簡(jiǎn)約位點(diǎn)27個(gè)，沒有插入/缺失位點(diǎn)。堿基組成分析顯示，堿基A、T、G和C的平均含量分別為27.8%、30.6%、14.5%和27.1%，A+T 的含量(58.4%)明顯高于G+C的含量(41.6%)，表現(xiàn)出明顯的A T偏好和反G偏倚特點(diǎn)。

224 尾個(gè)體共定義57 種單倍型(H1～H57)，其中H49 是6 個(gè)種群的共享單倍型，也是占比最高的單倍型（表2）。滆湖、太湖、高郵湖、白馬湖、洪澤湖及駱馬湖群體分別擁有16種、17種、13種、13種、13種和8種單倍型，且每個(gè)種群都擁有數(shù)量不等的獨(dú)享單倍型。6個(gè)湖鱭種群的平均單倍型和核苷酸多樣性分別為0.783±0.028和0.00260±0.00019，其中滆湖種群的遺傳多樣性最高，駱馬湖種群的遺傳多樣性最低（表2）。

表2 基于Cyt b基因的湖鱭群體遺傳多樣性參數(shù)

2.2 種群遺傳結(jié)構(gòu)分析

6個(gè)群體間的遺傳距離顯示（表3），滆湖與高郵湖群體間的遺傳距離最大，為0.00419，洪澤湖和駱馬湖群體間的遺傳距離最小，為0.00178。長(zhǎng)江水系太湖和滆湖群體間的遺傳距離為0.00418，淮河水系4個(gè)湖鱭群體間的遺傳距離為0.00178～0.00240。

表3 湖鱭群體間的遺傳距離（對(duì)角線下方）和分化系數(shù)（對(duì)角線上方）

對(duì)湖鱭群體間的遺傳變異進(jìn)行分子方差分析(AMOVA)（表4），結(jié)果表明，8.55%的變異發(fā)生在群體間，91.45%的變異發(fā)生群體內(nèi)，說明分子變異主要來源于群體內(nèi)個(gè)體間，群體間的Fst值統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)具有極顯著性差異（表4）。將6 個(gè)種群分為長(zhǎng)流水系組群（滆湖、太湖種群）和淮河水系組群（高郵湖、白馬湖、洪澤湖和駱馬湖種群），進(jìn)行分子方差分析，結(jié)果表明，長(zhǎng)江水系組群和淮河水系組群的組間分子變異占總變異的百分比為1.08%，組內(nèi)群體間分子變異占7.95%，群體內(nèi)分子變異占90.97%，兩組群的分子變異主要來自群體內(nèi)，兩組間的Fct值統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)無顯著性差異，組內(nèi)群體間的Fsc值和群體內(nèi)的Fst值統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)有極顯著性差異（表4）。

表4 湖鱭種群間遺傳差異的分子方差分析

進(jìn)一步分析兩兩種群間的遺傳分化（表3），結(jié)果顯示，滆湖群體與其他5個(gè)群體間的Fst均大于0.15，且差異極顯著(P<0.01)，表明滆湖群體與其他群體間存在極顯著遺傳差異。除滆湖群體外，其他5 個(gè)群體間的Fst均小于0.05，且差異不顯著(P>0.05)，表明5個(gè)群體間沒有顯著的遺傳分化。

2.3 分子系統(tǒng)發(fā)育分析

以鳳鱭和大銀魚為外類群，基于鄰接法構(gòu)建湖鱭Cyt b基因單倍型之間的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1），結(jié)果顯示，所有的湖鱭單倍型聚為一支，各種群的單倍型混雜分布，沒有形成與地理分布相對(duì)應(yīng)的遺傳結(jié)構(gòu)，只有滆湖種群的部分單倍型(H19～H25)形成了置信度較高的進(jìn)化分支。利用Network軟件構(gòu)建了湖鱭單倍型的進(jìn)化網(wǎng)絡(luò)關(guān)系（圖2），結(jié)果顯示，單倍型H49 是6 個(gè)群體的共享單倍型，位于網(wǎng)絡(luò)進(jìn)化圖中心，數(shù)量也最多，推測(cè)可能為湖鱭的祖先單倍型。各種群的單倍型并沒有按地理位置形成獨(dú)立的分支，而是以主單倍型為中心的形成星形放射狀結(jié)構(gòu)。滆湖群體的部分特有單倍型(H19～H25)與祖先單倍型相距較遠(yuǎn)，形成了相對(duì)獨(dú)立的進(jìn)化分支。單倍型網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)圖進(jìn)一步支持了分子系統(tǒng)發(fā)生樹。

圖1 基于Cyt b序列構(gòu)建的湖鱭單倍型系統(tǒng)發(fā)育樹

圖2 湖鱭的Cyt b基因單倍型進(jìn)化網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 種群歷史動(dòng)態(tài)分析

對(duì)湖鱭群體進(jìn)行Tajima’sD和Fu’sFs中性檢驗(yàn)分析，結(jié)果顯示，滆湖群體的Tajima’sD和Fu’sFs中性檢測(cè)值為負(fù)值，但統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)均不顯著；其他5個(gè)群體的中性檢測(cè)值為負(fù)值，且統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)有顯著或極顯差異（表5）。歧點(diǎn)分布圖分析顯示，滆湖群體的歧點(diǎn)分布圖呈多峰型，其他5個(gè)群體的歧點(diǎn)分布圖呈單峰型（圖3）。由此可以推測(cè)，除滆湖群體外，其他5個(gè)群體進(jìn)化過程中經(jīng)歷過種群擴(kuò)張。將6個(gè)群體作為一個(gè)整體進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，歧點(diǎn)分布圖呈單峰型（圖3），中性檢測(cè)值為負(fù)值且有極顯著性差異（表5），表明湖鱭群體在歷史上經(jīng)歷了顯著的種群擴(kuò)張。

圖3 湖鱭種群Cyt b基因序列的歧點(diǎn)分布圖

表5 基于Cyt b基因的湖鱭群體中性檢驗(yàn)及種群擴(kuò)張時(shí)間估算

根據(jù)種群的擴(kuò)張參數(shù)τ來估算群體的擴(kuò)張時(shí)間，線粒體DNA的蛋白質(zhì)編碼基因變異速率為2%每百萬年[19]。經(jīng)計(jì)算，太湖、白馬湖和駱馬湖種群的擴(kuò)張發(fā)生在約0.11 百萬年前，高郵湖種群的擴(kuò)張發(fā)生在約0.12百萬年前，洪澤湖種群的擴(kuò)張發(fā)生在約0.13 百萬年前。整個(gè)湖鱭種群的擴(kuò)張發(fā)生在約0.23百萬年前（表4）。

3 討論

3.1 湖鱭種群遺傳多樣性分析

在線粒體的眾多基因中，Cyt b 基因進(jìn)化速度適中，轉(zhuǎn)換或顛換比例較大，被廣泛應(yīng)用于魚類系統(tǒng)發(fā)育及遺傳多樣性研究。本研究對(duì)6 個(gè)湖鱭群體的Cyt b基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測(cè)序，分析群體間序列組成及變異。結(jié)果顯示，所有序列共發(fā)現(xiàn)62 個(gè)變異位點(diǎn)，變異率為5.43%。湖鱭群體的Cyt b 序列堿基組成基本一致，其中AT的含量(58.4%)明顯高于GC含量(41.6%)，而堿基G的含量最低，表現(xiàn)出明顯的AT偏好性。

單倍型多樣度(h)和核苷酸多樣度(π)是衡量物種或種群線粒體DNA變異程度的2個(gè)重要指標(biāo)，其值越大，表明群體的遺傳多樣性就越高[20]。本研究通過Cyt b 基因?qū)K省6 個(gè)湖泊湖鱭群體進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果顯示，6個(gè)群體的單倍型多樣性為0.717±0.060～0.875 ± 0.044，核 苷 酸 多 樣 性 為0.00180 ±0.00034～0.00425±0.00033，6個(gè)群體總體單倍型和核苷酸多樣性分別為0.783±0.028 和0.00260±0.00019。Grant 和Bowen 以單倍型多樣性0.5 為臨界值、核苷酸多樣性0.005 為臨界值將單倍型多樣性和核苷酸多樣性之間的關(guān)系分為4種類型：低h(<0.5)和低π(<0.005)；高h(yuǎn)和低π；低h和高π；高h(yuǎn)和高π?？梢钥闯觯q種群的遺傳多樣性屬于第二種類型，具有較高的單倍型多樣性，表明湖鱭種群具有較豐富的遺傳多樣性，這可能與湖鱭的棲息生境及種群大小有密切關(guān)系。湖鱭性成熟早、繁殖率高、食性廣、游泳迅速、適應(yīng)能力強(qiáng)，具有廣闊的生存空間，形成了種群數(shù)量龐大的群體，奠定了湖鱭具有豐富遺傳多樣性的基礎(chǔ)。Ma 等[21]報(bào)了國(guó)內(nèi)其他湖泊湖鱭群體的遺傳多樣性，如巢湖、洞庭湖、鄱陽湖等群體也都顯示了較豐富的遺傳多樣性。種群遺傳多樣性形成與進(jìn)化歷史密切相關(guān)，種群具有高h(yuǎn)和低π可能受到瓶頸效應(yīng)的影響[20]。一般來說，種群受遭遇瓶頸效應(yīng)后數(shù)量迅速增加，導(dǎo)致種群?jiǎn)伪缎投鄻有匝杆偕?，由于核苷酸多樣性的積累時(shí)間遠(yuǎn)大于單倍型多樣性，因此核苷酸多樣性仍處于較低水平。一般用Tajima’sD和Fu’sFs中性檢驗(yàn)推測(cè)種群的歷史動(dòng)態(tài)，當(dāng)中性檢驗(yàn)結(jié)果為負(fù)值，并且在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性差異，可能預(yù)示著種群經(jīng)歷過一個(gè)擴(kuò)張的歷史[22-23]。本研究結(jié)果顯示，湖鱭群體的Tajima’sD和Fu’sFs中性檢測(cè)結(jié)果均為負(fù)值，統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)均有顯著或極顯著差異，這說明湖鱭種群進(jìn)化過程中偏離了中性選擇，經(jīng)歷了種群擴(kuò)張，進(jìn)而形成了高h(yuǎn)和低π的遺傳多樣性模式。

3.2 湖鱭種群遺傳結(jié)構(gòu)分析

遺傳分化指數(shù)Fst是反映群體遺傳組成的重要參數(shù)，F(xiàn)st值越大則表示遺傳分化程度越大。Freeland等[24]提出，以Fst值0.05、0.15和0.25為臨界值指示遺傳分化程度。本研究中，未分組的AMOVA結(jié)果顯示，湖鱭總的Fst值為0.08553，且具有極顯著差異，表明種群間有顯著遺傳分化。而分組的AMOVA 結(jié)果顯示，組間的Fct為0.01084(P>0.05)，表明組間無顯著遺傳差異，組內(nèi)種群間的Fsc值為0.08035，種群內(nèi)的Fst值為0.09032，且都具有極顯著差異，表明湖鱭組內(nèi)種群間及種群內(nèi)均有顯著遺傳分化。兩兩群體間的Fst統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，滆湖群體與其他群體間的Fst值均大于0.15，且統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)具有極顯著性差異。除滆湖群體外，其他5 個(gè)群體間Fst值為-0.01588～0.01533，且統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)沒有顯著性差異?？梢缘贸?，滆湖群體與其他群體間具有顯著遺傳分化，而其他群體間無遺傳分化。同時(shí)，Cyt b 基因單倍型的分子系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示，6 個(gè)群體的單倍型沒有聚成各自的分支，單倍型間的聚類關(guān)系沒有與群體地理位置形成對(duì)應(yīng)關(guān)系，僅有滆湖的部分單倍型形成了獨(dú)立的進(jìn)化分支，系統(tǒng)進(jìn)化樹支持群體間的遺傳關(guān)系。

太湖和滆湖位于長(zhǎng)江以南同屬長(zhǎng)江流域；高郵湖、白馬湖、洪澤湖和駱馬湖位于長(zhǎng)江以北均屬淮河流域。滆湖與太湖群體間有極顯著的遺傳分化，而太湖群體與淮河流域的4 個(gè)群體間沒有顯著遺傳差異，表明湖鱭群體的遺傳結(jié)構(gòu)與群體所處水系及地理位置的遠(yuǎn)近沒有相關(guān)性。而Ma 等[21]對(duì)中國(guó)4 個(gè)水系的10 個(gè)湖鱭種群的遺傳多樣性和遺傳結(jié)果進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)地理距離是導(dǎo)致的種群遺傳分化的主要因素。通常情況下，同一水系內(nèi)群體間有廣泛的基因交流，群體間不會(huì)出現(xiàn)遺傳分化或遺傳分化較??；地理距離越大，基因交流的概率會(huì)隨之減小，更容易出現(xiàn)遺傳分化[25-27]。但地理距離與遺傳關(guān)系不相關(guān)的現(xiàn)象在魚類中也有較多報(bào)道[28-29]。湖鱭種群的遺傳結(jié)構(gòu)可能與種群的棲息環(huán)境、水利工程及種群歷史動(dòng)態(tài)等因素有關(guān)。首先，6 個(gè)湖泊的生態(tài)環(huán)境及水文有較大差異，不利于魚類之間的基因交流。其次，由于興建了大量的水利工程，直接阻礙了湖泊及水系間魚類的基因交流。滆湖與其他湖泊沒有直接的水道連接或連接水道受阻，而其他湖泊通過京杭大運(yùn)河連通，促進(jìn)了湖泊間魚類種群的擴(kuò)散和基因交流[30]。最后，在種群進(jìn)化過程中，滆湖種群較為穩(wěn)定，沒有發(fā)生顯著的種群擴(kuò)張，而其他湖泊種群均經(jīng)歷了顯著的種群擴(kuò)張過程，種群擴(kuò)張過程促進(jìn)了種群間的基因擴(kuò)散，有利于消除種群間的遺傳差異。

3.3 湖鱭種質(zhì)資源管理和利用建議

目前，湖鱭已成為江蘇省淡水湖泊魚類群落中的優(yōu)勢(shì)種群，也是漁業(yè)生產(chǎn)中的重要捕撈對(duì)象。同時(shí)也面臨資源過度開發(fā)利用、種群組成趨于低齡化等問題。本研究結(jié)果顯示，江蘇省6 個(gè)湖鱭種群遺傳多樣性較為豐富，均具有高單倍型多態(tài)性和低核苷酸多態(tài)性的特征。滆湖種群的遺傳多樣性最豐富，擁有的私有單倍型最多，且與其他種群之間具有顯著的遺傳分化，應(yīng)將滆湖群體單獨(dú)作為一個(gè)進(jìn)化顯著單元進(jìn)行管理和利用，其他5 個(gè)群體作為一個(gè)整體進(jìn)行管理和利用。一方面，需要嚴(yán)格控制湖泊漁業(yè)資源的捕撈強(qiáng)度，禁止對(duì)湖鱭資源過度開發(fā)利用，可通過增大漁具網(wǎng)目尺寸和提高開捕年齡來改善湖鱭種群年齡組成。另一方面，可通過適量增殖放流肉食性的翹嘴鲌、鱖等魚類，控制湖鱭種群數(shù)量，優(yōu)化湖泊魚類群落結(jié)構(gòu)，促進(jìn)湖泊漁業(yè)資源可持續(xù)健康發(fā)展。

4 結(jié)論

總之，江蘇省6 個(gè)湖泊湖鱭群體的遺傳多樣性比較豐富，且呈現(xiàn)出高單倍型多樣性和低和低核苷酸多樣性的特點(diǎn)，單倍型多樣性和核苷酸多樣性分別為0.717 ± 0.060～0.875 ± 0.044 和0.00180 ± 0.00034～0.00425±0.00033，在進(jìn)化過程中，滆湖群體較為穩(wěn)定，沒有發(fā)生顯著的種群擴(kuò)張，而其他群體則經(jīng)歷了明顯的種群擴(kuò)張過程，這也是導(dǎo)致滆湖群體與其他群體產(chǎn)生遺傳分化的因素之一。滆湖群體與其他群體間的Fst值均大于0.15，且統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)具有極顯著性差異(P<0.01)，滆湖群體與其他群體間具有極顯著的遺傳分化，因此應(yīng)將滆湖群體與其他群體作為不同的進(jìn)化顯著單元進(jìn)行管理和利用。