尹樂斌，劉丹，何平，廖聰，楊愛蓮

(1.邵陽學(xué)院 食品與化學(xué)工程學(xué)院，湖南 邵陽 422000；2.邵陽學(xué)院豆制品加工與安全控制湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 邵陽 422000)

豆清液又名黃漿水，是豆制品生產(chǎn)過程中的副產(chǎn)物，含有蛋白質(zhì)、脂肪、糖類等有益成分[1]。近年來，隨著國內(nèi)豆制品生產(chǎn)規(guī)模和產(chǎn)量的逐年上升，豆清液的排放隨之增加，因此開展豆清液加工及利用對(duì)于提高豆制品副產(chǎn)物的經(jīng)濟(jì)價(jià)值有重要意義。大豆多肽是大豆蛋白的水解產(chǎn)物，具有降血壓、抗氧化、抗疲勞等優(yōu)點(diǎn)[2-5]，利用豆清液生產(chǎn)多肽可以減少豆清液的浪費(fèi)，同時(shí)也能為企業(yè)增添經(jīng)濟(jì)效益。

目前，國內(nèi)外對(duì)豆清液的開發(fā)研究多采用微生物發(fā)酵法，如制備酵母、釀造白酒、作為豆腐凝固劑等[6]。但由于豆清液微生物發(fā)酵多采用液態(tài)發(fā)酵工藝，發(fā)酵過程難以控制，自動(dòng)化程度低，工藝放大也較困難。為了更好地滿足工業(yè)生產(chǎn)的需要，可以使用酶法水解豆清液，和發(fā)酵法相比，酶法反應(yīng)條件溫和、專一性強(qiáng)、副反應(yīng)少，能較好地保留營養(yǎng)價(jià)值。目前，有研究表明胃蛋白酶水解蛋白(如米糠蛋白、苦蕎球蛋白、芝麻蛋白等)可獲得具有抗氧化性的水解物[7-10]；Zhang等[11-12]利用堿性蛋白酶酶解得到大豆水解液對(duì)DPPH自由基具有較高的清除率，并利用實(shí)驗(yàn)所得抗氧化肽評(píng)估合成肽對(duì)氧化的細(xì)胞保護(hù)作用于人腸道Caco-2細(xì)胞的應(yīng)激反應(yīng)。蔡沙等[13]利用風(fēng)味蛋白酶酶解蠶蛹蛋白，結(jié)果表明水解液的抗氧化效果較好。為提高大豆蛋白資源的利用率，本研究提出利用不同蛋白酶(木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、胃蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶)水解豆清液制備多肽，借助蛋白酶的水解作用有效地提取豆清液中的蛋白質(zhì)，并將其轉(zhuǎn)化為利用效率更高的大豆多肽。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

722型可見分光光度計(jì) 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；VELOCITY 14R臺(tái)式冷凍離心機(jī) Dynamica Scientific Ltd.。

豆清液：由學(xué)校果蔬清潔加工實(shí)驗(yàn)室提供；風(fēng)味蛋白酶：河南萬邦實(shí)業(yè)有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)：Shanghai Chemical Industry Park。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蛋白酶的篩選

取50 mL豆清液，調(diào)節(jié)pH，再加入木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、胃蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶酶解數(shù)小時(shí)，篩選出酶解效果較好的蛋白酶。酶解結(jié)束后取出，于沸水中滅酶10 min，室溫冷卻，以體積比1∶1加入三氯乙酸(TCA)溶液，在4000 r/min條件下離心10 min，收集上清液進(jìn)行測定。

1.2.2 多肽含量的測定

多肽含量的測定參照文獻(xiàn)[14]并稍作改動(dòng)。取1 mL上清液加入4 mL雙縮脲溶液，搖勻，靜置30 min后，在540 nm處測定吸光值，再用牛血清標(biāo)準(zhǔn)蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線算出多肽含量。按公式(1)計(jì)算多肽產(chǎn)率。

(1)

式中：D為多肽產(chǎn)率，%；h1為酶解后多肽含量，mg；h2為酶解前多肽含量，mg。

1.2.3 抗氧化活性測定

將在最優(yōu)條件下酶解的豆清液進(jìn)行冷凍干燥，制得豆清多肽凍干粉，再進(jìn)行DPPH自由基清除率測定，測定方法參考文獻(xiàn)[15]的方法。

1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn)

測定風(fēng)味蛋白酶在不同條件下，即酶用量(0.02，0.04，0.06，0.08，0.10，0.12 g)、酶解溫度(45，50，55，60，65，70 ℃)、初始pH(3.5，4.5，5.5，6.5，7.5)和酶解時(shí)間(1，2，3，4，5 h)對(duì)水解豆清液的影響。

1.2.5 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

在單因素的基礎(chǔ)上，以多肽產(chǎn)率為指標(biāo)應(yīng)用響應(yīng)面分析法中Box-Behnken的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理優(yōu)化出最佳工藝參數(shù)，見表1。

表1 風(fēng)味蛋白酶酶解產(chǎn)豆清多肽的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)Table 1 Response surface experiment for enzymatic hydrolysis of flavourzyme for producing polypeptide from soybean supernatant

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶的篩選

分別采用4種不同蛋白酶酶解豆清液得到多肽(見圖1)，其中菠蘿蛋白酶酶解豆清液多肽產(chǎn)率相對(duì)較低，為44.74%，風(fēng)味蛋白酶和胃蛋白酶的酶解效果較好且相差不多，考慮到胃蛋白酶的成本，選擇風(fēng)味蛋白酶進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 不同蛋白酶酶解制備豆清多肽產(chǎn)率Fig.1 The yield of polypeptide from soybean supernatant prepared by enzymatic hydrolysis of different proteases

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 酶用量對(duì)風(fēng)味蛋白酶酶解產(chǎn)豆清多肽產(chǎn)率的影響

酶用量對(duì)多肽產(chǎn)率的影響見圖2。

圖2 酶用量對(duì)風(fēng)味蛋白酶酶解產(chǎn)豆清多肽產(chǎn)率的影響Fig.2 Effect of enzyme amount on yield of polypeptide from soybean supernatant prepared by enzymatic hydrolysis of flavourzyme

由圖2可知，隨著濃度比的增長，多肽產(chǎn)率先逐漸增大再減小，原因可能是隨著酶用量增多，酶之間出現(xiàn)競爭性抑制或酶自身相互水解，導(dǎo)致酶活力降低。在6個(gè)濃度梯度中，多肽產(chǎn)率最大為47.01%，出現(xiàn)在0.1 g；最小多肽產(chǎn)率為24.57%，出現(xiàn)在0.02 g。選用風(fēng)味蛋白酶水解豆清液的酶用量為0.08，0.10，0.12 g進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化。

2.2.2 溫度對(duì)風(fēng)味蛋白酶酶解產(chǎn)豆清多肽產(chǎn)率的影響

由圖3可知，隨著溫度的增長，多肽產(chǎn)率先逐漸加大達(dá)到峰值再逐漸減小，曲線整體呈現(xiàn)開口向下拋物線趨勢。蛋白酶作為一種蛋白質(zhì)類生物催化劑，受溫度的影響較大，在一定溫度范圍內(nèi)，催化反應(yīng)的速率隨著溫度的上升而上升，但是超過一定溫度酶逐漸失活，水解能力降低，選用酶解溫度為50，55，60 ℃進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化。

圖3 溫度對(duì)風(fēng)味蛋白酶酶解產(chǎn)豆清多肽產(chǎn)率的影響Fig.3 Effect of temperature on yield of polypeptide from soybean supernatant prepared by enzymatic hydrolysis of flavourzyme

2.2.3 pH對(duì)風(fēng)味蛋白酶酶解產(chǎn)豆清多肽產(chǎn)率的影響

由圖4可知，隨著pH值的增長，多肽產(chǎn)率先增大，到達(dá)峰值再逐漸減小。這可能是由于酶解底物的帶電狀態(tài)會(huì)因pH的變化而改變。當(dāng)?shù)孜锸堑鞍踪|(zhì)、肽或氨基酸等兩性電解質(zhì)時(shí)，隨著pH的改變，底物呈現(xiàn)不同的解離狀態(tài)，酶的活力部位往往只能作用于底物的一種解離狀態(tài)，且酶分子的帶電狀態(tài)也會(huì)隨著pH發(fā)生變化，選用初始pH為3.5，4.5，5.5進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化。

圖4 pH對(duì)風(fēng)味蛋白酶酶解產(chǎn)豆清多肽產(chǎn)率的影響Fig.4 Effect of pH value on yield of polypeptide from soybean supernatant prepared by enzymatic hydrolysis of flavourzyme

2.2.4 酶解時(shí)間對(duì)風(fēng)味蛋白酶酶解產(chǎn)豆清多肽產(chǎn)率的影響

由圖5可知，隨著時(shí)間的增長，多肽產(chǎn)率先迅速增加后逐漸變緩。出現(xiàn)這種趨勢可能是因?yàn)殡S著水解的進(jìn)行，底物濃度下降，多肽含量增加，多肽與蛋白質(zhì)出現(xiàn)競爭性抑制作用。而酶活力可能隨著溫度或體系pH的改變而降低，出現(xiàn)水解剩余底物能力減弱，或者不具有水解能力。選用酶解時(shí)間為4，5，6 h進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化。

圖5 酶解時(shí)間對(duì)風(fēng)味蛋白酶酶解產(chǎn)豆清多肽產(chǎn)率的影響Fig.5 Effect of enzymatic hydrolysis time on yield of polypeptide from soybean supernatant prepared by enzymatic hydrolysis of flavourzyme

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

2.3.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表2 風(fēng)味蛋白酶酶解產(chǎn)豆清多肽的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Response surface experiment results of polypeptide from soybean supernatant prepared by enzymatic hydrolysis of flavourzyme

續(xù) 表

2.3.2 模型建立及顯著性分析

利用軟件Design-Expert 8.0.6.1可以得到回歸方程和方差分析，見表3。

表3 風(fēng)味蛋白酶酶解產(chǎn)豆清多肽產(chǎn)率方差分析Table 3 The variance analysis of yield of polypeptide from soybean supernatant prepared by enzymatic hydrolysis of flavourzyme

D=+68.23-2.31A-7.88B-1.47C-0.20D-1.87AB+2.56AC-6.09AD+0.75BC-1.98BD+3.09CD-4.30A2-21.72B2-6.25C2-7.85D2。

由表3可知，該多肽產(chǎn)率模型回歸極顯著(P<0.0001)，失擬項(xiàng)F值(有18.03%的可能性是由于干擾)為2.65意味著相對(duì)于純誤差而言失擬項(xiàng)并不顯著，且R2=97.03%，RAdj2=94.07%，因此可以用來預(yù)測風(fēng)味蛋白酶水解豆清液生產(chǎn)大豆多肽的工藝。各個(gè)因素影響的大小順序?yàn)槊附鉁囟?酶用量>初始pH>酶解時(shí)間。

2.3.3 最佳工藝條件的確定

使用Design-Expert 8.0.6.1軟件，得出風(fēng)味蛋白酶水解豆清液生產(chǎn)大豆多肽的最佳工藝條件為酶用量0.09 g、溫度54.13 ℃、pH 4.33、時(shí)間4.12 h。使用該工藝條件，預(yù)期大豆多肽產(chǎn)率為69.453%。考慮實(shí)際操作，選擇酶用量0.09 g、溫度54 ℃、pH 4.4、時(shí)間4 h。經(jīng)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)得大豆多肽產(chǎn)率為71.10%，與預(yù)測值相比無顯著差異，說明通過Design-Expert 8.0.6.1軟件分析得到的最佳工藝條件是可行的。

2.4 DPPH自由基清除率的測定

由圖6可知，在抗氧化實(shí)驗(yàn)所測定范圍內(nèi)，豆清多肽凍干粉和Vc對(duì)DPPH自由基的清除率均隨著自身濃度的增大而增強(qiáng)，但豆清多肽凍干粉對(duì)DPPH自由基的清除能力要弱于VC。當(dāng)豆清多肽凍干粉的濃度在10 mg/mL時(shí)，對(duì)DPPH自由基的清除率為67.80%，而當(dāng)VC的濃度為0.008 mg/mL時(shí)，對(duì)DPPH自由基的清除率為81.27%，其IC50分別為5.33 mg/mL和0.004 mg/mL。在實(shí)驗(yàn)測定的范圍外，即當(dāng)VC濃度>0.008 mg/mL和豆清多肽凍干粉濃度>10 mg/mL，兩種樣品對(duì)DPPH自由基的清除率還會(huì)繼續(xù)增大并最終達(dá)到100%。研究結(jié)果表明，豆清多肽有望被應(yīng)用到天然抗氧化劑和功能性食品領(lǐng)域，實(shí)現(xiàn)利用價(jià)值。

圖6 豆清多肽凍干粉對(duì)DPPH自由基的清除率Fig.6 The scavenging rates of soybean supernatant polypeptide freeze-dried powder to DPPH free radical

3 結(jié)論

本研究以豆清多肽產(chǎn)率為指標(biāo)，利用響應(yīng)面法優(yōu)化風(fēng)味蛋白酶酶解制備豆清多肽的工藝。結(jié)果表明，最優(yōu)工藝條件為：酶解最優(yōu)條件為酶用量0.09 g、溫度54 ℃、pH 4.4、時(shí)間4 h，在此條件下多肽產(chǎn)率為71.10%；抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明風(fēng)味蛋白酶酶解豆清液制備的豆清多肽具有較好的抗氧化性，可以作為優(yōu)質(zhì)抗氧化肽的良好來源，可為豆清多肽的制備和推廣應(yīng)用提供理論依據(jù)，有利于今后豆清液的再利用。