賈晨 王丹 王琪 劉磊 曲連海 周琦

摘 要：本文介紹了副溶血弧菌的傳統(tǒng)檢測(cè)方法、免疫學(xué)檢測(cè)方法和分子生物學(xué)檢測(cè)方法等幾種快速的檢測(cè)方法，通過對(duì)多種檢測(cè)方法的優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行分析，為食品行業(yè)中副溶血弧菌的檢測(cè)方法選擇方面提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：副溶血弧菌;培養(yǎng)法;免疫學(xué)檢測(cè);分子生物學(xué)檢測(cè)

副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus，VP）是一種革蘭氏陰性嗜鹽性弧菌[1]，常在河口、海底沉積物等海洋環(huán)境中，以及魚貝類等海產(chǎn)品中檢出較多[2]。副溶血弧菌不僅嚴(yán)重危害海水養(yǎng)殖業(yè)，還能引發(fā)人類胃腸炎、食物中毒等，是一種條件致病菌[3]。近年來(lái)，由于誤食受副溶血弧菌污染或加工不當(dāng)?shù)暮．a(chǎn)品而導(dǎo)致的食物中毒事件層出不窮，在我國(guó)部分沿海地區(qū)，細(xì)菌性食物中毒位居首位[4-5]。通過對(duì)副溶血弧菌的快速檢測(cè)，可以有效防止相關(guān)疾病的傳播和發(fā)生。近年來(lái)，對(duì)副溶血弧菌檢測(cè)方法的研究取得了較大的進(jìn)展，本文主要通過對(duì)多種檢測(cè)方法的優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行分析，為檢測(cè)方法的選擇提供理論基礎(chǔ)。

1 培養(yǎng)法

目前，傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法是國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)對(duì)于副溶血弧菌的檢測(cè)[6]，根據(jù)檢測(cè)需求，分為定性檢測(cè)和定量檢測(cè)。取樣品25 g置于3%氯化鈉堿性蛋白胨水（APW）中，分別進(jìn)行定性的增菌和定量的梯度稀釋后，接種到TCBS或弧菌顯色培養(yǎng)基中。挑取可疑菌落，進(jìn)行生理生化鑒定，如氧化酶試驗(yàn)、革蘭氏染色鏡檢、三糖鐵試驗(yàn)、嗜鹽性試驗(yàn)、生化鑒定、血清學(xué)試驗(yàn)、神奈川試驗(yàn)等，整體操作時(shí)間過長(zhǎng)，涉及到的試驗(yàn)方法以及試劑過多，易造成檢測(cè)結(jié)果出錯(cuò)。

1.1 顯色培養(yǎng)基

顯色培養(yǎng)基是近些年逐步應(yīng)用在檢測(cè)行業(yè)的傳統(tǒng)培養(yǎng)基代替品，它是一類由目標(biāo)微生物的代謝產(chǎn)物中的酶，與特異性的酶顯色底物進(jìn)行反應(yīng)，顯色酶底物與微生物代謝酶相結(jié)合，顯色基團(tuán)游離進(jìn)而顯色的原理，檢測(cè)目標(biāo)微生物的新型培養(yǎng)基。與傳統(tǒng)的培養(yǎng)基相比，顯色培養(yǎng)基具有較高的靈敏度和特異性。OLIVIA等[7]使用弧菌的顯色培養(yǎng)基和傳統(tǒng)培養(yǎng)基對(duì)于河口不同季節(jié)的水樣進(jìn)行測(cè)定，通過對(duì)菌株的測(cè)序，驗(yàn)證了傳統(tǒng)培養(yǎng)基對(duì)創(chuàng)傷弧菌的假陽(yáng)性率有2%，霍亂弧菌的假陽(yáng)性率為19%，而副溶血弧菌的假陽(yáng)性率達(dá)到59%。弧菌的顯色可以顯著降低假陽(yáng)性率2～5倍。EDDABRA等[8]對(duì)96個(gè)糞便和拭子樣本進(jìn)行測(cè)試，通過顯色培養(yǎng)基和TCBS（硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖瓊脂培養(yǎng)基）對(duì)比發(fā)現(xiàn)，霍亂弧菌在顯色培養(yǎng)基的檢出率為34%，在TCBS中的檢出率為31%。對(duì)霍亂弧菌和副溶血弧菌的特異性進(jìn)行檢測(cè)，顯色培養(yǎng)基的特異性達(dá)到100%，而TCBS的特異性只有93.33%。顯色培養(yǎng)基的特異性明顯高于TCBS。

1.2 微生物測(cè)試片

微生物測(cè)試片是預(yù)制型的培養(yǎng)基，采用快速擴(kuò)散技術(shù)、新一代微生物顯色等創(chuàng)新技術(shù)，可實(shí)現(xiàn)菌落的快速增殖和判讀，提高實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)效率。許如蘇等[9]以副溶血弧菌、霍亂弧菌、溶藻弧菌等49株標(biāo)準(zhǔn)菌對(duì)測(cè)試片的敏感性、特異性和可重復(fù)性進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，副溶血弧菌在測(cè)試片上表現(xiàn)為紫色菌落，其他非目標(biāo)微生物顯示藍(lán)色或者不生長(zhǎng);重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果相對(duì)偏差偏低，檢測(cè)結(jié)果良好。但是由于需要考慮實(shí)際樣本中的副溶血弧菌的檢測(cè)以及樣品的適應(yīng)性等多種因素干擾，有較高的難度。

2 免疫學(xué)檢測(cè)方法

免疫學(xué)檢測(cè)方法主要有酶聯(lián)免疫法吸附法、血清型法、免疫熒光技術(shù)、免疫擴(kuò)散技術(shù)、免疫膠體金技術(shù)和免疫印跡技術(shù)等[10]。它們主要的原理是應(yīng)用抗原和抗體的特異性進(jìn)行檢測(cè)。但是免疫學(xué)檢測(cè)方法對(duì)于抗體的特異性要求較高，同時(shí)最低檢出限偏高，導(dǎo)致漏檢的可能性。

2.1 免疫膠體金技術(shù)

免疫膠體金技術(shù)是采用抗原抗體相結(jié)合的原理，以膠體金作為標(biāo)志物的一種免疫標(biāo)記技術(shù)。朱慧等[11]制備了兔抗副溶血弧菌多克隆抗體，并對(duì)其效價(jià)進(jìn)行測(cè)定，提取副溶血弧菌的外膜蛋白、鞭毛蛋白、胞外產(chǎn)物和全菌破碎蛋白，確定4種標(biāo)記蛋白的濃度，以及抗原蛋白的特異性檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果表明膠體金試紙條準(zhǔn)確鑒定出副溶血弧菌，排除其他非目標(biāo)菌的交叉反應(yīng)干擾，對(duì)人工感染的結(jié)果可以進(jìn)行準(zhǔn)確判斷。

2.2 酶聯(lián)免疫吸附法

酶聯(lián)免疫吸附法簡(jiǎn)稱ELISA，是酶聯(lián)免疫中應(yīng)用較廣的免疫測(cè)定技術(shù)。其原理是抗原或抗體固定在載體表面，在載體表面發(fā)生抗原抗體反應(yīng)，酶與底物發(fā)生顯色反應(yīng)，洗滌后，可通過吸光值進(jìn)行檢測(cè)。ELISA方法可以進(jìn)行定性或者定量的分析。李國(guó)等[12]從瀕死的文蛤中分離鑒定出一株副溶血弧菌，并用該菌苗制備兔抗血清，以HRP-羊抗兔IgG為酶標(biāo)二抗，對(duì)人工感染副溶血弧菌的樣本進(jìn)行ELISA檢測(cè)。結(jié)果顯示，采用間接ELISA技術(shù)檢測(cè)副溶血弧菌，人工污染的文蛤樣本副溶血弧菌的檢出率為80%，健康文蛤樣本的副溶血弧菌檢出率為15%。結(jié)果表明ELISA檢測(cè)法可以用于發(fā)病文蛤的檢測(cè)，但還是有假陰性存在。

3 分子生物學(xué)檢測(cè)方法

3.1 PCR方法

隨著分子生物學(xué)的飛速發(fā)展，PCR的方法已經(jīng)被逐漸的寫入標(biāo)準(zhǔn)中。PCR方法（Polymerase chain reaction，PCR），又稱聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是一種通過溫度控制可實(shí)現(xiàn)體外擴(kuò)增特異DNA片段的技術(shù)。PCR檢測(cè)具有靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)。KIM等[13]基于toxR基因的PCR方法檢測(cè)副溶血弧菌，采用28個(gè)目標(biāo)和非目標(biāo)菌株建立了PCR檢測(cè)方法，通過494株菌株檢測(cè)目標(biāo)菌株的特異性。結(jié)果75.5%的副溶血弧菌較強(qiáng)的特異性，非目標(biāo)菌株沒有得到擴(kuò)增。PCR檢測(cè)方法雖然靈敏度較高，但是過于依賴目標(biāo)基因的分離和富集，且易受到程序設(shè)置的干擾。

3.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)具有靈敏度高、重復(fù)性好、準(zhǔn)確性高等優(yōu)點(diǎn)。王建昌等[14]根據(jù)已知的副溶血弧菌基因組序列，篩選特異性靶基因，設(shè)計(jì)特異性引物探針，優(yōu)化反應(yīng)體系，并在體系內(nèi)加入內(nèi)參（IAC），通過標(biāo)記不同熒光基團(tuán)的Taqman探針來(lái)監(jiān)測(cè)IAC，進(jìn)而實(shí)時(shí)監(jiān)控整個(gè)PCR反應(yīng)。建立gyrB-IAC相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)曲線，Ct值與拷貝數(shù)有良好的線性關(guān)系;人工污染的初始菌量為7 cfu/25 g，樣品增菌6 h后，副溶血弧菌即可檢出。胡興娟等[15]針對(duì)副溶血性弧菌tlh基因，沙門菌Ompc基因和單增李斯特菌hly基因設(shè)計(jì)引物和TaqMan探針，建立3種致病菌的多重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)體系，并對(duì)海產(chǎn)品中的副溶血性弧菌、沙門菌和單增李斯特菌的進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果3種目標(biāo)致病菌均可得到特異性擴(kuò)增，而其他非目標(biāo)細(xì)菌均未見特異性擴(kuò)增曲線。該體系對(duì)副溶血性弧菌、沙門氏菌和單增李斯特菌的最低檢測(cè)限均小于

100 cfu/mL。并對(duì)150粉實(shí)際樣本進(jìn)行檢測(cè)，與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)法檢出率一致。

3.3 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是一種新型的核酸擴(kuò)增方法，其特點(diǎn)是在鏈置換特異的DNA聚合酶（Bst DNA polymerase）的作用下，設(shè)計(jì)4種特異引物，進(jìn)行60～65 ℃恒溫?cái)U(kuò)增，15～60 min即可實(shí)現(xiàn)核酸擴(kuò)增，具有操作簡(jiǎn)單、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)。反應(yīng)過程中加入染料等，在DNA合成時(shí)，從脫氧核糖核酸三磷酸底物（dNTPs）中析出產(chǎn)生大量焦磷酸鎂沉淀，呈現(xiàn)白色。因此，只需肉眼觀察產(chǎn)物中的濁度即可，操作過程簡(jiǎn)單，結(jié)果易判讀。胡元慶等[16]用tlh基因作為副溶血弧菌的靶向基因，設(shè)計(jì)了4條引物，優(yōu)化LAMP檢測(cè)方法中的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件。體系用Bst DNA聚合酶催化，恒溫反應(yīng)60 min，產(chǎn)物分別用2%瓊脂糖凝膠電泳和SYBR Green I染色鑒定，對(duì)各項(xiàng)反應(yīng)參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化;將菌液的10倍稀釋液進(jìn)行LAMP和PCR反應(yīng)，并對(duì)32株食源性病原菌進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，驗(yàn)證其特異性;結(jié)果顯示，確定25 μL體系中Mg2+濃度為3.6 mmol/L，dNTPs濃度為0.96 mmol/L，聚合酶用量為4.8 U，內(nèi)外引物濃度比為8∶1，最佳反應(yīng)溫度為63 ℃，時(shí)間為60 min;LAMP的最低檢測(cè)限明顯低于PCR檢出限;對(duì)32個(gè)菌株進(jìn)行特異性檢測(cè)，陽(yáng)性率為100%，說明LAMP具有較高的特異性。

3.4 重組酶聚合酶等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

重組酶聚合酶等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（Recombinase Polymerase Amplification，RPA），是可以替代傳統(tǒng)PCR的核酸檢測(cè)技術(shù)，是新一代的等溫?cái)U(kuò)增核酸檢測(cè)技術(shù)。RPA技術(shù)基于重組酶聚合酶，且最佳反應(yīng)溫度在20～37 ℃，20 min內(nèi)完成擴(kuò)增反應(yīng)。劉小青等[17]采用RPA技術(shù)，建立了以irgB為靶基因的RPA-exo副溶血弧菌的引物探針，對(duì)引物探針進(jìn)行組合篩選，建立RPA-exo熒光探針快速檢測(cè)方法，

15 min可完成檢測(cè)，具有高特異性，無(wú)交叉反應(yīng)，靈敏度較高;人工污染樣品加入終濃度為1.36×103 CFU/mL時(shí)，無(wú)需增菌即可被檢出;實(shí)際樣品檢測(cè)檢測(cè)結(jié)果與GB 4789.7—2013結(jié)果一致。

4 結(jié)語(yǔ)

副溶血弧菌的檢測(cè)方法各有優(yōu)缺點(diǎn)。傳統(tǒng)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法要經(jīng)過培養(yǎng)基的基礎(chǔ)培養(yǎng)，挑取可疑菌落分離、增菌、鏡檢和生化鑒定等煩瑣步驟;顯色培養(yǎng)基和微生物測(cè)試片使用方便，但需要具有特異性較高的酶底物。免疫學(xué)檢測(cè)方法對(duì)于抗體的特異性要求較高，同時(shí)最低檢出限偏高，導(dǎo)致漏檢的可能性。分子生物學(xué)檢測(cè)方法具有靈敏度高、重復(fù)性好、反應(yīng)高效、準(zhǔn)確性高等優(yōu)勢(shì)，但是過于依賴目標(biāo)基因的分離和富集，且容易受到程序設(shè)置的干擾。

食品中副溶血弧菌檢測(cè)方法有傳統(tǒng)檢測(cè)方法、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、LAMP、RPA 和MPCR-DHPLC法等，并可以多種結(jié)合進(jìn)行目標(biāo)菌株鑒定。多種檢測(cè)方法相結(jié)合，融合多種優(yōu)勢(shì)，如LAMP技術(shù)與生物傳感器技術(shù)相結(jié)合，酶聯(lián)免疫磁珠技術(shù)與PCR技術(shù)相結(jié)合，MALDI-TOF MS與16S rRNA鑒定相結(jié)合。基因芯片技術(shù)融合了PCR、納米芯片和探針雜交。

上述針對(duì)副溶血弧菌的相關(guān)檢測(cè)方法，無(wú)論是從科學(xué)調(diào)查角度還是食品安全角度來(lái)說，對(duì)副溶血弧菌的有效檢測(cè)都存在著重要的研究意義。這些方法存在著一些不可忽視的問題，應(yīng)當(dāng)綜合考慮各檢測(cè)方法優(yōu)劣勢(shì)，在多項(xiàng)技術(shù)的基礎(chǔ)上建立可以滿足多方面需求的快速、高效、經(jīng)濟(jì)的檢測(cè)方法，才能實(shí)現(xiàn)副溶血弧菌的有效檢測(cè)，保障食品安全。

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